桑葉7種黃酮類成分同時(shí)測(cè)定及其抑制α-糖苷酶活性的研究*

朱瑞超 ，逯 彬 ，羅 蓉 ，李 晉 ，何 俊 ，王 濤 ，李轉(zhuǎn)愛 ，常艷旭

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

桑葉為?？浦参铮∕orus alba L.）的干燥葉，具有疏散風(fēng)熱，清肺潤(rùn)燥，清肝明目的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑葉具有明顯的降血糖功效[1]。研究表明桑葉中的降糖活性成分主要有生物堿、多糖、黃酮類成分，其中DNJ（1-脫氧野尻霉素）是其主要降糖活性成分[2-4]，但其中的黃酮類成分也具有較好的降糖活性。有研究表明蘆丁[5-8]、槲皮素等具有潛在的抑制α-糖苷酶活性[9-10]。

就桑葉而言，采收期不同，藥材各組分含量差異也較大[11-13]。自古以來桑葉的采集時(shí)間習(xí)慣在秋季霜降后采收，歷來多認(rèn)為桑葉以老而經(jīng)霜者為佳，故入藥用多為冬桑葉，亦稱“霜桑葉”或“經(jīng)霜桑葉”。因此，本文在此基礎(chǔ)上，將α-糖苷酶抑制活性與其總指標(biāo)成分含量相銜接，設(shè)計(jì)了基于α-糖苷酶抑制活性對(duì)桑葉中7種黃酮類成分的含量測(cè)定，并基于桑葉經(jīng)霜采收的臨床習(xí)慣對(duì)不同產(chǎn)地及不同采收期的桑葉進(jìn)行含量測(cè)定與活性的對(duì)比研究，擬為桑葉“經(jīng)霜為上”的科學(xué)內(nèi)涵的闡明，桑葉臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；超純水器（Millipore公司，Mill-QⅡ型）；萬分之一天平（德國(guó)Sartorius公司，AX205）；旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠，XW-80A）；離心機(jī)（Sigma 3k15）；多功能微孔讀板機(jī)（Molecular Devices）；孵育箱 （Shel lab Model 1012 hybrdization oven）；pH 計(jì)（FiveEasyTM，Mettler Toledo）；96 孔酶標(biāo)板（Corning）。

色譜純乙腈購(gòu)于Merck公司（德國(guó)）；色譜純甲醇購(gòu)于Fisher公司（美國(guó)）；色譜純甲酸購(gòu)于Tedia公司（美國(guó)）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；分析純甲醇購(gòu)于天津市康科德科技有限公司；分析純磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉皆購(gòu)于天津光復(fù)精選化工研究所。

