腎衰1號對腎臟缺血再灌注大鼠KIM-1和NGAL蛋白表達的影響*

康 利 ，陳 冠 ，王 梓 ，賈淑杰 ，王 露 ，樊威偉

（1．天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，心腦血管藥物研發(fā)中心，天津 300020；2．天津市海河醫(yī)院，天津 300350；3.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；4.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

急性腎損傷（AKI）是臨床上常見且嚴(yán)重的綜合征之一，越來越多的證據(jù)顯示AKI會引起慢性腎?。–KD）和晚期腎?。‥SRD）的發(fā)展[2]。因此臨床迫切需要針對AKI的治療藥物將腎病控制在初級階段，防止病情進一步發(fā)展成為CKD和ESRD。

腎衰1號是張大寧教授所創(chuàng)，是經(jīng)大量臨床病例證實對腎功能衰竭患者有良好效果的方藥[3-5]。該方由黃芪、大黃 、大黃炭、丹參、川芎、蒲黃炭等組成[6]，黃芪益氣扶正，丹參、川芎活血化瘀，大黃及大黃炭利濕泄?jié)峤舛净钛?。諸藥共奏泄?jié)崂麧袂鍩峤舛疽鏆饣钛7]。文章從AKI早期標(biāo)志物腎損傷因子-1（KIM-1）和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）入手，研究腎衰1號對腎臟缺血再灌注大鼠的干預(yù)作用，為中藥治療AKI提供理論發(fā)據(jù)[8-10]。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量190～220 g，共120只。購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，許可證號：SCXK（軍）2014-0001。

1.2 實驗藥物 受試藥物：根據(jù)處方進行制備成含生藥2 g/mL的濃縮液，人用劑量每日每劑135 g生藥，腎衰1號高劑量15.4生藥g/kg，腎衰1號低劑量4.8生藥g/kg。陽性藥物：尿毒清顆粒，由廣州康臣藥業(yè)有限負責(zé)公司生產(chǎn)，規(guī)格：5 g/袋，人用劑量每日25 g藥粉。批號：20160315，給藥量：0.2 mg/kg。

2 實驗方法

2.1 動物分組與造模方法 根據(jù)缺血再灌注時間分成1 d、3 d、7 d組，每個觀察時間點將大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、陽性藥組、腎衰1號高劑量組、腎衰1號低劑量組，每組8只。

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉，除假手術(shù)對照組僅進行皮膚及肌肉切開分離雙側(cè)腎動脈外，其余大鼠均暴露雙側(cè)腎動脈并同時用動脈夾夾閉雙側(cè)腎動脈，30 min后同時松開雙側(cè)血管夾，恢復(fù)雙側(cè)腎組織血供，觀察腎組織顏色變化，從紫色變?yōu)榧t色說明造模成功。

2.2 給藥方法 除假手術(shù)、模型組外，各組在造模前預(yù)防給藥3 d，造模后持續(xù)給藥直至觀察時間點，灌注給藥，每日1次。給藥體積為10 mL/kg。造模后每日對大鼠進行一般形態(tài)觀察，大便、毛色及飲食等一般情況。根據(jù)再灌注時間，分別在造模后1 d、3 d、7 d進行取材。

2.3 腎臟組織學(xué)檢查 取一側(cè)腎臟置于10%甲醛水溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明石蠟包埋切片厚度3 μm后，蘇木精-伊紅（HE）染色。

2.4 腎功能檢測 用全自動血生化儀測定各組大鼠血尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）。

2.5 腎組織中KIM-1和NGAL表達的測定 采用Western Blot法測定腎組織中KIM-1和NGAL的表達。每一樣本稱取腎組織50 mg，用RIPA裂解液超聲勻漿腎組織，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清為樣本，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度；每孔取45 g總蛋白上樣，4%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉封閉60 min，加入KIM-1（1∶300），NGAL（1∶300）抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體室溫孵育1 h，用曝光法顯影，以β-Actin為內(nèi)參照，用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.5統(tǒng)計軟件進行檢驗，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD檢驗，若方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗，p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 術(shù)后一般性觀察 模型組與假手術(shù)組比較，毛發(fā)豎立，顫抖及行動遲緩現(xiàn)象，各給藥組在每個時期體態(tài)特征均優(yōu)于模型對照組，各給藥組之間肉眼觀察差異不明顯。

3.2 腎功能指標(biāo)變化 模型組與假手術(shù)組比較，第1、3、7 天的 SCr和 BUN 均顯著上升（p＜0.001）。與模型組比較，各給藥組BUN和Scr明顯下降（p＜0.05，p＜0.001）。腎衰1號高劑量組效果明顯，見表1。

3.3 對腎組織中KIM-1和NGAL蛋白表達的影響 從SCr和BUN數(shù)據(jù)可以看出，第3天各組的SCr和BUN開始下降，到第7天趨于正常，且在造模后24 h，兩蛋白均能達到峰值區(qū)間[11-14]。故考察第1天的腎組織做KIM-1和NGAL蛋白表達的比較。與假手術(shù)組相比，模型組KIM-1和NGAL蛋白表達均顯著升高（p＜0.05，p＜0.001）；與模型組相比，給藥組NGAL 蛋白表達均明顯下降（p＜0.05，p＜0.001），見圖1。

