魚腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

李少金，方婉仙，肖水秀，匡文斌

（1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，深圳 518110；2.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510665）

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和人民生活水平的提高，腦血管病己經(jīng)成為中國(guó)居民的第一死因。中國(guó)平均每年200多萬人罹患此病，其中150萬以上死亡。腦血管病包括出血性和缺血性腦血管病兩大類，其中腦缺血性卒中發(fā)病率最高，約占全部卒中的75%[1]。臨床上治療腦缺血性卒中的唯一有效方法為快速恢復(fù)再灌注[2]，但研究發(fā)現(xiàn)再灌注后反而進(jìn)一步加劇腦損傷即腦缺血再灌注損傷。其機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚沒完全闡明，主要是與炎性反應(yīng)、自由基損傷、細(xì)胞毒性、線粒體通透性增加、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等多種機(jī)制有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)抗炎和抗氧化藥物均可以有效地保護(hù)腦缺血再灌注損傷[3-4]。目前臨床上針對(duì)腦缺血再灌注損傷并沒有特效藥，故研究開發(fā)保護(hù)缺血性腦損傷的藥物具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。近年來研究表明[5]許多中藥有效成分在防治腦缺血再灌注損傷方面取得了較好的成效，可為臨床上有效藥物的開發(fā)提供方向。

魚腥草為三白草科多年生草本植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分。其主要成分為揮發(fā)油，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增加免疫力等多種功效[6]，提示魚腥草揮發(fā)油可能對(duì)腦缺血再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用。目前魚腥草揮發(fā)油對(duì)腦缺血再灌注損傷的研究尚未見報(bào)道，本研究旨在探討魚腥草揮發(fā)油對(duì)腦缺血再灌注損傷的療效及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（魯）20140006。

1.2 藥物與試劑 辛伐他汀片：規(guī)格20 mg/片，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司；魚腥草：廣東天泰藥業(yè)有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）ELISA檢測(cè)試劑盒：博士德生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒：南京建成股份有限公司；氯化三苯四氮唑（TTC）：Sigma-Aldrich；栓線：廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 550酶標(biāo)測(cè)定儀：日本Bio-red公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Leica SM2010 R切片機(jī):德國(guó)萊卡股份有限公司；體式顯微鏡：深圳市西派克光學(xué)儀器有限公司

1.4 方法

1.4.1 魚腥草揮發(fā)油的提取 參照文獻(xiàn)[7]的方法提取魚腥草揮發(fā)油，主要工藝條件如下：將干燥魚腥草粉碎成粗粉，按料液比為1∶10加入蒸餾水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中浸泡10 h，70℃加熱回流10 h。

1.4.2 分組與給藥 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、辛伐他汀陽性對(duì)照組，魚腥草揮發(fā)油低劑量組，魚腥草揮發(fā)油中劑量組，魚腥草揮發(fā)油高劑量組，每組20只。于造模前連續(xù)灌胃給藥14 d，辛伐他汀陽性對(duì)照組灌胃給藥20 mg/（kg·d），魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組分別灌胃給藥5、10、20 mg/（kg·d），假手術(shù)組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.4.3 小鼠腦缺血（MCAO）模型的建立 各組小鼠連續(xù)灌胃給藥2周后，末次給藥1 h后開始造模，4%異戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，麻醉后仰臥固定于37℃恒溫手術(shù)臺(tái)上。按文獻(xiàn)方法[8]建立小鼠MCAO模型，主要步驟如下：剃去頸部毛發(fā)、碘伏消毒，正中縱向切口長(zhǎng)約2 cm，暴露和分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，4-0號(hào)縫合線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，利用體式顯微鏡于頸總動(dòng)脈近心端剪一小口，把包被硅膠的9 mm長(zhǎng)尼龍線從頸總動(dòng)脈剪口處插入小口向頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢送入，略感到阻力后停止推進(jìn)并固定栓線，即可堵塞大腦中動(dòng)脈。缺血90 min后，輕輕抽出尼龍線，再灌注24 h，建立小鼠MCAO模型。

1.4.4 行為學(xué)評(píng)分 行為學(xué)評(píng)分按照Longa等5分制法，于小鼠再灌注24 h后進(jìn)行行為評(píng)分。主要評(píng)分方法如下：無精神損傷癥狀為0分;不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失為4分。

1.4.5 取材 小鼠摘眼球取血，常溫靜置1 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-20℃保存，待測(cè)。小心取腦，于-20℃冰凍30 min，從額極向枕極作厚度為2 mm的冠狀切片5片，置于1%TTC染色液中，37℃避光孵育30 min并掃描，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件計(jì)算小鼠腦梗死率，梗死率=梗死面積/總面積×100%。10%中性甲醛固定腦組織，石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腦海馬齒狀回的形態(tài)學(xué)變化。稱取腦組織濕質(zhì)量，將腦組織放入恒溫干燥箱（105℃）烤72 h，稱取腦組織干質(zhì)量，計(jì)算腦含水量，腦含水量（%）=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.4.6 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)血漿中TNF-α、IL-8含量；WST-1法檢測(cè)SOD活性，TBA法檢測(cè)MDA含量。實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 魚腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠MCAO行為學(xué)評(píng)分的影響 見表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)評(píng)分結(jié)果Tab.1 Results of behavioral evaluation of mice in various group

