豬肺炎支原體p97蛋白研究進(jìn)展

劉 璐，劉玉芬

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150025)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬呼吸道疾病綜合征的一種重要因素，可以導(dǎo)致病豬生長(zhǎng)發(fā)育不良、飼料轉(zhuǎn)化率下降等，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前商品化的疫苗并不能阻斷Mhp傳播和動(dòng)物肺部感染[2-5]。疫苗的研制要從致病機(jī)理入手，Mhp感染發(fā)生的第一步是黏附到豬呼吸道細(xì)胞上皮纖毛上，可導(dǎo)致上皮細(xì)胞壞死、纖毛脫落和游走性改變，影響纖毛的清除功能。在黏附過(guò)程中，其表面黏附蛋白發(fā)揮了重要作用。p97是發(fā)現(xiàn)最早而且研究比較深入的纖毛結(jié)合素蛋白，是Mhp主要抗原蛋白之一[6-8]。研究表明,p97蛋白能夠引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生最早的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并且不同毒力株的p97R1區(qū)基因重復(fù)序列和菌株黏附能力存在一定關(guān)系[9-10]。由此可見(jiàn)，p97可以用于Mhp感染的早期診斷和不同毒株毒力強(qiáng)弱的分析及疫苗的研制。

1 p97的分子結(jié)構(gòu)特征

Zhang Qijing等[11]最先利用單克隆抗體鑒定出p97蛋白，并指出p97位于Mhp膜表面，對(duì)呼吸道黏膜纖毛具有黏附功能。Hsu T等[12]對(duì)p97基因DNA測(cè)序分析后指出，p97結(jié)構(gòu)基因編碼一個(gè)124.9 ku的蛋白，該蛋白通過(guò)蛋白水解加工至102.9 ku，經(jīng)處理的多肽在SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)顯示為97 ku的蛋白。推定RNA聚合酶結(jié)合區(qū)位于ATG起始密碼子上游145 bp處。蛋白質(zhì)有非常少的疏水區(qū)， 單個(gè)由17個(gè)氨基酸組成的疏水區(qū)域即可跨越氨基末端的膜。該蛋白有兩個(gè)重復(fù)序列位于C端，其中一個(gè)有15個(gè)連續(xù)重復(fù)的5氨基酸(AAKPV/E)序列，即R1區(qū)；另一個(gè)是由4個(gè)連續(xù)重復(fù)的10氨基酸(GTPNQGKKAE)序列構(gòu)成的R2區(qū)。Hsu T等[13]進(jìn)一步圍繞p97結(jié)構(gòu)基因的DNA序列分析，揭示了由兩個(gè)開(kāi)放閱讀框組成的操縱元，p97和一個(gè)編碼102.3 ku蛋白的p102。通過(guò)雜交分析和亞克隆試驗(yàn)得出p97蛋白編碼基因以單拷貝存在于豬肺炎支原體染色體上。Hsu T等[14]在體外利用微量滴定板黏法定量測(cè)定截短的p97基因產(chǎn)物對(duì)支原體黏附能力以鑒定纖毛結(jié)合位點(diǎn)，研究表明，纖毛結(jié)合位點(diǎn)位于p97基因AAKPV(E)重復(fù)序列中，簡(jiǎn)稱(chēng)R1重復(fù)。Minion F C等[15]通過(guò)免疫印跡分析得出纖毛結(jié)合至少需要8個(gè)p97蛋白R(shí)1區(qū)重復(fù)基元，3個(gè)重復(fù)基元是抗體識(shí)別所必須的。在沒(méi)有至少8個(gè)重復(fù)的R1區(qū)存在的情況下，位于R1區(qū)附近的R2區(qū)可能起到協(xié)助結(jié)合豬纖毛的作用。隨后，有研究報(bào)道R1、R2區(qū)在Mhp不同株中序列高度保守。Yang Wenjen等[16]利用噬菌體展示肽庫(kù)和能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的噬菌體表位對(duì)Mhp表位作圖，利用A蛋白從兔抗Mhp高免疫血清中純化得到的抗體IgG對(duì)噬菌體展示的隨機(jī)肽庫(kù)進(jìn)行篩選，并對(duì)篩選出的陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示出有大量的模擬表位出現(xiàn)在p97序列不同位置上，并且多數(shù)集中在p97蛋白C末端的R1和R2區(qū)域。用含有p97 R1序列的陽(yáng)性噬菌體克隆對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)免疫和鼻內(nèi)接種，獲得的抗血清經(jīng)Western blot分析主要與p97蛋白反應(yīng)，并且可以抑制Mhp的生長(zhǎng)，進(jìn)一步確定了p97蛋白R(shí)1區(qū)存在Mhp的關(guān)鍵表位。

