硫辛酸合成酶在Leprdb/db小鼠肝腎中的表達

彭強，趙英政，閆婷婷，翟曉楠，張旭旭，易憲文，張合喜，徐光翠

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肥胖和糖尿病嚴重威脅人類健康，2016年的一項研究顯示我國肥胖人口數(shù)全球第一， 18歲及以上成年人中糖尿病患病率高達11.6%[1-2]。瘦素受體缺陷的Leprdb/db小鼠由于阻斷了其瘦素信號通路，使食物攝入量增加，產(chǎn)熱量下降，導致小鼠肥胖，其發(fā)病過程與人類的2型糖尿病的發(fā)生過程類似[3]。硫辛酸(lipoic acid)是一種強抗氧化劑，臨床上已用于防治糖尿病周圍神經(jīng)病變。硫辛酸是在線粒體內(nèi)由硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase, LIAS)合成，其作用與硫辛酸合成酶的表達密切相關。目前關于瘦素和硫辛酸合成酶的作用關系還不清楚，Leprdb/db小鼠體內(nèi)LIAS蛋白表達的研究尚未見報道。本實驗通過檢測Leprdb/db小鼠糖脂代謝相關指標及肝、腎中LIAS蛋白的表達，探討阻斷瘦素信號通路導致的小鼠糖脂代謝紊亂是否與LIAS蛋白的表達量相關，為明確硫辛酸在調(diào)控糖脂代謝中的作用機理，探索肥胖和糖尿病的防治新策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級Leprdb/+及Leprdb/db小鼠來自Jackson實驗室(北卡羅來納大學易憲文教授贈送)。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房【SYXK(豫) 2014-0005】，自由攝食(上海斯萊康SPF級小鼠專用飼料)和飲水，室溫20～25℃，相對濕度60%～70%，晝夜明暗交替時間12 h /12 h。所有動物實驗操作將遵守新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物倫理管理條例。

1.1.2 試劑和儀器

總膽固醇試劑盒(南京建成，中國，批號20170708)、甘油三脂試劑盒(南京建成，中國，批號20170708)、高密度脂蛋白試劑盒(南京建成，中國，批號20161229)、低密度脂蛋白試劑盒(南京建成，中國，批號20161228)、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒(南京建成，中國，批號20170719)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒(南京建成，中國，批號20170719)，磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、線粒體分離試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天，中國)，蛋白質(zhì)marker (北京全式金，中國)，兔多抗LIAS抗體(Proteintech，美國)，兔多抗GAPDH抗體(杭州賢至，中國)；強生穩(wěn)豪型血糖儀 (強生，美國)，低溫離心機(Eppendorf，德國，5424R)，電泳儀(北京六一，中國，JY300C)，多功能酶標儀(Thermo，美國，EnSpireTM2300)。

1.2 方法

1.2.1 線粒體的制備

選取10周齡的Leprdb/+及Leprdb/db雄性小鼠各8只，即為Leprdb/+組和Leprdb/db組。禁食8 h后，測量兩組小鼠體重，同時，采用強生穩(wěn)豪型血糖儀測定小鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)。經(jīng)乙醚麻醉，腹主動脈采血后，處死動物，分離肝、腎并稱重。取肝右葉及左腎組織于4%多聚甲醛固定，其余肝、腎組織-80℃保存。取200 mg肝、腎組織，用玻璃勻漿器于冰水浴中勻漿20次。用線粒體分離試劑盒采用差速離心法提取肝、腎組織線粒體。

1.2.2 肝腎組織病理學檢查

組織固定24 h后，酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，封片后光鏡下觀察兩組肝、腎組織病理變化并拍照。

1.2.3 血清生化指標檢測

分離血清，按試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀檢測血清中總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)含量。