蘆丁對(duì)照品、山奈酚對(duì)照品、紫云英苷對(duì)照品、異槲皮苷對(duì)照品、隱綠原酸對(duì)照品、桑皮苷A對(duì)照品均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；槲皮素對(duì)照品和阿卡波糖購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖購(gòu)于美國(guó) sigma-Alorich公司；各對(duì)照品純度均大于98%。α-糖苷酶：EC:3.2.1.20，規(guī)格：50.95 U/mg，購(gòu)于上海億欣生物技術(shù)有限公司。采集10批不同產(chǎn)地相同采收期霜桑葉100 g；不同采收時(shí)期的桑葉為采自天津中醫(yī)藥大學(xué)校園同一棵樹的不同日期的樹葉，每次采集100 g，經(jīng)常艷旭研究員鑒定為?？浦参锷orus alba L.的葉，常溫陰干后粉碎過100目篩、備用。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為WELCH Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為 0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫條件為 0～5 min，95%～88%A；5～11min，88%～87%A；11～21，87%～85%A；21～22min，85%A；22～32min，85%～84%A；32～39min，84%A；39～41 min，84%～83%A；41～50 min，83%A；50～51 min，83%～82%A；51～61 min，82%A；61～69 min，82%～79%A；69～73 min，79%A；73～77 min，79%～78%A；77～78 min，78%A；78～86 min，78%～72%A；86～88 min，72%～68%A；88～92 min，68%～65%A；92～102 min，65%～62%A；流速為 1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：15 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取隱綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚、異槲皮苷、紫云英苷、桑皮苷A對(duì)照品各適量，加純甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.500 g桑葉粉末，加80%的甲醇于10 mL容量瓶中（料液比1∶20），于37℃超聲30 min，靜置放冷，加80%甲醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，14 000 rpm離心10 min，過濾，取上清液作為樣品溶液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 α-糖苷酶抑制活性測(cè)定 采用文獻(xiàn)報(bào)道[14]的方法配置底物溶液和酶溶液，檢測(cè)不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)期樣品供試液及各單體化合物對(duì)α-糖苷酶活性的影響。本實(shí)驗(yàn)在96孔板上進(jìn)行，設(shè)4個(gè)組，每個(gè)組3個(gè)復(fù)孔，分別為樣品空白組（Asb）、空白對(duì)照組（As）、樣品測(cè)定組（Acb）、對(duì)照組（Ac）。在樣品測(cè)定組中，先加入20 μL緩沖溶液和20 μL樣品溶液，再加入20 μL底物溶液，混勻后，加入20 μL酶溶液，振搖1 min，37℃下孵育15 min，加入0.2M碳酸鈉溶液終止酶反應(yīng)，在酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm下，測(cè)定吸光度值。樣品對(duì)α-糖苷酶抑制率按下公式計(jì)算：抑制率=[（Ac-Acb）-（As-Asb）]/（Ac-Acb）×100%，計(jì)算IC50。

3 結(jié)果與討論

3.1 桑葉提取方法的優(yōu)化 本研究首先采用單因素分析方法，考察了提取溶劑（40%、60%、80%、100%甲醇），超聲時(shí)間（10、20、30、40 min），物料比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20） 對(duì) 7 種黃酮成分的提取的影響，確定提取溶劑為60%甲醇，超聲40 min、物料比為1∶20時(shí)最好。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了提取溶劑（60%、70%、80%）；超聲時(shí)間（20、30、40 min）；物料比（1∶10、1∶15、1∶20）的三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，以 7 種黃酮成分的總量為指標(biāo)，并根據(jù)正交設(shè)計(jì)軟件采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，方差分析F檢驗(yàn)中3個(gè)因素時(shí)總量的影響都不顯著，因而采用直觀分析確定最佳條件，確定最佳的提取條件為：提取溶劑80%，超聲時(shí)間30 min，物料比1∶10。見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果Tab.1 Visual analysis of the orthogonal experiment results

方差分析結(jié)果顯示物料比、超聲時(shí)間及提取溶劑對(duì)本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)無顯著性差異。物料比1∶20時(shí)提取相對(duì)完全，故本實(shí)驗(yàn)采用提取溶劑80%，超聲時(shí)間30 min和物料比為1∶20進(jìn)行樣品制備。見表2。

表2 方差分析結(jié)果Tab.2 Analysis of variance

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系 將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液以甲醇稀釋，得濃度分別為蘆丁 500 μg/mL，槲皮素 10 μg/mL，山奈酚 10 μg/mL，紫云英苷 300 μg/mL；異槲皮苷 500 μg/mL；桑皮苷 A 100 μg/mL；隱綠原酸200 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，并將混合對(duì)照品液稀釋至不同濃度，注入色譜儀，記錄峰面積，以混合對(duì)照品液中各成分濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程及線性范圍，見表3。結(jié)果表明各對(duì)照品在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Tab.3 Results of standard curve

3.2.2 精密度 同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以對(duì)照品峰面積進(jìn)行計(jì)算，桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD 值分別為 1.11%，2.32%，0.48%，0.8%，2.17%，0.66%和1.12%，結(jié)果表明精密度較好。