2 p97蛋白的免疫原性

為鑒定在真核細(xì)胞表達(dá)的p97蛋白的免疫原性，王凱等[17]構(gòu)建了MhpR659株p97基因重組腺病毒Ad-p97，用其在PK15細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物接種小鼠，獲得的抗Ad-p97血清能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在Mhp表面的黏附位點(diǎn)，抑制Mhp與宿主細(xì)胞的結(jié)合。Ad-p97免疫豬后可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生特異性抗體。陳超等[18]將構(gòu)建成功的p97 C末端基因重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞以獲得高滴度、高純度的重組腺病毒，利用小鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果表明該重組質(zhì)粒肌肉注射小鼠刺激小鼠產(chǎn)生了特異性體液免疫，滴鼻可誘發(fā)體液免疫和黏膜免疫，但不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，說(shuō)明了p97蛋白具有良好的免疫原性。

3 p97蛋白與Mhp的檢測(cè)

目前，檢測(cè)Mhp的方法主要有分離培養(yǎng)、PCR及血清學(xué)檢測(cè)等。支原體較難分離培養(yǎng)，且生長(zhǎng)速度緩慢，此方法耗時(shí)久、效率低[19-20]。普通PCR檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度和實(shí)用性，且花費(fèi)少，但敏感性低，無(wú)法對(duì)未知樣本進(jìn)行定量[19,21-22]。天然感染的豬血清ELISA檢測(cè)不能用于抗體血清轉(zhuǎn)化前的早期感染，而且常見(jiàn)的IDEXX血清學(xué)試劑盒價(jià)格昂貴，不適合用于大范圍的檢測(cè)[23]。熒光定量PCR檢測(cè)方法具有操作方便、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，武昱牧等[24]以p97基因的保守序列為模板設(shè)計(jì)了引物和探針，建立了TaqMan-BHQ熒光定量PCR檢測(cè)方法。在擴(kuò)增豬其他常見(jiàn)病原體時(shí)無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，具有良好的特異性，為豬支原體肺炎的診斷提供了技術(shù)儲(chǔ)備。Feng Zhixin等[25]通過(guò)對(duì)豬體內(nèi)抗p97 R1、p36、p46的血清IgG抗體和呼吸道黏膜SIgA抗體的動(dòng)力學(xué)研究，在感染后抗P36、抗P46應(yīng)答進(jìn)展緩慢，而p97抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)化發(fā)生較快，試驗(yàn)感染早期即可檢測(cè)到針對(duì)p97R1的抗體IgG，同時(shí)發(fā)現(xiàn)針對(duì)p97R1的黏膜抗體SIgA濃度最高。系統(tǒng)免疫應(yīng)答發(fā)生較晚持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，而黏膜反應(yīng)則相反。由于黏膜免疫反應(yīng)最早出現(xiàn)的是SIgA抗體，它能夠阻斷病原體和黏膜細(xì)胞表面上受體之間相互作用，而且不會(huì)在無(wú)活性疫苗單獨(dú)接種后產(chǎn)生。Feng Zhixin等[26]又將p97R1區(qū)在大腸埃希菌中的表達(dá)產(chǎn)物作為包被抗原建立了SIgA-ELISA方法用于檢測(cè)Mhp感染的試劑盒，其靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性較高。與商品化IgG-ELISA試劑盒相比，該試劑盒可以成功區(qū)分Mhp感染豬和疫苗接種豬。

4 p97蛋白與疫苗研發(fā)