圖1 各組大鼠1天腎組織KIM-1，NGAL蛋白表達比較Fig.1 Comparison of expression of proteins KIM-1,NGAL of kidney tissue of each group on 1 day

3.4 腎臟組織病理學(xué)觀察 HE病理染色可見假手術(shù)組腎小球體積未見縮小或肥大，數(shù)目未見減少，各腎小管上皮細胞未見變性、壞死或脫落，管腔中未見管型及結(jié)石，腎間質(zhì)未見炎細胞浸潤及纖維組織增生。

表1 腎衰1號對AKI大鼠腎功能的影響Tab.1 Effect of Shenshuai No.1 on renal function

模型組第1天可見局部腎間質(zhì)出血，腎小管上皮細胞脫落，部分形成管型。第3天模型組腎損傷進程已經(jīng)趨于穩(wěn)定并表現(xiàn)出較嚴(yán)重的損傷狀態(tài)，由于腎小管上皮細胞進一步變性壞死脫落，可見大面積的腎小管擴張以及管型，并有周圍淋巴細胞侵潤。第7天模型組腎損傷進程進入平穩(wěn)期，上皮細胞脫落減少，腎小管擴張及管型已穩(wěn)定部分可見淋巴細胞浸潤。

受試劑量組及尿毒清顆粒陽性藥組在第1天就有不同程度改善，以腎衰1號高劑量組改善較為明顯，其表現(xiàn)為腎小管上皮細胞壞死及脫落較模型組減少。第3天各給藥組與第1天情況大體一致。第7天給藥各組已進入恢復(fù)期，腎衰1號高劑量組可見極少壞死脫落細胞，管型相對模型組數(shù)量少，且形態(tài)小，腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)良好。腎衰1號低劑量組及陽性藥組管型稍大且多但優(yōu)于模型組伴有少量淋巴細胞浸潤，圖2。

圖2 腎衰1號對AKI各組大鼠腎組織病理改變情況（HE，×200）Fig.2 Effect of Shenshuai No.1 on renal tissue pathology（HE，×200）

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為AKI的病因病機是由于正氣不足引起的，而虛瘀濁毒是AKI發(fā)病的關(guān)鍵病機[15]。腎衰1號其中醫(yī)理論核心“補腎活血降逆排毒法”，是AKI病因病機對癥治療。

AKI病理生理主要表現(xiàn)為腎臟細胞組織管型及上皮、血管細胞損傷且伴有炎癥反應(yīng)[16]。KIM-1和NGAL是AKI重要生物標(biāo)志物，兩者均可能在AKI早期呈高水平表達，是較傳統(tǒng)指標(biāo)更敏感的AKI生物學(xué)指標(biāo)。KIM-1是一種獨特的磷脂酰絲氨酸受體，可賦予腎小管上皮細胞吞噬功能，有利于凋亡壞死細胞的清除，減輕小管梗阻。體外實驗還發(fā)現(xiàn)KIM-1蛋白近膜區(qū)可裂解為可溶性KIM-1，這種裂解已是p38MAPK信號介導(dǎo)的。而p38MAPK在由多種應(yīng)激刺激原或炎癥因子激活的信號通路中扮演重要角色，并介導(dǎo)細胞生理病理改變[17-20]。綜上所述可以推測，當(dāng)AKI發(fā)生時，由于腎臟組織受損導(dǎo)致壞死、出血及炎癥的發(fā)展，這些連鎖反應(yīng)激活了p38MAPK通路，隨著通路的激活，驅(qū)使細胞多個因子基因表達，KIM-1和NAGL蛋白在這個過程中被分泌出來。機體處于自我保護的應(yīng)激反應(yīng)中開始對腎臟進行保護和修復(fù)。而腎衰1號的給予可以在這個階段對腎臟起到保護和清除凋亡細胞的作用，使腎損傷最小化，從而降低KIM-1、NAGL蛋白的產(chǎn)生。

本研究結(jié)果表明腎衰1號在AKI初期階段可降低腎損傷程度，穩(wěn)定病情其表現(xiàn)為顯著降低大鼠的BUN、Scr、KIM-1和NGAL的水平，從病理HE染色也能清晰的看出對比模型組，受試組未見明顯炎癥及細胞凋亡現(xiàn)象，細胞形態(tài)比較正常。在AKI中期階段，腎衰1號能對損傷細胞的修復(fù)、對壞死細胞的重建、改善腎小球血流動力學(xué)減少腎小管的梗阻，起到良好的保護及修復(fù)作用。腎衰1號臨床上不僅可以治療慢性腎衰，而且對AKI的前中期也有良好的治療基礎(chǔ)，也可避免進一步發(fā)展成為CKD和ESRD病。本研究不僅拓展了腎衰1號的臨床應(yīng)用范圍，同時也為研發(fā)出作用靶點明確、安全有效、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的AKI中藥新藥奠定基礎(chǔ)。

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