缺磷對茶樹磷吸收及miR399a表達(dá)量的影響

陳志輝，林鄭和，游小妹，鐘秋生，單睿陽，陳常頌

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

磷素缺乏是我國及世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響作物產(chǎn)量的一個(gè)限制因子。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)今全世界的耕地中約有43%缺磷[1]，而我國約有2/3的耕地嚴(yán)重缺磷[2]。磷元素的缺乏可導(dǎo)致植物幼芽和根部生長緩慢、葉小、分枝減少、植株矮小、花果少等癥狀[2]。在缺磷條件下，植物會(huì)形成一種應(yīng)對機(jī)制，以提高磷的利用率[3]，某些microRNA(miRNA)基因(miR399、miR827等)在這其中起重要作用[4-6]。miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA[7]，其前體具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)[8-9]，長度約為20～23 nt[10]。miRNA 作為基因表達(dá)中的一類負(fù)調(diào)控子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平上通過與靶mRNA結(jié)合，介導(dǎo)靶mRNA 切割降解或抑制翻譯來調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)[8,11-12]。許多植物的miRNA 成熟序列呈現(xiàn)高度保守并出現(xiàn)獨(dú)特的表達(dá)時(shí)序性、組織及發(fā)育特異性或逆境特異性。在植物新陳代謝、組織生長、器官發(fā)育及分化、細(xì)胞程序性凋亡中起重要作用[13-14]。miRNA 還參與植物生物及非生物逆境脅迫過程，不同的miRNA 對不同逆境脅迫發(fā)生響應(yīng)，并證實(shí)某些miRNA在植物感受逆境脅迫并產(chǎn)生適應(yīng)性的過程中發(fā)揮重要作用[15]。

植物對磷的吸收利用過程極其復(fù)雜[16-18]，目前植物中大量關(guān)于低磷脅迫誘導(dǎo)基因的研究(包括miRNA基因的表達(dá)和調(diào)控)在一定程度上揭示了植物低磷響應(yīng)機(jī)制[19-20]。有研究表明，低磷脅迫下擬南芥基因組中有6個(gè)miR399受誘導(dǎo)表達(dá)，分別是miR399a-f[21]，在擬南芥中超表達(dá)miR399成員造成磷吸收過量而出現(xiàn)中毒表型，現(xiàn)已證明miR399家族是一類與植物耐低磷脅迫密切相關(guān)的小RNA家族[22-23]。水稻、大麥等植物中有關(guān)miR399參與調(diào)控磷元素的吸收利用的相關(guān)報(bào)道較多[5,24-25]。雖然在多種植物中都報(bào)道了低磷脅迫誘導(dǎo)miR399的表達(dá)及其調(diào)控路徑[3,18]，但在茶樹中有關(guān)磷吸收與miR399表達(dá)和調(diào)控機(jī)制的相關(guān)報(bào)道仍未見到，到目前為止還無法確定茶樹基因組中miR399家族有多少個(gè)成員，在查閱的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)僅有一篇報(bào)道茶樹中存在miR399a和miR399b[26]。通過對比，發(fā)現(xiàn)茶樹中miR399a和miR399b都為21個(gè)堿基，只有3′端最后一個(gè)堿基差別，而miR399a與其他物種中miR399成員的同源性更高。鑒于此，本研究以茶樹幼苗為試驗(yàn)材料，通過不同磷濃度脅迫處理，檢測茶樹對磷素的吸收利用情況以及miR399a在缺磷條件下的響應(yīng)狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的培養(yǎng)與取樣

試驗(yàn)于2017年在福建省農(nóng)科院院部大樓進(jìn)行。選生長一致的10月齡的扦插‘瑞香’茶苗為試驗(yàn)材料，盆栽于6 L的裝滿沙的花盆，每盆栽3株，于自然溫、光條件下培養(yǎng)。營養(yǎng)液參考文獻(xiàn)[27-28]，完全營養(yǎng)液包含1 mmol·L-1(NH4)2SO4，1 mmol·L-1NH4H2PO4，2 mmol·L-1KNO3，0.6 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.5 mmol·L-1CaCl2，30 μmol·L-1EDTA·Na2Fe，46 μmol·L-1H3BO3，9 μmol·L-1MnSO4·H2O，9 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，2 μmol·L-1CuSO4·5H2O，2.6 μmol·L-1Na2MoO4，0.035 mmol·L-1A12(SO4)3·18H2O。移栽后8周進(jìn)行缺磷處理，每處理重復(fù)6次，每盆施含3000 μmol·L-1、1000 μmol ·L-1、100 μmol·L-1、10 μmol·L-1濃度磷的營養(yǎng)液約500 mL，每周3次，處理15周后采集根、葉進(jìn)行分析。

