不同濃度鉀對茶樹幼苗生長及葉片活性氧代謝酶類的影響

鐘秋生，林鄭和，陳常頌，陳志輝，游小妹，單睿陽

(福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015)

鉀元素是植物必需的大量營養(yǎng)元素之一。鉀素參與了茶樹體內(nèi)幾乎所有的生物化學反應(yīng)，對茶樹的生長發(fā)育，對茶葉產(chǎn)量及品質(zhì)等具有十分重要的作用。它是茶樹體多種酶的活化劑，可以促進茶樹光合作用，蛋白質(zhì)的合成以及增強碳水化合物的代謝等功能[1]，對提高茶樹的抗逆和抗病蟲害也有積極作用。我國是一個鉀資源較缺乏的國家，我國鉀鹽資源儲量很少，鉀肥生產(chǎn)僅占世界的0.34%，而消耗量卻占14.7%[2]，有研究發(fā)現(xiàn)我國約有2/3的茶園土壤缺鉀[3]。鉀元素有如此重要的生理功能，土壤鉀素的缺乏已然成為限制我國茶業(yè)發(fā)展的一個極其重要因素。

植物體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除在正常條件下可以達到一定的動態(tài)平衡，但在非正常條件下如逆境脅迫下，這種平衡會被破壞，導致自由基過度積累及膜脂過氧化，細胞代謝失調(diào)，影響植物正常生長[4]。酶促抗氧化體系中重要的氧化酶有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)等；非酶促抗氧化體系重要的有抗壞血酸(ASC)、谷胱甘肽(GSH)等[5]，它們能清除自由基，以減輕逆境因子對植物的傷害，從而使植物維持正常的生理機能。已有研究表明，植物在逆境條件下往往具有較高的保護酶系統(tǒng)，SOD、POD、CAT、GR、APX等逆境條件下互相協(xié)調(diào)，清除植物體內(nèi)ROS，提高植物對脅迫的適應(yīng)性[6]?；钚匝跸到y(tǒng)與植物抗逆性之間有極為密切關(guān)系，因此研究它們的相關(guān)性是非常有必要的。

目前國內(nèi)外鉀素相關(guān)研究主要有鉀缺乏與營養(yǎng)診斷、鉀肥對茶園土壤的改良效應(yīng)、鉀素在茶樹內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)移特性、鉀素對茶樹葉片光合作用和電子傳遞鏈的影響及鉀素在茶葉品質(zhì)成分代謝中發(fā)揮的作用等等[7-10]，但是缺鉀對茶樹幼苗葉片活性氧代謝相關(guān)酶類的影響研究較少。有研究表明，氮磷鉀配施可顯著提高谷氨酰胺合成酶(GS)活性，從而提高氮素的同化速率。隨著施肥量的增加，茶葉中的GS活性呈先上升后下降的趨勢；同時還可以提高茶葉硝酸還原酶(NR)活性，但施肥過量則會抑制其活性；氮、磷、鉀配施對茶葉中谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的活性均有明顯的增強效應(yīng)。春茶的GOT活性，隨著施肥量的增加一直上升[11]；此外有研究表明，硝酸還原酶的活性隨氮、鉀肥使用量的提高而增強。施肥后，第一二輪茶鮮葉的產(chǎn)量與硝酸還原酶活性呈顯著相關(guān)[12]。為了探明單一鉀素對茶樹的生長及葉片幼苗葉片活性氧代謝相關(guān)酶類的影響，本研究以‘瑞香’品種茶樹幼苗為試驗材料，探討不同濃度鉀對茶樹幼苗生長及葉片部分活性氧代謝相關(guān)酶類的影響，以期為缺鉀下茶樹的抗逆性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗在福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所內(nèi)進行，試驗時間為2014～2015年。選生長茁壯，高度較一致的扦插‘瑞香’茶苗 [Camelliasinensis(L.) O. Kuntze] (約10月齡)為試驗材料，盆栽于6 L的裝滿沙的花盆，每盆栽3株，在自然溫、光條件下培養(yǎng)(試驗采用的沙子先用自來水沖洗干凈)。完全營養(yǎng)液參照文獻[13]的配方。其中，1 mmol·L-1K2SO4(K濃度為2000 μmol·L-1)的濃度設(shè)定為正常供鉀濃度，具體參照文獻[14-15]。。完全營養(yǎng)液包含3 mmol·L-1NH4NO3，0.5 mmol·L-1Ca(H2PO4)2，1.0 mmol·L-1K2SO4，0.5 mmol·L-1CaCl2，0.6 mmol·L-1MgSO4，46 μmol·L-1H3BO3，9 μmol·L-1MnSO4，9 μmol·L-1ZnSO4，2 μmol·L-1CuSO4,2.6 μmol·L-1Na2MoO4和30 μmol·L-1Fe-EDTA。幼苗移栽2周后開始施用半營養(yǎng)液(1/2的全營養(yǎng)液)，4周后開始施用全營養(yǎng)液，移栽8周后進行不同濃度的K處理，每個處理30盆，每盆施0、100、400、800、2000 μmol·L-1鉀的營養(yǎng)液。一周3次，每次施約500 mL，處理26周后對相關(guān)參數(shù)進行測定，不同濃度的K處理時間從2014年4月20日開始至10月19日結(jié)束。