Shimoji Y等[27]用減毒的YS-19株豬紅斑丹毒絲菌遞送p97蛋白C末端部分到豬呼吸道黏膜表面，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)肺部病變的組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組豬相比，YS-19疫苗免疫豬肺部病變程度大大降低。然而研究者未在任何免疫豬的血清中檢測(cè)到抗p97的IgG、IgM和IgA抗體,但在用p97蛋白免疫豬后第7天，YS-19免疫的豬外周血單核細(xì)胞的刺激指數(shù)明顯高于對(duì)照組，由此推測(cè)YS-19株的鼻內(nèi)疫苗可能誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生針對(duì)p97蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答。Okamba F R等[28]發(fā)現(xiàn)攜帶p97C端R1、R2區(qū)的重組復(fù)制缺陷型腺病毒亞單位疫苗接種豬后能夠在豬體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)p97C重組蛋白的特異性黏膜以及全身性免疫應(yīng)答，在接種動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)為產(chǎn)生較高水平的p97C特異性抗體IgG以及血清和唾液中的抗體IgA，甚至在豬出現(xiàn)炎癥之前。而且，接種豬宏觀肺部病變、從組織中回收的豬肺炎支原體的量、局部炎癥都有所減少。de Oliveira N R等[5]將包括p97R1蛋白在內(nèi)的四種抗原蛋白制成菌苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)該嵌合蛋白能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性抗體IgG。此外，在一些研究報(bào)道中，用重組p97作為亞單位疫苗、融合到黏膜佐劑、與減毒細(xì)菌或病毒載體結(jié)合免疫豬后，成功緩解了支原體肺炎的病情。這些結(jié)果說(shuō)明了p97蛋白可作為疫苗研發(fā)的候選蛋白。

5 小結(jié)

由于豬支原體肺炎具有持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、難治愈、常誘發(fā)患病豬其他病原體感染等特點(diǎn)，因此對(duì)于該病的早期診斷試劑盒的研發(fā)和疫苗研制工作均迫在眉睫。p97蛋白作為Mhp最主要的抗原黏附蛋白，許多研究均證實(shí)其具有良好的免疫原性，然而其在Mhp感染過(guò)程中的致病機(jī)制依然不得而知。盡管p97 R1區(qū)已被證實(shí)具有黏附纖毛的功能，但Mhp感染是多種黏附蛋白共同發(fā)揮作用導(dǎo)致的。以單獨(dú)的p97抗原作為Mhp疫苗，雖然能夠誘導(dǎo)血清抗體的產(chǎn)生，但只能對(duì)豬起到部分免疫保護(hù)作用。因此，將p97與其他Mhp抗原蛋白共同用于疫苗的研發(fā)是否可以提高疫苗的免疫原性，以及p97蛋白在Mhp感染過(guò)程中的機(jī)制依然有待更深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Michiels A,Arsenakis I,Boyen F,et al.Efficacy of one dose vaccination against experimental infection with twoMycoplasmahyopnumoniaestrains[J].BMC Vet Res,2017,13(1)：274.

[2] Fisch A,Marchioro S B,Gomes C K,et al.Commercial bacterins did not induce detectable levels of antibodies in mice againstMycoplasmahyopneumoniaeantigens strongly recognized by swine immune system[J].Trials Vaccinol,2016,5:32-37.

[3] Woolley L K,Fell S A,Gonsalves J R,et al.Evaluation of recombinantMycoplasmahyopneumoniaeP97/P102 paralogs formulated with selected adjuvants as vaccines against mycoplasmal pneumonia in pigs[J].Vaccine,2014,32(34):4333-4341.

[4] Virginio V G,Bandeira N C,dos Anjos Leal F M,et al.Assessment of the adjuvant activity of mesoporous silica nanoparticles in recombinantMycoplasmahyopneumoniaeantigen vaccines[J].Heliyon,2017,3(1):e00225.

[5] de Oliveira N R,Jorge S,Gomes C K,et al.A novel chimeric protein composed of recombinantMycoplasmahyopneumoniaeantigens as a vaccine candidate evaluated in mice[J].Vet Microbiol,2017,201:146-153.

[6] 涂君平，王曉謙，蔣會(huì)會(huì),等.豬肺炎支原體膜蛋白特點(diǎn)及其致病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(3)：73-76.

[7] 付啟歡，丁紅雷，吳建云.豬支原體肺炎疫苗研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016,36(7)：1251-1255.