1.2 磷含量檢測

采用鉬銻抗比色法測定，參照《植物生理學(xué)測試技術(shù)》[29]。

1.3 Stem-loop RT-PCR檢測miRNA的表達(dá)量

采用stem-loop RT-PCR的方法檢測miRNAs的表達(dá)量[30]。按照Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)試劑盒的說明書提取茶樹不同組織的總RNA，取樣部位為新葉和根，新葉為倒數(shù)第二葉的完全葉，根為有活力的白色根，3次重復(fù)。提取總RNA后，檢測RNA濃度和質(zhì)量，檢測試劑盒為Agilent 2100 RNA 6000 Nano kit?？俁NA反轉(zhuǎn)錄用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix kit(TRANS，AT301)，反轉(zhuǎn)錄引物為基因上的特定引物stem-loop RT prime(MIR399a-St-RT)或者作為對照的內(nèi)源基因引物U6-R。反應(yīng)體系為：50 ng total RNA，0.5 μM stem-loop RT primer或U6-R primer，2×TS Reaction Mix 2.5 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 0.25 μL，加RNase-free water到5 μL。把這5 μL反應(yīng)混合物放在ABI 9700 thermocycler (Applied Biosystems，http://www.appliedbiosystems.com/)PCR儀上：16℃ 15 min，42℃ 50 min，70℃ 15 min，降到4℃，反應(yīng)完畢。以上所有反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)都3次重復(fù)。Real-time PCR是在ABI PRISM 7500 PCR儀上進(jìn)行(Applied Biosystems)。25 μL PCR體系包含5 μL RT product，forward primer和reverse primer各0.4 μM，0.5 μL Rox Reference Dye II 和1×SYBRPremixEXTaq(Takara)，加ddH2O到25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 s，然后是95℃ 5 s和60℃ 34 s 共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析按照以下程序：95℃ 15 s、60℃ 20 s和95℃ 15 s。所有反應(yīng)數(shù)據(jù)都保存在 ABI PRISM 7500 sequence detection system上，并按說明書分析或?qū)С龇治?。以上所有引物序列見?。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脅迫處理對茶樹不同組織磷含量的影響

在4種磷濃度(3000、1000、100、10 μmol·L-1)下脅迫處理15周后，檢測茶樹根、新葉(從上往下數(shù)第二葉)、老葉(從上往下數(shù)第8葉)的磷含量，見圖1。

圖1 不同磷濃度脅迫下，茶樹根、新葉、老葉中的磷含量Fig.1 phosphorus contents in roots, young shoots and old leaves of tea plants under phosphorus stresses

分析圖1發(fā)現(xiàn)，不同磷濃度處理下，根、新葉、老葉中磷含量都隨著處理濃度的下降而降低，其中老葉中磷含量變化最顯著。

在磷肥過量的條件下(3000 μmol·L-1)，老葉中磷含量最高，其次是根，然后是新葉，根和新葉磷含量接近，而老葉磷含量是根和新葉的兩倍多，說明茶樹在磷肥過量的環(huán)境中生長時(shí)，把吸收的過量磷元素存儲(chǔ)在老葉中。

在正常的施肥條件下(1000 μmol·L-1)，根中磷含量最高，依次是新葉和老葉，而根和新葉含量相當(dāng)，其中老葉磷含量比在過量磷肥條件下顯著下降，約為新葉的一半。從老葉的磷含量比新葉低，說明在正常的磷肥條件下，老葉中的磷元素會(huì)轉(zhuǎn)移到其它更需要磷營養(yǎng)的新生組織中，重復(fù)利用磷元素，提高利用效率，保障植物的生長發(fā)育。