1.2 樣品采集與測定

1.2.1 植株干重的測定 植株收獲后，用自來水沖洗干凈，然后分為地上和地下部分，每個處理6個重復(fù)，將鮮樣在105℃下烘30 min，再80℃下烘48 h(至恒重)，然后測定各部分的重量，參考林鄭和的方法[16]。根冠比的計算方法：地下部分除以地上部分干重所得的比值。

1.2.2 樣品制備 對盆栽的茶樹進行不同濃度的鉀素處理完畢后，從各處理取代表性葉片(從上往下數(shù)第2～3片成熟葉)，采后立即用打孔器取圓片(每圓片面積約0.608 cm2)，然后放入液氮迅速冷凍，后轉(zhuǎn)移到-80℃低溫冰箱中貯藏，供活性氧代謝各項指標用。

選取茶樹植株鮮葉(原料標準為一芽二三葉)、嫩莖和根，洗凈后在105℃下烘30 min，再在80℃下烘48 h直至恒重，后進行裝袋密封，低溫保存，用于后續(xù)K含量的測定。K的檢測按照火焰光度法[17]。

1.2.3 抗氧化酶活性測定 取2個圓葉片，放到預(yù)冷的研缽中，加入2 mL提取液緩沖液[50 mM KH2PO4-KOH(pH 7.5)，1 mM EDTA，0.5%(w/v)曲拉通 X-100，5%(w/v)不溶性PVPP]，在冰浴中研磨成勻漿，勻漿用4℃離心機15 000 rpm離心10 min，上清液用于酶活性測定[18]?？箟难徇^氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)測定按Chen等[19]與林鄭和[20]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用DPS進行差異顯著性統(tǒng)計分析(LSD法，P<0.05)。各試驗均重復(fù)6次(不同植株為1重復(fù))。采用SigmaPlot 10.0軟件進行做圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鉀處理對茶樹幼苗生長的影響

不同濃度鉀處理對茶樹幼苗生長的影響結(jié)果見圖1。由圖所示，茶苗根系干重隨著供鉀濃度的增加而增大(圖1-A)，地上部干重也是隨著供鉀濃度的增加而增大(圖1-B)；當供鉀濃度增加達到800 μmol·L-1時，根系干重和莖葉干重不再有顯著變化；鉀濃度為0時，由圖2可知，此時根冠比最大，鉀濃度為100 μmol·L-1的處理次之；后逐漸降低，在鉀濃度為400 μmol·L-1的處理，根冠比最小(圖2)。

2.2 不同濃度鉀處理對茶樹幼苗葉片總鉀含量的影響

圖1 不同濃度鉀處理對茶樹幼苗根系干重和莖葉干重的影響Fig. 1 Effect of K supply on dry weights of roots and shoots of tea plant

圖2 不同濃度鉀處理對茶樹幼苗根冠比的影響Fig.2 Effect of K supply on ratio of root/shoot dry weight of tea plant

如圖3所示，隨著供鉀濃度的增加，茶樹葉、莖、根的鉀含量總體上均呈增加的趨勢。葉片部位的鉀含量在處理濃度介于0～800 μmol·L-1之間時呈顯著增加的變化趨勢，在達到800 μmol·L-1時增加不顯著；根部鉀含量從100 μmol·L-1增加到400 μmol·L-1時增幅不顯著，而在其他各供鉀濃度之間均達到了顯著差異水平；莖部鉀含量在供鉀濃度從0增加到100 μmol·L-1時沒有顯著增加，后隨著供鉀濃度的增加，顯著增加，在濃度達到400 μmol·L-1時仍然呈增加趨勢，但未達顯著水平。

2.3 缺鉀對茶樹幼苗葉片活性氧代謝相關(guān)酶類的影響

圖3 不同濃度鉀處理對茶樹根莖葉鉀含量的影響Fig.3 Effects of K supply on K contents in tea roots, stems and leaves

由圖4可知，過氧化氫酶(CAT)活性總體上隨著供鉀濃度的增加而增大，但在低鉀濃度處理(0、100、400 μmol·L-1)各葉片CAT酶活性增加未達到顯著水平。在供鉀濃度達到800 μmol·L-1后顯著增加，在供鉀濃度達到2000 μmol·L-1時略微下降，但未達顯著差異水平。

圖4 不同濃度鉀處理對茶樹葉片CAT活性的影響Fig.4 Effect of K supply on CAT activity注：每一點為6次重復(fù)的平均值±標準誤，同一點標準誤上(下)字母不同者差異顯著(P<0.05)。下同。