3.2.3 重復(fù)性 制備6份同一批次桑葉樣品供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算峰7個(gè)化合物峰面積的RSD值，結(jié)果表明桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD值分別為2.27%，0.35%，0.12%，1.84%，0.85%，0.57%，0.76%，表明所建立的分析方法重復(fù)性較好。

3.2.4 穩(wěn)定性 取同一批次的桑葉供試品溶液分別在 0、2、4、6、8、12 、24 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值。桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD分別為 1.22%，0.4%，0.51%，0.76%，1.2%，0.29%，1.51%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.5 加樣回收率 精稱取已知含量的桑葉藥材0.25 g，分別精密加入等質(zhì)量的7種標(biāo)準(zhǔn)品，按照樣品制備方法制備，計(jì)算方法提取回收率。桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚的平均回收率分別為99.3%，91.0%，91.1%，90.8%，100%，102%，100%。RSD值分別為2.55%，3.25%，0.730%，0.950%，2.62%，2.36%，0.950%。上述結(jié)果表明，該方法可用于桑葉中7種化合物的提取。

3.3 樣品含量及抑制α-糖苷酶測(cè)定 精密稱取不同產(chǎn)地、物候期桑葉樣品，制備供試品溶液，利用所建立的分析方法對(duì)桑葉樣品進(jìn)行了分析，測(cè)定桑葉中桑皮苷、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚含量，結(jié)果見表4和表5。典型7種混合標(biāo)準(zhǔn)品和桑葉樣品色譜圖如圖1所示。

3.4 不同采收期及產(chǎn)地桑葉α-糖苷酶抑制活性與7種黃酮類成分總含量相關(guān)性研究 從表4和表5可知，不同采收期及不同產(chǎn)地樣品間7種成分含量有較大差異。其中，云南產(chǎn)地的桑葉樣品7種成分總含量較高。不同產(chǎn)地桑葉樣品7種黃酮類成分總含量與其α-糖苷酶抑制活性基本呈正相關(guān)關(guān)系（圖2），提示可以采用7種黃酮類成分作為桑葉降糖活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其總含量越高，α-糖苷酶抑制活性越強(qiáng)；研究結(jié)果表明不同采收時(shí)期的桑葉樣品中7種黃酮類成分與α-糖苷酶抑制活性相關(guān)性較差，可能與不同時(shí)期的桑葉中化學(xué)成分組成變化有關(guān)。結(jié)合天津市氣候特點(diǎn)，可以把所采集的樣品分為3個(gè)時(shí)期，10.11-10.28為霜降期，而4.10-10.11為霜降前期、10.28-11.23為霜降后期。發(fā)現(xiàn)桑葉7種黃酮類成分總含量及α-糖苷酶抑制活性在霜降前期和后期均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，不同采收期桑葉的7種黃酮類成分總含量變化規(guī)律為霜降＞霜前＞霜后（圖3B）；α-糖苷酶抑制活性變化規(guī)律為霜前＞霜降＞霜后（圖3A）。從表5可知，盡管在4月份桑葉其7種黃酮類成分高于霜降時(shí)期，但其桑葉產(chǎn)量較低，而霜降期桑葉產(chǎn)量較高，推測(cè)可能是古人選擇了霜降為桑葉最佳采收期的原因。本研究為初步探索桑葉“經(jīng)霜者為佳”科學(xué)內(nèi)涵、資源開發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

表4 不同產(chǎn)地樣品中7種黃酮含量和抑制α-糖苷酶測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination of 7 flavonoids andα-glucosidase inhibitory activity in samples from different habitats

表5 不同采收期樣品中7種黃酮含量和抑制α-糖苷酶測(cè)定結(jié)果Tab.5 Determination of 7 flavonoids andα-glucosidase inhibitory activity in samples from different times

圖1 混合對(duì)照品色譜圖(A)和樣品色譜圖(B)Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and samples(B)

4 結(jié)論

圖2 不同產(chǎn)地桑葉樣品α-糖苷酶抑制活性與7種黃酮類成分總含量Fig.2 Relation of α-glucosidase inhibitory activity(1/IC50)and total content of 7 flavonoids of mulberry leaf from different areas

