針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮質(zhì) TLR9、TNF-α、IRF7和 IFN-β 的mRNA表達(dá)的影響*

許軍峰 ，張 浪 ，田 騫 ，郭士明 ，李文博

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸特需科，天津 300193；2.中國中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動站，北京 100700；3.陜西省子長縣人民醫(yī)院，子長 717300；4.天津市東麗區(qū)中醫(yī)院，天津 300399；5.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

腦梗死是臨床上的一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率占腦卒中60%～80%[1]，腦缺血損傷導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞缺失和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)損傷，患者神經(jīng)功能損傷引起運(yùn)動功能不同程度受限[2]。目前臨床上治療腦卒中后并發(fā)癥的方法很多，其中針刺法在治療缺血性腦卒中康復(fù)期不存在血腦屏障[3-6]。本研究將從Toll樣受體9（TLR9）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素調(diào)節(jié)因子 7（IRF7）、干擾素-β（IFN-β）因子的mRNA表達(dá)方面闡釋針刺治療中風(fēng)病的機(jī)制，研究針刺的抗損傷修復(fù)及腦保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與取材 選擇健康成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量280～300 g，SPF由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心配送。按隨機(jī)數(shù)字表分為模型組（即手術(shù)組）、假手術(shù)組和針刺組，每組12只大鼠。3組按再灌注時(shí)間點(diǎn)和腦組織取材來源分為：6 h缺血側(cè)（I1）、5 d缺血側(cè)（I2）兩個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間段各6只。I1和I2在梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮質(zhì)取材。

1.2 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 大腦中動脈閉塞模型參照改良Zea Longa氏線栓法[7]制備右側(cè)腦缺血，在大腦中動脈阻塞90 min時(shí)，將線栓拔出至頸外動脈內(nèi)達(dá)到再灌注。假手術(shù)組除不插入魚線外，其他操作與手術(shù)組相同。神經(jīng)病學(xué)評分參考Zealonga的5級4分法標(biāo)準(zhǔn)[8]。有效模型在1～4分。造模后的動物會有神經(jīng)功能缺損癥狀，如偏癱等。如有腦出血死亡者剔除。

1.3 針刺取穴及針刺方法 根據(jù)中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”，選用內(nèi)關(guān)、水溝、三陰交3個(gè)穴位，取相應(yīng)脅下固定點(diǎn)作為非穴點(diǎn)，使用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的“華佗牌”毫針，40 mm×0.32 mm。先刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)：直刺0.3～0.5寸（同身寸，下同），施捻轉(zhuǎn)提插瀉法1 min；再刺水溝：斜刺0.3～0.5寸，用重雀啄法施手法4～6次；然后刺患側(cè)三陰交，施提插補(bǔ)法，使患側(cè)下肢抽動3次。非穴點(diǎn)針刺，施平補(bǔ)平瀉手法1 min。6 h組僅針刺1次，5 d組針刺隔天1次，共3次。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測 對大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開顱取腦，放于-20℃速凍30 min，組織切片自端腦前端開始，從前往后，每片厚1.5 mm。取大鼠前囟冠狀面雙側(cè)額頂葉皮質(zhì)，將其分別分裝于清潔標(biāo)本管中；液氮速凍后置-80℃保存?zhèn)溆?。用超純RNA試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取樣本組織中的總RNA。實(shí)驗(yàn)操步驟參考說明書操作；取5 μL RNA，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)操作步驟參考說明書操作。用ABI7500fast型熒光定量PCR儀，數(shù)據(jù)的相對定量分析采用2-△△CT法。根據(jù)Real Time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△CT相對定量計(jì)算公式，即

F=2-(對照組目的基因平均Ct值-對照組看家基因平均Ct值)-（待檢樣品月的基因平均Ct-待檢樣品看家基因平均Ct值）

計(jì)算出各樣品目的基因相對定量的結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對于對照樣品（M51R），目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS for WindowsVer.18.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)前后比較若滿足正態(tài)分布用配對t檢驗(yàn)，若呈偏態(tài)分布用配對秩和檢驗(yàn)。多組間比較若滿足正態(tài)分布采用單因素方差分析，若呈偏態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮質(zhì) TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA 表達(dá)的影響統(tǒng)計(jì)如下。

2.1 針刺對TLR9 mRNA表達(dá)的影響 不同分組、不同時(shí)間段、不同側(cè)TLR9信號通路mRNA的表達(dá)對比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 針刺對TLR9 mRNA表達(dá)的影響Tab.1 Effect of acupuncture on the expression of TLR9 mRNA

表1 針刺對TLR9 mRNA表達(dá)的影響Tab.1 Effect of acupuncture on the expression of TLR9 mRNA

組別 動物數(shù) 6 h 5 d模型組 6 0.724 0±0.3245 5 0.372 5±0.4207 4針刺組 6 0.608 0±0.1285 3 0.890 0±0.7658 0假手術(shù)組 6 0.364 0±0.1902 1 0.708 0±0.1355 4

2.2 針刺對TNF-α mRNA表達(dá)影響 模型組6 h、假手術(shù)組6 h、針刺組6 h、模型組5 d與針刺組5 d對比（p＜0.05），均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，針刺組5 d TNF-α mRNA表達(dá)明顯升高。見表2。

2.3 針刺對IRF7 mRNA表達(dá)的影響 模型組5 d、假手術(shù)組5d與模型組6h比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），兩者較模型組6 h明顯降低。見表3。

表2 針刺對TNF-α mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effect of acupuncture on the expression of TNF-α mRNA

表2 針刺對TNF-α mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effect of acupuncture on the expression of TNF-α mRNA