MDAR酶活性隨著供鉀濃度的增加總體上呈增加趨勢，在供鉀濃度達到800 μmol·L-1后變化不顯著，正常供鉀濃度(2000 μmol·L-1)與低鉀處理葉片(0、100、400 μmol·L-1)的MDAR酶活性達顯著水平(圖5-A)；DHAR酶活性在供鉀濃度為0時最低，但與其他各處理未達到顯著差異(圖5-B)；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性隨著供鉀濃度的提高，其活性總體呈上升趨勢。其中，在低鉀處理時(供鉀濃度分別為0、100 μmol·L-1)，與供鉀濃度(800、2000 μmol·L-1)均產(chǎn)生顯著差異。供鉀濃度400 μmol·L-1與各處理間差異均不顯著(圖5-C)。

圖5 不同濃度鉀處理對茶樹葉片MDAR、DHAR與APX含量的影響Fig.5 Effects of K supply on activities of MDAR, DHAR and APX

2.4 葉片鉀含量與葉片活性氧代謝相關(guān)酶含量的相關(guān)性分析

通過對葉片鉀含量與各活性酶類的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(見圖6)，葉片鉀含量與過氧化氫酶(CAT)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)均呈正的高度線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(R2)分別達到了0.9146和0.9347。這兩種酶的活性均隨著葉片鉀含量的增加而增加。線性方程：YCAT=5.735X+3.46，R2=0.9146；YDHAR=21.026X-18.5468，R2=0.9347。

圖6 葉片鉀含量與葉片過氧化氫酶、脫氫抗壞血酸還原酶相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between leaf K and CAT and DHAR activities

3 討論

早期研究表明，茶園施鉀能顯著地提高綠茶、紅茶、烏龍茶的產(chǎn)量[21-23]；施鉀可使幼齡茶樹的生物產(chǎn)量比對照提高17.5%～47.9%，平均為28.8%[3]；茶園在增施鉀肥后，春茶的產(chǎn)量得到顯著提高，尤其是施用硫酸鉀，增產(chǎn)效果比氯化鉀更加明顯[24]?？梢?，鉀素對茶園產(chǎn)量的提高具有極其重要的作用。茶樹缺鉀會抑制生長，會減少根、莖葉的生物量，提高根冠比，這在小麥、棉花、大麥、玉米、兵豆等[25-28]作物上都得到了相似的結(jié)果。通過本研究也發(fā)現(xiàn)，茶樹幼苗在低鉀處理時(供鉀濃度為0、100 μmol·L-1時)，生長受到了明顯抑制，茶樹幼苗在缺鉀條件下減少了根、莖葉的含量，但同時增加了根冠比。在供鉀濃度分別為0、100 μmol·L-1時，茶樹成熟葉片鉀含量分別為5.26 mg·g-1、5.91 mg·g-1，此時發(fā)現(xiàn)茶樹幼苗根系干重、莖葉干重等降低顯著，嚴重影響茶樹的正常生長。后隨著供鉀濃度的增加，葉片鉀含量顯著增加，在處理達到800 μmol·L-1時增加不再顯著。

植物體內(nèi)清除H2O2、MDA等并不完全由CAT、POD、SOD等進行，另外還有一套完整的防御系統(tǒng)即非酶促抗氧化體系。其中抗壞血酸——谷胱甘肽(ASC-GSH)循環(huán)在清除活性氧過程中發(fā)揮著極其重要的作用[39]?？箟难徇^氧化酶(APX)是葉綠體中清除H2O2的重要酶，以抗壞血酸(AsA)為底物將H2O2還原成H2O，同時生成單脫氫抗壞血酸(MDHA)和脫氫抗壞血酸(DHA)，單脫氫抗壞血酸和脫氫抗壞血酸在單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)作用下再生成抗壞血酸(AsA)。本研究表明，茶樹在缺鉀下(0 μmol·L-1)，APX是顯著低于其他處理的，但同時發(fā)現(xiàn)，茶樹葉片APX活性一直高于DHAR活性，說明APX氧化AsA的活性比DHAR再生AsA的活性強，可見，APX仍然對H2O2過多的累積具有積極作用，APX是清除H2O2的重要酶。推測缺鉀條件下影響茶樹正常代謝酶的合成，如本研究的APX及DHAR等。已有研究表明，鉀素可引起大豆等葉片相關(guān)保護酶活性的提升[40-41]；可提高玉米子粒ADPG焦磷酸化酶和淀粉合成酶活性[42]；在一定的施用鉀肥范圍內(nèi)，增加鉀肥施用量，可提高小麥葉片的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性[43]。本研究也發(fā)現(xiàn)，茶樹在缺鉀(0 μmol·L-1)脅迫條件下會顯著降低CAT、APX、MDAR等的活性，DHAR也是在缺鉀的條件下表現(xiàn)出降低的規(guī)律，但未達顯著水平。推測這與不同植物種類對低鉀脅迫的適應(yīng)性和耐受性差異所致?？傊?，當供鉀濃度為0時會影響茶樹正常生長，同時顯著降低茶樹葉片CAT、APX、MDAR等的活性，缺鉀條件下影響茶樹正常代謝酶類的合成。

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