[8] 車(chē)巧林，余珊珊，劉茂軍,等.豬肺炎支原體對(duì)豬氣管上皮細(xì)胞的黏附作用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015,35(3)：388-393.

[9] 黎珂鈺，趙 武，李 斌,等.廣西陸川豬豬肺炎支原體P97基因 R1區(qū)克隆及序列分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015,42(9)：2270-2277.

[10] 劉茂軍，邵國(guó)青，張 映.豬肺炎支原體不同毒力株黏附因子基因序列分析 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) ，2010(3)：522-525.

[11] Zhang Qijing,Young T F,Ross R F.Identification and characterization of aMycoplasmahyopneumoniaeadhesin[J].Infect Immun,1995,63(3):1013-1019.

[12] Hsu T,Sergey A,Minion F C.Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesin gene ofMycoplasmahyopneumoniae[J].J Bacteriol,1997,179(4):1317-1323.

[13] Hsu T,Minion F C.Molecular analysis of the P97 cilium adhesin operon ofMycoplasmahyopneumoniae[J].Gene,1998,214:13-23.

[14] Hsu T,Minion F C.Identification of the cilium binding epitope of theMycoplasmahyopneumoniaeP97 adhesin[J].Infect Immun,1998,66:4762-4766.

[15] Minion F C,Adams C,Hsu T.R1 Region of P97 mediates adherence ofMycoplasmahyopneumoniaeto swine cilia[J].Infect Immun,2003,21:532-537.

[16] Yang Wenjen，Lai Jenfeng,Peng Koucheng,et al.Epitope mapping ofMycoplasmahyopneumoniaeusing phage displayed peptipe libraries and the immune responses of the selected phagotopes[J].J Immunol Methods,2005,304:15-29.

[17] 王 凱,楊青春,陳紹紅,等.豬肺炎支原體p97基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫原性[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2015,45(11):1114-1121.

[18] 陳 超,李 媛,郭 丹,等.豬肺炎支原體p97 C末端基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫效果[J].微生物學(xué)報(bào),2009(4):0465-0470.

[19] 武昱牧，熊祺琰，劉蓓蓓,等.豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017,48(8)：1491-1498.

[20] 魏晶晶，李聰研，孫亞波,等.豬肺炎支原體S株的分離與鑒定[J].中國(guó)獸藥雜志，2016,50(2)：15-21.

[21] 師麗剛，周 飛.豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016(9)：11-15.

[22] Liu Maojun,Su Dongmei,Zhou Yongqi,et al.Development and application of a quantitative competitive PCR assay for detectingMycoplasmahyopneumoniae[J].Agr Sci Tech,2015,16(5):940-944.

[23] Pieters M,Daniels J,Rovira A.Comparison of sample types and diagnostic methods forinvivodetection ofMycoplasmahyopneumoniaeduring early stages of infection[J].Vet Microbiol,2017,203:103-109.

[24] 武昱牧,靳蒙蒙,白方方,等.豬肺炎支原體P97TaqMan-BHQ熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2012(12):1268-1272.

[25] Feng Zhixin,Bai Yun,Yao Jingting,et al.Use of serological and mucosal immune responses toMycoplasmahyopenumoniaeantigens P97R1,P46 and P36 in the diagnosis of infection[J].Vet J,2014,202(1):128-133.

[26] Feng Zhixin,Shao Guoqing,Liu Maojun,et al.Development and validation of a SIgA-ELISA for the detection ofMycoplasmahyopneumoniaeinfection[J].Vet Microbiol,2010,143(2-4):410-416.

[27] Shimoji Y,Oishi E,Muneta Y,et al.Vaccine efficacy of the attenuatedErysipelothrixrhusiopathiaeYS-19 expressing a recombinant protein ofMycoplasmahyopneumoniaeP97 adhesin against mycoplasmal pneumonia of swine[J]Vaccine,2003,21:532-537.

[28] Okamba F R,Arella M,Music N,et al.Potential use of a recombinant replication-defective adenovirus vector carrying the C-terminal portion of the P97 adhesin protein as a vaccine againstMycoplasmahyopneumoniaein swine[J].Vaccine,2010,28:4802-4809.