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    桑葉7種黃酮類成分同時(shí)測(cè)定及其抑制α-糖苷酶活性的研究*

    2018-04-27 00:46:54朱瑞超李轉(zhuǎn)愛常艷旭
    天津中醫(yī)藥 2018年4期
    關(guān)鍵詞:霜降蘆丁糖苷酶

    朱瑞超 ,逯 彬 ,羅 蓉 ,李 晉 ,何 俊 ,王 濤 ,李轉(zhuǎn)愛 ,常艷旭

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 300193)

    桑葉為??浦参铮∕orus alba L.)的干燥葉,具有疏散風(fēng)熱,清肺潤(rùn)燥,清肝明目的功效?,F(xiàn)代藥理研究表明,桑葉具有明顯的降血糖功效[1]。研究表明桑葉中的降糖活性成分主要有生物堿、多糖、黃酮類成分,其中DNJ(1-脫氧野尻霉素)是其主要降糖活性成分[2-4],但其中的黃酮類成分也具有較好的降糖活性。有研究表明蘆丁[5-8]、槲皮素等具有潛在的抑制α-糖苷酶活性[9-10]。

    就桑葉而言,采收期不同,藥材各組分含量差異也較大[11-13]。自古以來桑葉的采集時(shí)間習(xí)慣在秋季霜降后采收,歷來多認(rèn)為桑葉以老而經(jīng)霜者為佳,故入藥用多為冬桑葉,亦稱“霜桑葉”或“經(jīng)霜桑葉”。因此,本文在此基礎(chǔ)上,將α-糖苷酶抑制活性與其總指標(biāo)成分含量相銜接,設(shè)計(jì)了基于α-糖苷酶抑制活性對(duì)桑葉中7種黃酮類成分的含量測(cè)定,并基于桑葉經(jīng)霜采收的臨床習(xí)慣對(duì)不同產(chǎn)地及不同采收期的桑葉進(jìn)行含量測(cè)定與活性的對(duì)比研究,擬為桑葉“經(jīng)霜為上”的科學(xué)內(nèi)涵的闡明,桑葉臨床用藥提供依據(jù)。

    1 儀器與材料

    Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司);超純水器(Millipore公司,Mill-QⅡ型);萬分之一天平(德國(guó)Sartorius公司,AX205);旋渦混合器(上海滬西分析儀器廠,XW-80A);離心機(jī)(Sigma 3k15);多功能微孔讀板機(jī)(Molecular Devices);孵育箱 (Shel lab Model 1012 hybrdization oven);pH 計(jì)(FiveEasyTM,Mettler Toledo);96 孔酶標(biāo)板(Corning)。

    色譜純乙腈購(gòu)于Merck公司(德國(guó));色譜純甲醇購(gòu)于Fisher公司(美國(guó));色譜純甲酸購(gòu)于Tedia公司(美國(guó));實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水;分析純甲醇購(gòu)于天津市康科德科技有限公司;分析純磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉皆購(gòu)于天津光復(fù)精選化工研究所。

    蘆丁對(duì)照品、山奈酚對(duì)照品、紫云英苷對(duì)照品、異槲皮苷對(duì)照品、隱綠原酸對(duì)照品、桑皮苷A對(duì)照品均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司;槲皮素對(duì)照品和阿卡波糖購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖購(gòu)于美國(guó) sigma-Alorich公司;各對(duì)照品純度均大于98%。α-糖苷酶:EC:3.2.1.20,規(guī)格:50.95 U/mg,購(gòu)于上海億欣生物技術(shù)有限公司。采集10批不同產(chǎn)地相同采收期霜桑葉100 g;不同采收時(shí)期的桑葉為采自天津中醫(yī)藥大學(xué)校園同一棵樹的不同日期的樹葉,每次采集100 g,經(jīng)常艷旭研究員鑒定為??浦参锷orus alba L.的葉,常溫陰干后粉碎過100目篩、備用。

    2 方法

    2.1 色譜條件 色譜柱為WELCH Ultimate XB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為 0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B);梯度洗脫條件為 0~5 min,95%~88%A;5~11min,88%~87%A;11~21,87%~85%A;21~22min,85%A;22~32min,85%~84%A;32~39min,84%A;39~41 min,84%~83%A;41~50 min,83%A;50~51 min,83%~82%A;51~61 min,82%A;61~69 min,82%~79%A;69~73 min,79%A;73~77 min,79%~78%A;77~78 min,78%A;78~86 min,78%~72%A;86~88 min,72%~68%A;88~92 min,68%~65%A;92~102 min,65%~62%A;流速為 1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):365 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:15 μL。

    2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取隱綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚、異槲皮苷、紫云英苷、桑皮苷A對(duì)照品各適量,加純甲醇溶解,配制成濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

