胰島素抵抗大鼠前列腺微血管新生的實驗研究

米洋 原小斌 張彬 王東文 張旭輝

[摘要] 目的 探討2型糖尿病胰島素抵抗大鼠前列腺微血管新生與良性前列腺增生癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 方法 ①正常對照組大鼠（Normal組，n=15）：8～10周齡正常雄性Wistar大鼠；②單純良性前列腺增生組大鼠（BPH組，n=15）：手術(shù)去勢后外源性給予高劑量雄激素；③胰島素抵抗前列腺增生組大鼠（GK+BPH組，n=15）：8～10周齡自發(fā)型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），手術(shù)去勢后外源性給予高劑量雄激素；④胰島素抵抗前列腺增生血糖干預(yù)組大鼠（GK+BPH+PH組，n=15）：8～10周齡GK大鼠手術(shù)去勢后外源性給予高劑量雄激素，同時給予鹽酸吡格列酮灌胃。光化學法檢測大鼠空腹血糖水平；ELISA雙抗體夾心法檢測大鼠血清胰島素水平及前列腺DHT含量；real-time PCR法檢測大鼠前列腺VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA表達量；免疫組化S-P法檢測前列腺組織CD31表達并根據(jù)陽性結(jié)果計數(shù)MVD。 結(jié)果 ①GK+BPH、GK+BPH+PH組空腹血糖水平及胰島素抵抗指數(shù)高于Normal組及BPH組（P<0.05）；GK+BPH組指標高于GK+BPH+PH組（P<0.05）；Normal組及BPH組上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。BPH組、GK+BPH組、GK+BPH+PH組前列腺組織中DHT含量與Normal組相比明顯增高（P<0.05）；GK+BPH組、GK+BPH+PH組高于BPH組，且GK+BPH組高于GK+BPH+PH組（P<0.05）；②各組前列腺組織中VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA表達量及MVD計數(shù)結(jié)果為GK+BPH組>GK+BPH+PH組>BPH組>Normal組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；③GK+BPH組、GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中DHT含量與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)性顯著。 結(jié)論 2型糖尿病伴胰島素抵抗時，可通過增加前列腺組織DHT的含量從而上調(diào)VEGF、Ang-1、Ang-2的表達，促進前列腺組織局部血管新生以加速良性前列腺增生癥的進展。

[關(guān)鍵詞] 胰島素抵抗；前列腺增生癥；血管內(nèi)皮生長因子；血管生成素；微血管密度

[中圖分類號] R691.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）08-0035-05

Experiment of microvascular angiogenesis of prostate in rats with insulin resistance

MI Yang1 YUAN Xiaobin2 ZHANG Bin2 WANG Dongwen2 ZHANG Xuhui2

1.First School of Clinical Medicine of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Urology， First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To investigate the association between the microvascular angiogenesis and the occurrence and progress of benign prostatic hyperplasia（BPH） in type-2 diabetic rats with insulin resistance（IR）. Methods ①Rats of normal group（n=15）： normal male Wistar rats aged 8 to 10 weeks. ②Rats of BPH group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given after surgical castration. ③Rats with IR and BPH（GK+BPH） group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given to spontaneous non-obese type-2 diabetic Wistar rats（GK rats） aged 8 to 10 weeks. ④Rats of IR and BPH with blood glucose intervened（GK+BPH+PH） group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given to GK rats aged 8 to 10 weeks and pioglitazone hydrochloride was given by intragastric administration. The level of fasting blood glucose in rats was assessed by photochemical method. The levels of serum insulin and DHT in prostate of rats were assessed by double antibody sandwich ELISA. The expression of VEGF， Ang-1 and Ang-2 in prostate of rats was assessed by real-time. The expression of CD31 in prostate tissue was assessed by the S-P immunohistochemical method and MVD was counted based on the positive results. Results ①The level of fasting blood glucose and the IR index in GK+BPH group and GK+BPH+PH group were higher than those in normal group and BPH group（P<0.05）. Those in GK+BPH group were higher than GK+BPH+PH group（P<0.05） while there was no statistical difference between normal group and BPH group（P>0.05）. The level of DHT in the prostate tissue of BPH group， GK+BPH group and GK+BPH+PH group was higher than that in normal group（P<0.05）. That in GK+BPH group and GK+BPH+PH group was higher than BPH group and that in GK+BPH group was higher than GK+BPH+PH group（P<0.05）. ②The levels of mRNA of VEGF， Ang-1 and Ang-2 and the MVD count were： GK+BPH group>GK+BPH+PH group>BPH group>Normal group， with statistical differences between each other（P<0.05）. ③The level of DHT in the prostate tissue of GK+BPH group and GK+BPH+PH group was significantly and positively associated with the IR index（P<0.05）. Conclusion When IR occurred in type-2 diabetes， the level of DHT in prostate tissue could be increased to up-regulate the expression of VEGF， Ang-1 and Ang-2 and promote the microvascular angiogenesis in prostate tissue so as to accelerate the progress of benign prostatic hyperplasia.

