固定化單寧酶澄清茶湯工藝條件的研究

饒建平

(福建省飲料用植物提取加工企業(yè)重點實驗室/大閩食品(漳州)有限公司，福建 漳州 363000)

茶葉具有降血壓、降血脂、降血糖、抗癌、抗氧化、抗衰老、抗病毒等多種保健功效[1-2]，是世界三大飲料之一，已成為全球最受歡迎的飲品，各種純茶及名優(yōu)茶飲料的需求量不斷增大。而冷后渾一直是茶飲料工業(yè)化(速溶茶、茶濃縮液等)生產(chǎn)中的一個難題，猶待解決。冷后渾，又名茶乳酪，是指茶湯冷卻后產(chǎn)生的渾濁現(xiàn)象，形成于茶飲料、速溶茶、茶濃縮汁的加工或貯藏過程中，進一步促使茶湯沉淀的發(fā)生和風味品質(zhì)的下降。研究表明，茶湯沉淀(茶乳酪)是由多種化學成分通過氫鍵、結(jié)合鍵或疏水作用等絡合產(chǎn)生的，主要作用成分為茶多酚、咖啡堿、蛋白質(zhì)和金屬離子[3-5]，其解決措施主要有物理沉降法、堿轉(zhuǎn)溶、酶調(diào)控法等[6-7]。然而，這些方法都有一定的弊端，或改變茶汁原有的風味，或生產(chǎn)成本偏高。

酶調(diào)控技術可視為茶湯沉淀解決的常用措施。單寧酶能切斷單寧中的酯鍵，釋放的沒食子酸陰離子能競爭咖啡堿，形成分子量較小的水溶性物質(zhì)，使茶湯的澄清度增加，改善速溶茶的品質(zhì)[8-10]。而價格昂貴、使用壽命短則成為限制單寧酶在茶湯沉淀中應用的瓶頸，固定化酶技術可有效的解決這一瓶頸。本文以高品質(zhì)綠茶(龍井)為原料，采用固定化單寧酶對茶湯進行酶解澄清研究，采用正交試驗對固定化單寧酶澄清茶湯工藝條件進行優(yōu)化，以期找到最優(yōu)的固定化單寧酶澄清茶湯工藝條件，為固定化單寧酶在茶飲料工業(yè)化生產(chǎn)的進一步應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

單寧酶：奎斯特公司；綠茶(龍井)：浙江三明茶葉有限公司；殼聚糖：濟南海得貝海洋生物工程有限公司；單寧、乙醇、氫氧化鈉、硫酸銨、鹽酸、檸檬酸、戊二醛均為分析純。

1.2 儀器與設備

752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；Centrifuge TDL-5型離心機：上海安亭科學儀器廠；穗凌超級恒溫器：上海申生科技有限公司；超聲波藥品處理器：濟寧金百特電子有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 固定化單寧酶的制備 固定化載體殼聚糖參考陳盛[11]的方法進行制備，取固定化載體1 g，加入單寧酶溶液(200 U·g-1)5 mL，超聲波室溫Ⅰ波段強檔振蕩30 min，9℃下保溫2 h，離心收集沉淀，貯存在冰箱(0～9℃)中備用。

1.3.2 酶活力的測定 稱取固定化酶0.1 g按照參考文獻[12]測定活力。

1.3.3 固定化單寧酶澄清茶湯工藝的單因素試驗 將0.5 g固定化單寧酶置于茶湯中，將pH值控制在茶湯自然pH 4.7～5.0之間，保溫處理一定時間，再將處理前后的茶湯同時置于5℃下平衡l5 min，然后在640 nm下測定茶湯的吸光度[9]，計算其澄清度，公式如下：

以茶湯澄清度為評價指標，設固定溫度30℃、時間20 min，考察酶用量(0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)對茶湯澄清度的影響；以選取最優(yōu)的酶用量和時間20 min為固定因素，溫度(20、30、40、50、60℃)為變量考察溫度對固定化單寧酶改善茶湯澄清度的影響；以選取最優(yōu)的酶用量和溫度為固定因素，考察時間(20、50、80、110、140 min)對固定化單寧酶改善茶湯澄清度的影響，上述單因素試驗確定最優(yōu)的固定化單寧酶與茶湯澄清度的互作參數(shù)。

1.3.4 正交試驗 單因素試驗基礎上，根據(jù)L9(33)正交實驗方案研究酶用量(A)、溫度(B)、時間(C)等參數(shù)對固定化單寧酶提取茶湯澄清度的影響，試驗因素和水平設計見表1。