    2.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.500 g桑葉粉末,加80%的甲醇于10 mL容量瓶中(料液比1∶20),于37℃超聲30 min,靜置放冷,加80%甲醇補(bǔ)足至刻度,搖勻,14 000 rpm離心10 min,過濾,取上清液作為樣品溶液,置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4 α-糖苷酶抑制活性測(cè)定 采用文獻(xiàn)報(bào)道[14]的方法配置底物溶液和酶溶液,檢測(cè)不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)期樣品供試液及各單體化合物對(duì)α-糖苷酶活性的影響。本實(shí)驗(yàn)在96孔板上進(jìn)行,設(shè)4個(gè)組,每個(gè)組3個(gè)復(fù)孔,分別為樣品空白組(Asb)、空白對(duì)照組(As)、樣品測(cè)定組(Acb)、對(duì)照組(Ac)。在樣品測(cè)定組中,先加入20 μL緩沖溶液和20 μL樣品溶液,再加入20 μL底物溶液,混勻后,加入20 μL酶溶液,振搖1 min,37℃下孵育15 min,加入0.2M碳酸鈉溶液終止酶反應(yīng),在酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm下,測(cè)定吸光度值。樣品對(duì)α-糖苷酶抑制率按下公式計(jì)算:抑制率=[(Ac-Acb)-(As-Asb)]/(Ac-Acb)×100%,計(jì)算IC50。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 桑葉提取方法的優(yōu)化 本研究首先采用單因素分析方法,考察了提取溶劑(40%、60%、80%、100%甲醇),超聲時(shí)間(10、20、30、40 min),物料比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20) 對(duì) 7 種黃酮成分的提取的影響,確定提取溶劑為60%甲醇,超聲40 min、物料比為1∶20時(shí)最好。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了提取溶劑(60%、70%、80%);超聲時(shí)間(20、30、40 min);物料比(1∶10、1∶15、1∶20)的三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),以 7 種黃酮成分的總量為指標(biāo),并根據(jù)正交設(shè)計(jì)軟件采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,方差分析F檢驗(yàn)中3個(gè)因素時(shí)總量的影響都不顯著,因而采用直觀分析確定最佳條件,確定最佳的提取條件為:提取溶劑80%,超聲時(shí)間30 min,物料比1∶10。見表1。

    表1 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果Tab.1 Visual analysis of the orthogonal experiment results

    方差分析結(jié)果顯示物料比、超聲時(shí)間及提取溶劑對(duì)本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)無顯著性差異。物料比1∶20時(shí)提取相對(duì)完全,故本實(shí)驗(yàn)采用提取溶劑80%,超聲時(shí)間30 min和物料比為1∶20進(jìn)行樣品制備。見表2。

    表2 方差分析結(jié)果Tab.2 Analysis of variance

    3.2 方法學(xué)考察

    3.2.1 線性關(guān)系 將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液以甲醇稀釋,得濃度分別為蘆丁 500 μg/mL,槲皮素 10 μg/mL,山奈酚 10 μg/mL,紫云英苷 300 μg/mL;異槲皮苷 500 μg/mL;桑皮苷 A 100 μg/mL;隱綠原酸200 μg/mL的混合對(duì)照品溶液,并將混合對(duì)照品液稀釋至不同濃度,注入色譜儀,記錄峰面積,以混合對(duì)照品液中各成分濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得線性回歸方程及線性范圍,見表3。結(jié)果表明各對(duì)照品在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Tab.3 Results of standard curve

    3.2.2 精密度 同一供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,以對(duì)照品峰面積進(jìn)行計(jì)算,桑皮苷A,隱綠原酸,蘆丁,異槲皮苷,紫云英苷,槲皮素,山奈酚峰面積的RSD 值分別為 1.11%,2.32%,0.48%,0.8%,2.17%,0.66%和1.12%,結(jié)果表明精密度較好。

    3.2.3 重復(fù)性 制備6份同一批次桑葉樣品供試品溶液,進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算峰7個(gè)化合物峰面積的RSD值,結(jié)果表明桑皮苷A,隱綠原酸,蘆丁,異槲皮苷,紫云英苷,槲皮素,山奈酚峰面積的RSD值分別為2.27%,0.35%,0.12%,1.84%,0.85%,0.57%,0.76%,表明所建立的分析方法重復(fù)性較好。