表1 各組小鼠行為學(xué)評(píng)分結(jié)果Tab.1 Results of behavioral evaluation of mice in various group

注：與假手術(shù)組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01；與辛伐他汀陽性對(duì)照組比較，△p＜0.05；與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，▲p＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組 10 0.00±0.00模型組 10 3.42±0.54**辛伐他汀陽性對(duì)照組 10 2.72±0.75**#魚腥草揮發(fā)油低劑量組 10 2.83±0.42**#魚腥草揮發(fā)油中劑量組 10 2.28±0.25*##魚腥草揮發(fā)油高劑量組 10 2.12±0.22*##△▲

從表1結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，各組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)均顯著升高（p＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組行為學(xué)分?jǐn)?shù)均顯著降低（p＜0.05）。與辛伐他汀組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)顯著降低（p＜0.05）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)顯著降低（p＜0.05）。

2.2 魚腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠MCAO梗死率的影響 從圖1和圖2結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，各組小鼠腦梗死率均明顯升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠腦梗死率均顯著降低（p＜0.01）。與辛伐他汀組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦梗死率顯著降低（p＜0.05）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦梗死率顯著降低（p＜0.05）。

2.3 魚腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠MCAO腦海馬齒狀回的影響 從圖3結(jié)果可見，假手術(shù)組小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞層數(shù)多，飽滿，胞核為圓形或橢圓形，核漿比值大，可見深染的核仁。模型組小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞層次明顯減少，胞體縮小，胞漿濃縮，核仁著色不明顯。與模型組比較，辛伐他汀組和魚腥草給藥組神經(jīng)細(xì)胞排列較緊密，著色較均勻，胞質(zhì)濃染神經(jīng)元明顯減少，而且魚腥草給藥組藥效具有劑量依賴性。

圖1 各組小鼠腦梗死面積觀察Fig.1 Observation of cerebral infarction area in various groups

圖2 各組小鼠腦梗死率觀察Fig.2 Observation of cerebral infarction rate in various groups

2.4 魚腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠MCAO腦水含量的影響 從圖4結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，各組小鼠腦含水量均明顯升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀陽性對(duì)照組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠腦含水量均顯著降低（p＜0.01）。與辛伐他汀陽性對(duì)照組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦含水量顯著降低（p＜0.01）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦含水量顯著降低（p＜0.01）。

圖3 各組小鼠腦海馬齒狀回觀察Fig.3 Observation of hippocampal dentate gyrus in various groups

2.5 魚腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠MCAO血清TNF-α、IL-8的影響 從表2結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，模型組、辛伐他汀陽性對(duì)照組、魚腥草揮發(fā)油低、中劑量組小鼠血清TNF-α和IL-8含量均明顯升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀陽性對(duì)照組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠血清TNF-α和IL-8含量均顯著降低（p＜0.05）。與辛伐他汀陽性對(duì)照組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血清TNF-α和IL-8含量均顯著降低（p＜0.01）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血漿TNF-α和IL-8含量均顯著降低（p＜0.01）。

2.6 魚腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠MCAO血清SOD、MDA的影響 從表3結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，模型組、辛伐他汀陽性對(duì)照組、魚腥草揮發(fā)油低、中劑量組小鼠血清SOD活性顯著降低（p＜0.01），MDA含量顯著升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀陽性對(duì)照組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.05），MDA含量顯著降低（p＜0.05）。與辛伐他汀陽性對(duì)照組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.01），MDA含量顯著降低（p＜0.01）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.01），MDA含量顯著降低（p＜0.01）。

圖4 各組小鼠腦含水量觀察Fig.4 Observation of cerebral water content in various groups

表2 各組小鼠血清TNF-α和IL-8含量變化（Tab.2 Content of TNF-α and IL-8 in serum of various groups（

表2 各組小鼠血清TNF-α和IL-8含量變化（Tab.2 Content of TNF-α and IL-8 in serum of various groups（

注：與假手術(shù)組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01；與辛伐他汀陽性對(duì)照組比較，△△p＜0.01；與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) TNF-α IL-8假手術(shù)組 10 5.52±0.23 6.28±0.69模型組 10 19.28±1.71** 22.23±1.45**辛伐他汀陽性對(duì)照組 10 13.84±1.39**# 14.45±1.41**#魚腥草揮發(fā)油低劑量組 10 15.24±1.56**# 19.22±1.31**##魚腥草揮發(fā)油中劑量組 10 12.31±1.74**## 14.80±1.52**#魚腥草揮發(fā)油高劑量組 10 9.32±1.33##△△▲▲ 9.99±1.25##△△▲▲