本研究建立了桑葉中桑皮苷A、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚7種黃酮類成分同時(shí)測(cè)定HPLC方法，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地桑葉7種黃酮類成分總含量與其α-糖苷酶抑制活性呈正相關(guān)關(guān)系；通過不同物候期的桑葉化學(xué)成分及降糖活性研究，發(fā)現(xiàn)7種黃酮類成分總含量及α-糖苷酶抑制活性在霜降前期和后期均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而在霜降時(shí)期桑葉化學(xué)成分及降糖活性均較高，從化學(xué)成分和活性兩個(gè)角度為初步闡釋桑葉“經(jīng)霜為上”的科學(xué)內(nèi)涵、桑葉的臨床應(yīng)用、質(zhì)量控制及桑葉資源的二次開發(fā)提供參考。

圖3 不同采收期桑葉樣品α-糖苷酶抑制活性及7種黃酮類成分總含量變化規(guī)律Fig.3 Change of α-glucosidase inhibitory activity and total content of 7 flavonoids of mulberry leaf from different collected times

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典 (第一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:297-298.

[2] Mathieu B,WillyS.Theantiglycogenolyticaction of1-deoxynojirimycin results from a specific inhibition of the α-l,6-glucosidase activity of the debranching enzyme[J].Eur J Biochem,1989,181:775-780.

[3] Do HJ,Chung JH,Hwang JW,et al.1-Deoxynojirimycin isolated from Bacillus subtilis improves hepatic lipid metabolism and mitochondrial function in high-fat-fed mice[J].Food Chem Toxicol,2015(75):1-7.

[4] Zhang YL,Gao HL,Liu RJ,et al.Quinazoline-1-deoxynojirimycin hybrids as high active dual inhibitors of EGFR and α-glucosidase[J].Bioorg Med Chem Lett,2017(27):4309-4313.

[5] Jadhav R,Puchchakayala G.Hypoglycemic and antidiabetic activity of flavonoids:boswellic acid,ellagic acid,quercetin,rutin on streptozotocin-nicotinamide induced type 2 diabetic rats[J].Int J Pharm Pharm Sci,2012,4(2):251-256.

[6] Ahmed OM,Moneim AA,Yazid IA,et al.Antihyperglycemic,antihyperlipidemic and antioxidanteffectsand the probable mechanisms of action of Ruta graveolens infusion and rutin in nicotinamide-streptozotocin-induced diabetic rats[J].Diabetol Croat,2010,39(1):15-35.

[7] Li YQ,Zhou FC,Gao F,et al.Comparative evaluation of quercetin,isoquercetin and rutin as inhibitors of α-glucosidase[J].J Agric Food Chem,2009,57(24):11463-11468.

[8] Bais S,Shrirao S,Jiddewar A,et al.Evaluation of effect of rutin in diabetes rat gastropathy[J].Int J Pharm Phytopharmacol Res,2017,1(6):363-366.

[9] Srinivasan P,Subramaniyan V,Kothandaraman S,et al.Antidiabetic activity of quercetin extracted from Phyllanthus emblica L.fruit:In silico and in vivo approaches[J].J Pharm Anal,2017,10.

[10]Dechandt CRP,Siqueira JT,Souza DLPD,et al.Combretum lanceolatum flowers extract shows antidiabetic activity through activation of AMPK by quercetin[J].Rev Bras Farmacog,2013,23(2):291-300.

[11]王 芳,喬 璐,淡小艷,等.桑葉黃酮的提取及抗氧化研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,47(15):76-79.

[12]徐健飛,義祥輝,陳全斌.桑葉生長(zhǎng)周期黃酮含量變化的研究[J].食品科技,2009,35(2):66-70.

[13]李瑞雪,王鈺婷,胡 飛,等.桑樹總黃酮含量變化規(guī)律分析[J].中國(guó)蠶業(yè),2015,36(4):30-34.