    3.2.4 穩(wěn)定性 取同一批次的桑葉供試品溶液分別在 0、2、4、6、8、12 、24 h 進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算峰面積的RSD值。桑皮苷A,隱綠原酸,蘆丁,異槲皮苷,紫云英苷,槲皮素,山奈酚峰面積的RSD分別為 1.22%,0.4%,0.51%,0.76%,1.2%,0.29%,1.51%,表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    3.2.5 加樣回收率 精稱取已知含量的桑葉藥材0.25 g,分別精密加入等質(zhì)量的7種標(biāo)準(zhǔn)品,按照樣品制備方法制備,計(jì)算方法提取回收率。桑皮苷A,隱綠原酸,蘆丁,異槲皮苷,紫云英苷,槲皮素,山奈酚的平均回收率分別為99.3%,91.0%,91.1%,90.8%,100%,102%,100%。RSD值分別為2.55%,3.25%,0.730%,0.950%,2.62%,2.36%,0.950%。上述結(jié)果表明,該方法可用于桑葉中7種化合物的提取。

    3.3 樣品含量及抑制α-糖苷酶測(cè)定 精密稱取不同產(chǎn)地、物候期桑葉樣品,制備供試品溶液,利用所建立的分析方法對(duì)桑葉樣品進(jìn)行了分析,測(cè)定桑葉中桑皮苷、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚含量,結(jié)果見表4和表5。典型7種混合標(biāo)準(zhǔn)品和桑葉樣品色譜圖如圖1所示。

    3.4 不同采收期及產(chǎn)地桑葉α-糖苷酶抑制活性與7種黃酮類成分總含量相關(guān)性研究 從表4和表5可知,不同采收期及不同產(chǎn)地樣品間7種成分含量有較大差異。其中,云南產(chǎn)地的桑葉樣品7種成分總含量較高。不同產(chǎn)地桑葉樣品7種黃酮類成分總含量與其α-糖苷酶抑制活性基本呈正相關(guān)關(guān)系(圖2),提示可以采用7種黃酮類成分作為桑葉降糖活性的評(píng)價(jià)指標(biāo),其總含量越高,α-糖苷酶抑制活性越強(qiáng);研究結(jié)果表明不同采收時(shí)期的桑葉樣品中7種黃酮類成分與α-糖苷酶抑制活性相關(guān)性較差,可能與不同時(shí)期的桑葉中化學(xué)成分組成變化有關(guān)。結(jié)合天津市氣候特點(diǎn),可以把所采集的樣品分為3個(gè)時(shí)期,10.11-10.28為霜降期,而4.10-10.11為霜降前期、10.28-11.23為霜降后期。發(fā)現(xiàn)桑葉7種黃酮類成分總含量及α-糖苷酶抑制活性在霜降前期和后期均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),不同采收期桑葉的7種黃酮類成分總含量變化規(guī)律為霜降>霜前>霜后(圖3B);α-糖苷酶抑制活性變化規(guī)律為霜前>霜降>霜后(圖3A)。從表5可知,盡管在4月份桑葉其7種黃酮類成分高于霜降時(shí)期,但其桑葉產(chǎn)量較低,而霜降期桑葉產(chǎn)量較高,推測(cè)可能是古人選擇了霜降為桑葉最佳采收期的原因。本研究為初步探索桑葉“經(jīng)霜者為佳”科學(xué)內(nèi)涵、資源開發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

    表4 不同產(chǎn)地樣品中7種黃酮含量和抑制α-糖苷酶測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination of 7 flavonoids andα-glucosidase inhibitory activity in samples from different habitats

    表5 不同采收期樣品中7種黃酮含量和抑制α-糖苷酶測(cè)定結(jié)果Tab.5 Determination of 7 flavonoids andα-glucosidase inhibitory activity in samples from different times

    圖1 混合對(duì)照品色譜圖(A)和樣品色譜圖(B)Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and samples(B)

    4 結(jié)論

    圖2 不同產(chǎn)地桑葉樣品α-糖苷酶抑制活性與7種黃酮類成分總含量Fig.2 Relation of α-glucosidase inhibitory activity(1/IC50)and total content of 7 flavonoids of mulberry leaf from different areas

    本研究建立了桑葉中桑皮苷A、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚7種黃酮類成分同時(shí)測(cè)定HPLC方法,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地桑葉7種黃酮類成分總含量與其α-糖苷酶抑制活性呈正相關(guān)關(guān)系;通過不同物候期的桑葉化學(xué)成分及降糖活性研究,發(fā)現(xiàn)7種黃酮類成分總含量及α-糖苷酶抑制活性在霜降前期和后期均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),而在霜降時(shí)期桑葉化學(xué)成分及降糖活性均較高,從化學(xué)成分和活性兩個(gè)角度為初步闡釋桑葉“經(jīng)霜為上”的科學(xué)內(nèi)涵、桑葉的臨床應(yīng)用、質(zhì)量控制及桑葉資源的二次開發(fā)提供參考。

    圖3 不同采收期桑葉樣品α-糖苷酶抑制活性及7種黃酮類成分總含量變化規(guī)律Fig.3 Change of α-glucosidase inhibitory activity and total content of 7 flavonoids of mulberry leaf from different collected times

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