注：與針刺組 5 d 比較，*p＜0.05。

組別 動物數(shù) 6 h 5 d模型組 6 0.090 0±0.021 21* 0.337 5±0.443 20*針刺組 6 0.178 0±0.048 68* 1.348 0±0.992 20假手術(shù)組 6 0.296 0±0.187 43* 0.464 0±1.176 00*

表3 針刺對IRF7的mRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effect of acupuncture on the expression of IRF7 mRNA

表3 針刺對IRF7的mRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effect of acupuncture on the expression of IRF7 mRNA

注：與模型組 6 h 比較，*p＜0.05。

組別 動物數(shù) 6 h 5 d模型組 6 2.368 0±0.986 39 0.272 5±0.485 07*針刺組 6 1.648 0±0.513 59 1.206 0±1.405 68假手術(shù)組 6 0.890 0±0.326 50 0.562 0±0.467 25*

2.4 針刺對IFN-βmRNA表達(dá)的影響 模型組6h、針刺組6 h、假手術(shù)組6 h組和針刺組5 d對比，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），針刺組 5 d IFN-β mRNA表達(dá)明顯增加。見表4。

表4 針刺對IFN-β mRNA表達(dá)的影響（Tab.4 Effect of acupuncture on the expression of IFN-β mRNA

表4 針刺對IFN-β mRNA表達(dá)的影響（Tab.4 Effect of acupuncture on the expression of IFN-β mRNA

注：與針刺組 5 d 比較，*p＜0.05。

組別 動物數(shù) 6 h 5 d模型組 6 0.984 0±0.727 14* 0.692 5±0.383 26針刺組 6 0.946 0±0.310 29* 2.508 0±1.355 31假手術(shù)組 6 0.220 0±0.111 36* 0.656 0±0.140 29

3 討論

腦卒中目前臨床上作為一種常見病，針刺治療缺血性腦神經(jīng)損傷元具有保護(hù)作用已被大量臨床與實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證，在臨床上取得顯著療效[9-11]。本實(shí)驗(yàn)以腦缺血后再灌注大鼠的TLR9 mRNA信號通路作為研究目標(biāo)，研究針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮質(zhì)在不同時(shí)間點(diǎn) TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA 表達(dá)的影響[12]，闡述針刺治療中風(fēng)病機(jī)制所在，結(jié)果顯示針刺法增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)因子IFN-β mRNA的表達(dá)。

腦缺血再灌注后6 h炎癥因子IRF7、IFN-β mRNA明顯增高，而因子TLR9和TNF-α增高不明顯，可能與其啟動時(shí)間不同有關(guān)。本研究尚不能表明該針刺能抑制TLR9 mRNA的表達(dá)，究其原因，腦缺血再灌注后TLR9信號通路被激活，隨著機(jī)體自身的愈合，或者有效藥物與有效方法的治療，TLR9 mRNA的表達(dá)會降低，或許5 d尚在腦缺血再灌注后TLR9 mRNA表達(dá)的峰值之前。本針刺法5 d TNF-α mRNA表達(dá)對比明顯增加，不能證明本針刺法能抑制TNF-α mRNA表達(dá)，甚至?xí)T發(fā)腦水腫、損害腦神經(jīng)，故腦缺血再灌注損傷后至少5 d內(nèi)不宜針刺。本研究表明該針刺法不能使IRF-7因子的mRNA表達(dá)下降，說明腦梗死有一定的自限性。IFN-β是一種神經(jīng)保護(hù)因子，腦缺血再灌注后IFN-β mRNA表達(dá)增加，表明本針刺法能明顯增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)因子IFN-β mRNA的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)從TLR9 mRNA信號通路的角度闡述針刺治療中風(fēng)的機(jī)制。腦缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)過針刺干預(yù)后，神經(jīng)保護(hù)因子IFN-β信號mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，神經(jīng)功能活動障礙改善，能夠減少腦缺血再灌注損傷影響的程度[13]。提示針刺對腦缺血大鼠的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)機(jī)制之一，可能是通過增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)因子IFN-β mRNA的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果顯示，每組6個(gè)樣本，且標(biāo)準(zhǔn)差較高，實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)控有待提高，所得到的結(jié)論需要進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經(jīng)科雜志，2015,48(4)：246-257.

[2] Flynn RW，Mac Water RS，Doney AS.The cost of cerebral ischaemia[J].Neuropharmacology，2008，55(3):250-256.

[3] 楊珊莉,江一靜,陶 靜,等.電針對缺血性腦卒中再灌注損害大鼠CREB表達(dá)的影響[J].世界中醫(yī)藥,2014,9(2):221-223.

[4] 陳 鋒，嚴(yán)志康，楊 波.頭皮針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)腦組織bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)以及血液流變的影響[J].針刺研究，2009，34(6)：363-367.

[5] 孔立紅，孫國杰，劉勝洪.針刺對腦缺血再灌注大鼠海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB 表達(dá)及含量的影響[J].針刺研究，2006，31(3)：140-144.

[6] 徐 虹，洪禮傳，黃艷秋，等.針刺對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(7)：731-736.

[7]王 順，張 靜.不同經(jīng)穴針刺對腦卒中偏癱痙攣大鼠血清cAMP、cGMP含量影響的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2012，19(1):54-55.

[8] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91

[9] 張春紅,王 舒,石學(xué)敏,等.醒腦開竅針法對腦梗死模型大鼠腦組織c-fos基因表達(dá)的影響[J].天津中醫(yī)藥,2004,21(3):210-213.

[10]何 娜,朱春雷,何 欣.針刺治療腦梗死對神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(9):3-4.

[11]余亞娟.針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，23(4):277-279.

[12]謝 芬，方建業(yè)，潘經(jīng)銳，等.腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區(qū)TLR9信號通路的活化[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2011,37(10)：596-597.

[13]許軍峰，張 浪，田 騫，等.針刺對腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,32(3)：455-457.