1.2.4 Western blot法檢測肝、腎組織線粒體內(nèi)LIAS蛋白的表達

取已制備的線粒體，加入200 μL臨用前添加了苯甲基磺酰氟(PMSF)(終濃度為1 mmol/L)的線粒體裂解液。裂解后的蛋白樣品采用BCA法進行蛋白定量。參照解現(xiàn)星等[4]的方法檢測肝、腎組織線粒體內(nèi)LIAS蛋白。蛋白變性后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。用電轉膜儀轉到PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的封閉液(TBST)室溫封閉2 h，按1∶2000加入LIAS抗體，按1∶1000加入GADPH抗體，4℃ 孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜，按1∶8000的稀釋倍數(shù)加入二抗，37℃孵育2 h，再次用TBST洗滌，用ECL顯色并曝光，采用BandScan分析膠片灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠體重及其臟器系數(shù)比較

與Leprdb/+小鼠比較，Leprdb/db小鼠體重、肝重、肝器系數(shù)及腎重均明顯升高，而腎器系數(shù)降低，差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠體重、肝腎重量及其臟器系數(shù)比較Tab.1 Comparison of body weight, liver, kidney weight and their organ coefficients in the Leprdb/+and Leprdb/dbmice(n=8,

注：*與Leprdb/+組比較，*P<0.05。

Note. Compared with theLeprdb/+mice,*P<0.05.

2.2 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝腎組織病理學觀察

由圖1可見，對照組Leprdb/+小鼠肝、腎組織結構完整，無明顯病理學改變；而Leprdb/db小鼠肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，腎小球肥大，基地膜增厚，系膜區(qū)增寬，系膜細胞和系膜基質(zhì)增多等病理學改變。

2.3 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠生化指標的測定

表2可見，空腹血糖Leprdb/db小鼠明顯高于Leprdb/+小鼠，兩者相比較差異有顯著性(P<0.01)；與Leprdb/+小鼠比較，Leprdb/db小鼠CHO、TG、LDL，ALT均明顯升高差異有顯著性(P<0.05)。

圖1 Leprdb/+和Leprdb/db兩組小鼠肝、腎細胞形態(tài)病理觀察(HE染色,×100)Fig.1 Pathological observation of cellular morphology from liver and kidney tissues in the Leprdb/+and Leprdb/dbmice(HE staining, ×100)

動物組Animalgroups空腹血糖FPG(mmol/L)總膽固醇CHO(mmol/L)甘油三脂TG(mmol/L)高密度脂蛋白HDL(mmol/L)低密度脂蛋白LDL(mmol/L)谷草轉氨酶AST(U/L)谷丙轉氨酶ALT(U/L)Leprdb/+組5.63±1.612.56±0.540.70±0.193.36±0.420.21±0.0324.83±9.2912.66±4.39Leprdb/db組14.42±4.60**4.89±1.29*1.43±0.31*2.91±0.431.35±0.61*25.47±5.7750.20±16.52**

注：與Leprdb/+組比較，*P<0.05；與Leprdb/+組比較，**P<0.01。

Note.Compared with theLeprdb/+mice,*P<0.05. Compared with theLeprdb/+mice,**P<0.01.

2.4 Western blot 法檢測Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝腎線粒體中LIAS蛋白表達

Western blot檢測結果顯示，Leprdb/db小鼠在肝腎線粒體中LIAS蛋白表達量均高于Leprdb/+小鼠，差異均有顯著性(P<0.05)。見圖2、3。

注：*與Leprdb/+組比較，*P<0.05。下圖同。圖2 Western blot法檢測Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝線粒體中LIAS蛋白表達Note. compared with the Leprdb/+ mice. The same in the following FigFig. 2 Expressions of LIAS in mitochondria of Leprdb/+and Leprdb/db mouse liver tissues by western blot analysis

圖3 Western blot 法檢測Leprdb/+和Leprdb/db小鼠腎線粒體中LIAS蛋白表達Fig.3 Expressions of LIAS in mitochondria of Leprdb/+and Leprdb/db mouse renal tissues by western blot analysis

3 討論

隨著生活水平的提高，飲食過剩和運動不足使肥胖成為全球性流行病，而肥胖容易引起胰島素抵抗，導致糖尿病[5]。糖尿病是以慢性高血糖為特征的一種代謝性疾病，其中2 型糖尿病占該病的95%，已成為嚴重威脅人類健康的常見慢性疾病，在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長趨勢。對肥胖、糖尿病及其并發(fā)癥的研究已成為生物醫(yī)學研究的熱點。