[Key words] Insulin resistance； Prostatic hyperplasia； Vascular endothelial growth factor； Angiogenin； Microvessel density

雄激素是前列腺組織中重要的激素，目前研究認為其與良性前列腺增生癥（benign prostatic hyperplasia，BPH）的發(fā)生發(fā)展密不可分[1]。前列腺血管內(nèi)皮細胞是雄激素在前列腺組織中發(fā)揮生物學效應(yīng)的主要靶點之一[2，3]，前列腺增生腺體中的血管過度生成可能與腺體的增生密切相關(guān)[4]。相關(guān)研究已證實，2型糖尿病合并胰島素抵抗（insulin resistance，IR）患者前列腺生長速度及前列腺體積與單純BPH患者相比明顯增高，但其具體機制尚未明確[5]。本研究通過構(gòu)建2型糖尿病胰島素抵抗合并BPH及單純BPH大鼠模型，比較各模型組與正常大鼠前列腺組織中（dihydrotestosterone，DHT）、血管生成素-1（Angiopoietin-1，Ang-1）、血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及微血管密度（microvessel density，MVD）計數(shù)差異，探討2型糖尿病胰島素抵抗與BPH發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型：使用8～10周齡，體重250～300 g，SPF級雄性非胰島素依賴型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），購自于江蘇省常州市卡文斯實驗動物有限公司，許可證號SCXK（蘇）2011-003；其余各組選用同周齡SPF級雄性Wistar大鼠，購自于山西醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（晉）2003-013。所有大鼠均飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級實驗室，標準化飼養(yǎng)房喂養(yǎng)，飼喂標準顆粒飼料，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：T 18℃～22℃，H 50%～70%，日照時間為8：00-20：00。

1.2 主要試劑

鹽酸吡格列酮（Sigma公司，PHR1632）；丙酸睪酮（Sigma公司，BP720）；苯甲酸雌二醇（Sigma公司，E8875）；大鼠胰島素ELISA定量試劑盒（Thermo Fisher公司，ERINS）；大鼠DHT ELISA定量試劑盒（IBL公司，DB52021）；兔抗大鼠CD31單克隆抗體（R&D;公司，AF3628）；Real-time RT PCR試劑盒（Takara公司，RR037A）；羅氏活力型微量血糖儀及試紙。

1.3 方法

1.3.1 單純BPH大鼠造模 8～10周齡Wistar大鼠行去勢手術(shù)，術(shù)前8 h禁食，不禁水，取陰囊正中約1.5 cm橫切口，分別游離左、右側(cè)精索，自附睪頭部近端結(jié)扎精索，切除雙側(cè)睪丸及附睪后還納精索殘端，逐層縫合切口。術(shù)后第3天起，每日皮下注射丙酸睪酮 3 mg/kg，苯甲酸雌二醇0.03 mg/kg，4周后誘導(dǎo)成模。

1.3.2 胰島素抵抗合并BPH造模 8～10周齡GK大鼠隨機驗證空腹血糖≥8.0 mmol/L后，按照上述1.3.1中方法誘導(dǎo)BPH模型。

1.3.3 胰島素抵抗合并BPH血糖干預(yù)組造模 8～10周齡GK大鼠隨機驗證空腹血糖≥8.0 mmol/L后，經(jīng)口灌胃給予鹽酸吡格列酮20 mg/（kg·d），并隨即檢測空腹血糖穩(wěn)定≤6.5 mmol后，按照上述1.3.1中方法誘導(dǎo)BPH模型。