在缺磷條件下(100 μmol·L-1、10 μmol·L-1)，新葉磷含量最高，根和老葉的磷含量都急劇下降，但根的磷含量仍顯著高于老葉。在4種磷濃度處理中，新葉是3個(gè)部位中磷濃度變化最小的器官，說明茶樹在生長過程中出現(xiàn)缺磷狀況時(shí)，首先保證新生組織等重要部位磷元素的供應(yīng)，最大限度的減少非重要器官的磷含量，以維持基本生存需求。

2.2 磷脅迫茶樹總RNA提取與質(zhì)量檢測

提取正常(1000 μmol L-1)和低磷(10 μmol L-1)2種處理茶樹的新葉與根的總RNA，并檢測RNA濃度和質(zhì)量，從RNA電泳圖(圖2、圖3)可以直觀地看出每個(gè)RNA樣品的質(zhì)量。而RIN值(RIN=RNA integrity number，即RNA分子完整數(shù)，從0～10，直接反應(yīng)了RNA質(zhì)量的好壞，此數(shù)值越大表明RNA質(zhì)量越好越完整)也表明提取的總RNA質(zhì)量較好，絕大部分在8左右，僅有一個(gè)為6.6，都能滿足反轉(zhuǎn)錄需求。從每個(gè)樣品的濃度和體積，得出樣品的RNA總量(表1)，分析表1發(fā)現(xiàn)葉片提取的RNA總量比根高出較多，其中8號(hào)和11號(hào)的根部RNA總量僅有1.79 μg和2.77 μg，基本滿足反轉(zhuǎn)錄要求。從RNA總量可以判斷葉片基因表達(dá)比根豐富。

圖2 電泳檢測磷脅迫處理茶樹提取的總RNAFig.2 Electrophoresis of total RNA extracted from tea plants under phosphorus stresses注：1～3號(hào)樣為低磷脅迫(10μmol L-1)的茶樹葉片(3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以下相同)，4～6為正常磷濃度處理(1000 μmol L-1)的茶樹葉片，7～9為低磷脅迫的根，10～12為正常磷濃度處理的根。下同。

2.3 磷脅迫對茶樹miR399a表達(dá)的影響

試驗(yàn)采用Stem-loop RT-PCR的方法檢測miR399a的表達(dá)量[30]。反轉(zhuǎn)錄引物的徑環(huán)序列為 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3′，3′端加上與miR399a成熟序列5′-UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG-3′的3′端互補(bǔ)的6個(gè)堿基5′-CAGGGC-3′，形成反轉(zhuǎn)錄引物MIR399a-St-RT：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGGGC-3′。熒光定量PCR的正向引物取miR399a成熟序列的5′端15個(gè)堿基，然后在5′端上加上4個(gè)堿基5′-CGGC-3′，獲得正向引物MIR399a -F：5′-CGGCTGCCAAAGGAGAGTT-3′。反向引物為反轉(zhuǎn)錄引物徑環(huán)序列上的一段堿基，MIRNA-R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。熒光定量PCR的內(nèi)參引物為U6-F和U6-R。以上引物序列見表2。

圖3 磷脅迫處理茶樹總RNA電泳檢測Fig.3 Electrophoretic detection of total RNA from tea plants under phosphorus stresses

表1 磷脅迫處理茶樹提取RNA的濃度、總量及RIN值

通過熒光定量PCR方法，檢測正常和低磷脅迫下葉片和根中miR399a的表達(dá)量，了解磷脅迫對茶樹miR399a表達(dá)量的影響，見圖4。

分析圖4發(fā)現(xiàn)，茶樹在低磷脅迫下，miR399a的表達(dá)量在葉片和根中都顯著提高，其中低磷脅迫的葉片比正常磷供應(yīng)的葉片表達(dá)量提高約2.77倍，而低磷脅迫的根比正常磷處理的根表達(dá)量提高約3.82倍。說明茶樹在低磷環(huán)境中，能夠誘導(dǎo)miR399a提高表達(dá)量。已知在擬南芥和水稻等植物中，miR399表達(dá)量提高有助于植物吸收利用土壤中的磷，而過量表達(dá)miR399甚至引起植物磷吸收過量而造成磷中毒現(xiàn)象，以上結(jié)果說明miR399在茶樹磷吸收中的功能與其它植物相似。已有研究發(fā)現(xiàn)miR399是通過抑制靶基因來實(shí)現(xiàn)它的調(diào)控功能，茶樹中是否存在其它植物同源的靶基因，還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。下一步將開展miRNA與mRNA表達(dá)譜測序，分析低磷脅迫中茶樹miR399的調(diào)控路徑。