3 討論

缺血性腦卒中是一類由腦血流供應(yīng)障礙導(dǎo)致的腦組織缺血、缺氧，繼而引發(fā)局灶性腦組織缺血性損傷或壞死的多發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。而目前臨床上治療缺血性腦卒中的唯一有效方法為快速恢復(fù)血流[2]，但再灌注后反而進(jìn)一步加劇腦損傷即腦缺血再灌注損傷。其致病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚沒完全闡明，其中炎癥和氧化損傷是造成腦缺血再灌注損害的重要機(jī)制[3-4]。辛伐他汀為半合成他汀類藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)[9]辛伐他汀除調(diào)血脂作用外，還具有其他方面的作用，如抗炎、抗氧化等作用。在缺血性卒中、多發(fā)性硬化、Alzheimer病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有廣泛神經(jīng)保護(hù)作用[10]。而且通過對(duì)多種他汀類藥物的比較發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀脂溶性較高，易穿過血-腦屏障且對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用最好[11]，故本研究以辛伐他汀作為陽性對(duì)照藥。

表3 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量變化Tab.3 Activity of SOD and content of MDA in serum of various groups（

表3 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量變化Tab.3 Activity of SOD and content of MDA in serum of various groups（

注：與假手術(shù)組比較，**p＜0.01；與模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01；與辛伐他汀陽性對(duì)照組比較，△△p＜0.01；與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，▲▲p＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) SOD（U/mL） MDA（μmol/L）假手術(shù)組 10 175.22±5.77 8.84±1.32模型組 10 82.20±4.78** 22.18±3.74**辛伐他汀陽性對(duì)照組 10 104.84±5.97**# 17.24±1.53**#魚腥草揮發(fā)油低劑量組 10 99.75±5.36**# 19.25±1.22**#魚腥草揮發(fā)油中劑量組 10 135.26±3.76**## 15.12±1.78**##魚腥草揮發(fā)油高劑量組 10 156.94±3.78##△△▲▲ 12.36±1.37##△△▲▲

本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組小鼠行為學(xué)評(píng)分和腦梗死率明顯升高（p＜0.01），表明模型組腦缺血再灌注損傷嚴(yán)重，提示造模成功。魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠行為學(xué)評(píng)分和腦梗死率明顯降低（p＜0.05），表明魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組可有效改善行為學(xué)和腦神經(jīng)細(xì)胞壞死，從而減輕腦缺血再灌注損傷。辛伐他汀陽性對(duì)照組小鼠也可降低行為學(xué)評(píng)分和腦梗死率（p＜0.05），但效果不及魚腥草揮發(fā)油高劑量組。病理組織學(xué)結(jié)果也顯示魚腥草揮發(fā)油能明顯改善腦腦海馬齒狀回神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化，與上述指標(biāo)相一致。腦水含量是衡量腦缺血再灌注損傷進(jìn)程中的腦水腫嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)抗缺血性腦損傷藥物的重要指標(biāo)之一[12]。本研究法發(fā)現(xiàn)魚腥草給藥組小鼠明顯減輕腦水腫程度（p＜0.01），且呈劑量依賴性。而辛伐他汀陽性對(duì)照組也明顯減輕腦水腫程度（p＜0.01）。TNF-α與IL-8具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞炎癥因子，參與多種組織再灌注損傷，兩者含量高低可反映炎癥嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組小鼠 TNF-α 和 IL-8含量顯著升高（p＜0.01），而給予魚腥草揮發(fā)油可顯著降低血清TNF-α和IL-8含量（p＜0.05），且呈劑量依賴性，表明魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組可明顯減輕腦缺血再灌注損傷所致的炎癥。辛伐他汀陽性對(duì)照組也可降低血清TNF-α 和 IL-8含量（p＜0.05），但效果不及魚腥草揮發(fā)油高劑量組。而SOD與MDA是反映機(jī)體自由基的清除能力及氧化應(yīng)激的損傷程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.01），MDA含量顯著降低（p＜0.01），給予魚腥草揮發(fā)油可顯著升高血清SOD活性（p＜0.05），降低MDA 含量（p＜0.05），且呈劑量依賴性，表明魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷。辛伐他汀陽性對(duì)照組也可升高血清SOD 活性（p＜0.05），降低 MDA 含量（p＜0.05），但效果不及魚腥草揮發(fā)油高劑量組。

綜上所述，魚腥草揮發(fā)油對(duì)腦缺血再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過減輕炎癥和抗過氧化損傷而改善癥狀，其可為臨床抗腦缺血再灌注損傷新藥研究開發(fā)提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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