表1 L9(33)各因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1為時間20 min、溫度30℃條件下不同酶用量綠茶茶湯的澄清度變化。結(jié)果可見，酶用量0.5%～1.5%之間時，茶湯澄清度急劇增加，酶用量大于1.5%時茶湯澄清度基本未見顯著性差異變化，表明1.5%添加量可作為最佳的酶用量。以酶用量1.5%、時間20 min為固定條件進一步考察不同溫度下固定化單寧酶對茶湯澄清度的影響，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，溫度小于40℃時，呈濃度依賴效應，隨著溫度的增加澄清度明顯增加；溫度50～60℃時，茶湯澄清度反而降低，這與反應溫度過高破壞固定化單寧酶的活性有關，從而選取40℃作為最佳反應溫度。以酶用量1.5%、溫度40℃為反應條件，考察時間因素對固定化單寧酶改變茶湯澄清度的影響，與酶用量和溫度的變化趨勢相同，短時間內(nèi)茶湯的澄清度變化明顯增加，至50 min后基本未見變化，因此，選取50 min作為固定化單寧酶對茶湯的作用時間。

圖1 酶用量對茶湯澄清度的影響Fig.1 Effects of enzyme concentration on solution clarification of tea extraction

2.2 正交實驗優(yōu)化固定化單寧酶澄清茶湯工藝條件

單因素試驗基礎上，通過正交試驗評價優(yōu)化了固定化單寧酶不同因素作用下澄清茶湯的工藝條件，結(jié)果見表2。直觀分析可知，各因素對固定化單寧酶澄清茶湯影響的主次序為B>A>C，溫度為主要的影響因素，其優(yōu)水平為A2B2C1。正交試驗方差分析表明，酶用量、溫度、時間等因素皆可顯著影響固定化單寧酶對茶湯的澄清作用，其中溫度呈極顯著影響(表3)。進一步通過因素不同水平間的差異顯著性SSR分析可知(見表4)，酶用量不同處理間皆存在差異顯著性(p<0.05)，低劑量(酶用量0.5%)與高劑量間具有極顯著性差異(p<0.01)，以酶用量1.5%效果最好；溫度因素不同處理間見極顯著性差異，表明該因素影響最大，以40℃效果最佳；時間因素的影響較小，不同處理之間未見極顯著性差異，從生產(chǎn)成本及效率方面考慮可確立20 min為最佳作用時間。由此，獲得固定化單寧酶澄清茶湯的最優(yōu)水平組合為B2A2C1，即酶用量1.5%、溫度40℃、時間20 min，此工藝條件下，固定化單寧酶作用后茶湯可顯著澄清。

圖2 溫度對固定化單寧酶提高茶湯澄清度的影響Fig.2 Effects of temperature on immobilized tannase increasing the solution clarification of tea extraction

圖3 時間對固定化單寧酶提高茶湯澄清度的影響Fig.3 Effects of time on immobilized tannase increasing the solution clarification of tea extraction

表2 正交試驗L9(33)結(jié)果

表3 正交試驗L9(33)方差分析

3 結(jié)論與討論

冷后渾(茶湯沉淀)一直是茶飲料及速溶茶生產(chǎn)過程中難以解決的問題，解決途徑主要有原料控制、工藝參數(shù)(堿轉(zhuǎn)溶、冷卻沉降)、酶調(diào)控等技術，尤以酶技術被視為生產(chǎn)上主要的使用方法。常用來處理的酶類包括單寧酶、果膠酶、纖維素酶及蛋白酶等[8-10, 13-14]。本文以綠茶(龍井)為原料，采用固定化單寧酶來澄清茶湯，通過采用單因素試驗、正交試驗及SSR檢驗分析，獲得固定化單寧酶澄清茶湯最佳工藝條件為酶用量1.5%、溫度40℃、時間20 min，茶湯澄清度極顯著改善。單寧酶可降解茶葉中的酯型兒茶素組分，通過斷裂沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚鍵，形成分子量較小的短鏈物質(zhì)，從而改善速溶茶粉及茶飲料的澄清度和穩(wěn)定性[10, 15-16]，在茶葉深加工領域已引起廣泛關注。然而，限于酶活性較低、穩(wěn)定性差、成本高等因素，其應用仍待進一步開展。

表4 因素水平間差異顯著性的SSR檢驗

固定化酶技術是20世紀60年代發(fā)展起來的一項生物工程技術。酶的固定方法主要有吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法以及不同方法的協(xié)同使用，從而實現(xiàn)酶反應工業(yè)化、連續(xù)化，提高效率、降低生產(chǎn)成本[17]。Su等采用交聯(lián)-包埋-交聯(lián)法固定化單寧酶，研究發(fā)現(xiàn)固定化單寧酶的活性回收率可達76.6%，儲藏42 d后活性保留量為72.5%，30次重復使用后固定化單寧酶的殘留活性為86.9%，顯示出較好的儲藏穩(wěn)定性和重復使用性[18]。蘇二正等通過分析比較海藻酸鈉和殼聚糖兩種載體及不同固定化方法對單寧酶和β-葡糖糖苷酶的固定化效果，結(jié)果表明以海藻酸鈉為載體，采用交聯(lián)-包埋-交聯(lián)固定化法的效果最佳[19-20]。本文從生產(chǎn)實際出發(fā)，以殼聚糖為載體開展了單寧酶的固定化制備，更加符合工業(yè)化發(fā)展的應用，結(jié)果表明工藝簡單可行、應用效果佳，對茶湯具有良好的澄清效果，在速溶茶產(chǎn)業(yè)及茶飲料領域具有積極的應用意義。

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