表2 引物序列

圖4 正常和低磷脅迫下miR399a在葉和根中的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expressions of miR399a in leaves and roots under normal and low phosphorus supplies

3 討論

已有文獻(xiàn)中有關(guān)植物體內(nèi)磷元素從衰老器官轉(zhuǎn)運(yùn)到新生器官，實(shí)現(xiàn)磷元素高效利用的研究報(bào)道較多，但是茶樹中卻鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)在不同磷濃度脅迫處理下，茶樹不同器官對磷元素的吸收利用各不相同，其中在缺磷或者正常磷濃度條件下，茶樹中老葉部位的磷元素都會(huì)重新轉(zhuǎn)運(yùn)到新生組織等重要部位，實(shí)現(xiàn)磷元素的再次利用，但在過量磷濃度條件下，茶樹會(huì)把過量的磷元素儲(chǔ)存于老葉中，避免新生組織出現(xiàn)磷中毒，維持體內(nèi)磷元素的平衡。此研究結(jié)果有助于充實(shí)茶樹對磷元素吸收利用的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)茶樹在缺磷條件下，引起miR399a表達(dá)量的提高，這與其它植物的研究結(jié)果相一致[5-6]。大量研究都發(fā)現(xiàn)植物在低磷條件下，miR399受環(huán)境中磷酸鹽水平強(qiáng)烈誘導(dǎo)，表達(dá)量提高，其靶基因PHO2(UBC24)的mRNA豐度下降，而恢復(fù)供磷時(shí)miR399又急劇下降，恢復(fù)正常表達(dá)水平[31-32]。miR399與靶基因PHO2(UBC24)的mRNA水平在正常和低磷脅迫時(shí)均存在著一個(gè)倒置的關(guān)系，低磷脅迫下，miR399通過與PHO2(UBC24)-mRNA的3′-UTR結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對其mRNA的降解或抑制其翻譯，PHO2(UBC24)蛋白表達(dá)量的下調(diào)能夠促進(jìn)植物根部的生長、提高磷高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)(如AtPT1)[33]，從而提高對磷的吸收利用以應(yīng)對磷素缺乏[23]。高磷環(huán)境下，miR399 的表達(dá)卻受到抑制，根部 PHO2(UBC24)基因的表達(dá)量增加，抑制過量無機(jī)磷進(jìn)入植物體內(nèi)，使其免于磷中毒。有研究表明，PHO2(UBC24)的突變體(pho2)具有在莖和葉中積累磷的功能[17]。總之，miR399在保持植株體內(nèi)磷的平衡和穩(wěn)定方面具有重要的作用[5,34-37]。有研究發(fā)現(xiàn)除miR399外，還存在其他的miRNAs基因參與磷脅迫響應(yīng)。擬南芥在缺磷條件下還誘導(dǎo)miR778、miR827表達(dá)，抑制miR398的表達(dá)[38]，其中miR827的靶基因是E3連接酶NLA(Atlg0260)，NLA參與植物花青素合成，缺磷條件下miR827會(huì)抑制NLA表達(dá)。另外大豆在缺磷脅迫下miR159、miR894、miR1507、miR1509等基因表達(dá)量上調(diào)，而miR165/166、miR398、miR1450、miR1511等表達(dá)量下調(diào)[39]。

雖然其它植物中有關(guān)miR399通過抑制靶基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物對磷元素吸收利用的報(bào)道較多，但在茶樹中沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。miR399在茶樹中是否存在同源的靶基因PHO2(UBC24)，以及靶基因PHO2(UBC24)如何調(diào)控下游的磷轉(zhuǎn)運(yùn)子基因PT1的表達(dá)，都需要進(jìn)一步的深入研究。后續(xù)研究將檢測不同磷濃度脅迫下mRNA和miRNA的表達(dá)譜，獲得與磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因，重點(diǎn)研究miRNAs與靶基因及下游基因的表達(dá)調(diào)控模式，從而了解茶樹在磷脅迫后不同基因的應(yīng)急反應(yīng)，獲得miRNAs在磷脅迫反應(yīng)中的調(diào)控路徑，為探明茶樹磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理提供依據(jù)。

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