Leprdb/db小鼠是leptin受體基因缺陷導致先天肥胖并呈現(xiàn)2 型糖尿病特征的模型動物。該小鼠位于4 號染色體的瘦素受體基因發(fā)生突變，主要表現(xiàn)為下丘腦缺陷，對飽感物質(zhì)(瘦素) 缺乏反應，具有高血糖、高胰島素血癥、糖代謝異常等特征，與人類2 型糖尿病臨床癥狀極為相似，是研究人類2 型糖尿病良好的動物模型[6]。

實驗動物臟器重量和臟器系數(shù)是鑒定動物遺傳質(zhì)量的重要依據(jù)，反應了模型動物的生物學特性及相應臟器的損害[7]。本研究結果顯示，Leprdb/db小鼠體重、肝、肝器系數(shù)及腎重量明顯大于Leprdb/+組小鼠，而腎器系數(shù)小于Leprdb/+組小鼠，與呂晶晶等[9]研究結果一致[8]。2型糖尿病動物模型會出現(xiàn)胰島增生肥大的病理改變，糖尿病腎病是典型的糖尿病并發(fā)癥，也是造成慢性腎功能衰竭的常見原因。本研究發(fā)現(xiàn)Leprdb/db小鼠血清AST明顯升高。AST主要分布在肝細胞漿和肝細胞線粒體中，是反映肝損傷的一個重要指標，它的升高提示肝細胞損傷達到了細胞器水平。Leprdb/db小鼠出現(xiàn)了糖尿病發(fā)展過程中肝、腎的典型病理改變，鏡下可見Leprdb/db小鼠肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，腎小球肥大，基底膜增厚，系膜區(qū)增寬，包括系膜細胞和系膜基質(zhì)增多等形態(tài)學改變。

血糖是評價糖尿病的重要指標，高血糖是由于對胰島素作用的抵抗以及胰島素分泌代償不足造成的。2型糖尿病是一種機體對胰島素抵抗而引起的病變，而胰島素抵抗常引起脂質(zhì)代謝異常。因為胰島素有促進脂蛋白分解的作用，當胰島素抵抗時，富含甘油三酯的脂蛋白在血中堆積，包括乳糜微粒、極低密度脂蛋白、中密度脂蛋白等，導致患者血液中的甘油三酯明顯升高，同時，低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇也會不同程度的升高。脂肪代謝紊亂對糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的作用。本研究結果顯示Leprdb/db小鼠空腹血糖明顯高于Leprdb/+小鼠，Leprdb/db小鼠CHO、TG、LDL均明顯升高，這與文獻報道結果一致[8,10]。

硫辛酸是由線粒體中硫辛酸合成酶 (LIAS)產(chǎn)生的強抗氧化劑，可以清除體內(nèi)多種自由基并能還原其他抗氧化劑，在體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11-13]。由于其在線粒體內(nèi)生成，可通過抗氧化而發(fā)揮保護線粒體作用，同時參與能量代謝，是幾種線粒體酶如丙酮酸脫氫酶復合酶的輔酶，因而硫辛酸合成酶對糖尿病及其慢性并發(fā)癥發(fā)揮重要調(diào)控作用[14]。本研究利用Western blot法檢測Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝腎線粒體中LIAS蛋白表達，發(fā)現(xiàn)Leprdb/db小鼠的肝腎線粒體中LIAS蛋白表達量均高于Leprdb/+小鼠，差異有顯著性，表明LIAS蛋白在Leprdb/db小鼠和Leprdb/+小鼠中有著不同表達，其在瘦素受體缺陷導致的糖脂代謝紊亂中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

綜上，瘦素受體缺陷的Leprdb/db小鼠存在糖脂代謝紊亂，肝、腎細胞病理損傷；Leprdb/db小鼠肝、腎線粒體中LIAS蛋白表達明顯高于Leprdb/+小鼠。提示對LIAS蛋白表達的調(diào)控有望成為防治肥胖和糖尿病的新策略。

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