1.3.4 實驗分組及給藥方法 ①正常對照組大鼠（Normal組，n=15）：8～10周齡正常雄性Wistar大鼠；②單純良性前列腺增生組大鼠（BPH組，n=15）：手術(shù)去勢后外源性給予高劑量雄激素；③胰島素抵抗前列腺增生組大鼠（GK+BPH組，n=15）：8～10周齡自發(fā)型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），手術(shù)去勢后外源性給予高劑量雄激素；④胰島素抵抗前列腺增生血糖干預(yù)組大鼠（GK+BPH+PH組，n=15）：8～10周齡GK大鼠給予鹽酸吡格列酮灌胃，同時行手術(shù)去勢后外源性給予高劑量雄激素。

1.4 觀察指標及方法

（1）大鼠空腹血糖測定：禁食8 h后鼠尾尖斷尾采血，使用微量血糖儀測定。（2）胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）測定：采用鼠尾靜脈取血，1000×g離心10 min后吸取上清，按照大鼠胰島素ELISA定量試劑盒說明書操作，于450 nm波長下測定各標準品及樣品吸光光度值，根據(jù)標準曲線及樣品所測得的OD值，計算出相應(yīng)Insulin含量。HOMA-IR=空腹血糖（FGP，mmol/L）×空腹胰島素（FINS，mL U/L）/22.5。（3）大鼠前列腺組織中DHT測定：前列腺組織100 mg經(jīng)液氮冷凍，加入1 mL 0.9% NaCl生理鹽水，1000×g離心10 min后吸取上清，按大鼠DHT ELISA定量試劑盒說明書操作，于450 nm波長下測定各標準品及樣品吸光光度值，根據(jù)標準曲線及樣品所測得的OD值，計算出相應(yīng)樣本DHT含量。（4）大鼠前列腺組織Ang-1、Ang-2、VEGF檢測：前列腺組織約100 mg，經(jīng)液氮冷凍后研磨，加入1 mL Trizol提取總RNA，嚴格按試劑盒說明書方法首先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過SYBR Premix Ex TaqⅡ?qū)崟r熒光定量PCR檢測Ang-1、Ang-2、VEGF的表達，大鼠β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用ABI 7500熒光定量PCR進行檢測。反應(yīng)條件如下：①反轉(zhuǎn)錄 37℃ 15 min→85℃ 5 s→4℃；②Real time PCR stage 1預(yù)變性cycle 1 95℃ 30 s；stage 2 PCR反應(yīng)cycle 40 95℃ 5 s→60℃ 30 s。real-time PCR引物見表1。（5）前列腺CD31檢測并根據(jù)陽性結(jié)果計數(shù)MVD值：前列腺組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水后石蠟包埋后切片，石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后采用SP法免疫組化染色，3%過氧化氫浸泡10 min，山羊血清室溫封閉10 min，加一抗CD31單克隆抗體4℃過夜孵育，加二抗及辣根過氧化物酶37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。各步驟間使用PBS沖洗，陰性對照使用PBS作為一抗。前列腺間質(zhì)區(qū)成棕黃色染色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，均作為一個血管計數(shù)，肌層較厚及管腔面積大于8個紅細胞直經(jīng)的血管不計數(shù)；每張染色切片首先在100倍視野下選擇3個血管最多的前列腺間質(zhì)區(qū)，其后在200倍視野下以CD31陽性表達血管結(jié)果進行MVD計數(shù)。每例標本分別隨機計數(shù)5個視野，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計軟件采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包，計量資料以（x±s）表示，各組之間比較采用單因素方差分析，采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖水平、胰島素抵抗指數(shù)、前列腺組織DHT含量比較

與Normal組相比，GK+BPH組、GK+BPH+PH組空腹血糖水平比較明顯增高（P<0.05），與BPH組空腹血糖水平比較差異不明顯（P>0.05）；與GK+BPH組相比，GK+BPH+PH組空腹血糖水平降低（P<0.05）。

與Normal組相比，GK+BPH組、GK+BPH+PH組胰島素抵抗指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與BPH組胰島素抵抗指數(shù)比較差異不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與GK+BPH組相比，GK+BPH+PH組胰島素抵抗指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

與Normal組相比，BPH組、GK+BPH組、GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中DHT含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與BPH組相比，GK+BPH組、GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中DHT含量增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與GK+BPH組相比，GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中DHT值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2各組前列腺組織Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表達及MVD計數(shù)比較

與Normal組相比，BPH組、GK+BPH組、GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表達均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與BPH組相比，GK+BPH組、GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與GK+BPH組相比，GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中上述三項指標的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

CD31主要表達于前列腺間質(zhì)中血管內(nèi)皮細胞膜及胞漿，表現(xiàn)為棕黃色顆粒。前列腺間質(zhì)中各部分微血管管腔大小、分布密度差異性明顯，以CD31陽性表達血管結(jié)果計數(shù)MVD（圖1）。與Normal組相比，BPH組、GK+BPH組、GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中MVD值明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與BPH組相比，GK+BPH組、GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中MVD值增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與GK+BPH組相比，GK+BPH+PH組大鼠前列腺組織中MVD值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.3大鼠胰島素抵抗指數(shù)與DHT含量相關(guān)性分析

GK+BPH組大鼠胰島素抵抗指數(shù)與DHT含量呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.716（P=0.014<0.05），相關(guān)性顯著；GK+BPH+PH組大鼠胰島素抵抗指數(shù)與DHT含量呈正相關(guān)，Pearson系數(shù)為0.737（P=0.002<0.05），相關(guān)性顯著。

3 討論

良性前列腺增生癥（benign prostate hyperplasia，BPH）是我國中老年男性人群中常見的疾病，與之相關(guān)聯(lián)出現(xiàn)的下尿路癥狀（lower urinary tract symptom，LUTS）包括尿頻、尿急、尿流細線、夜尿增多等癥狀，嚴重影響著中老年患者的生活質(zhì)量[6]。同時，隨著近年來中國人群生活、飲食習慣的改變，2型糖尿病在我國中老年人群已成流行趨勢[7]。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，在合并有2型糖尿病胰島素抵抗的BPH患者中，其前列腺體積增長速度高于單純患BPH的患者[5]，但其機制目前尚不明確。在哺乳動物體內(nèi)，雄性個體內(nèi)的睪酮通過5α還原酶作用，轉(zhuǎn)化為其活性形式——雙氫睪酮（DHT），進而刺激前列腺組織的增生。Vikram[4]及Nandeesha等[8]認為胰島素抵抗大鼠前列腺體積明顯增大可能與前列腺組織中雄激素表達量增高從而促進BPH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

雄激素在前列腺組織中發(fā)揮多種生物學效應(yīng)，研究表明雄激素對前列腺血管內(nèi)皮生長的促進作用是其在前列腺組織中所發(fā)揮的主要作用之一[9]。前列腺中血管內(nèi)皮細胞對雄激素濃度變化極為敏感，予大鼠行去勢手術(shù)后，可觀察到前列腺組織中血管內(nèi)皮細胞早于前列腺上皮出現(xiàn)凋亡[10，11]，外源性給予雄激素后，24 h內(nèi)即可觀察到前列腺血管內(nèi)皮細胞的再生[2]。然而，雄激素并非直接促進前列腺血管內(nèi)皮細胞的增殖，是通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞或其他基質(zhì)細胞所表達的血管相關(guān)生長因子含量，從而實現(xiàn)調(diào)控血管內(nèi)皮細胞增殖[12]。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種強效的內(nèi)皮細胞生長調(diào)控因子，可促進血管生成，現(xiàn)有研究已證明VEGF在前列腺的表達受雄激素含量變化的直接調(diào)控[13]。血管生成素（Angiopoietin，Ang）對誘導(dǎo)血管新生及穩(wěn)定新生血管起重要作用，Ang-1與Ang-2具有相同受體Tie-2，Ang-1與受體結(jié)合后可引起新生血管結(jié)構(gòu)重塑，降低新生血管通透性，穩(wěn)定新生血管結(jié)構(gòu)；Ang-2競爭性結(jié)合Tie-2受體后，可破壞血管內(nèi)皮細胞-基質(zhì)細胞-平滑肌細胞間的平衡，增加血管通透性，對抗Ang-1的血管穩(wěn)定效應(yīng)，促進血管新生[14，15]。Guimin Wang等[9]研究證明，雄激素通過調(diào)控前列腺組織中Ang-1、Ang-2的表達，從而上調(diào)VEGF的表達量，促進前列腺組織中血管的生成。MVD計數(shù)是目前公認評價血管生成的指標，通過應(yīng)用血管內(nèi)皮某些成分的單克隆抗體標記，如CD31、CD34等，進行免疫組化染色，可顯示組織中的微血管，便于MVD計數(shù)。