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    我國部分地區(qū)奶牛乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

    2018-04-25 01:17:30王麗芳馮小慧張三粉姚一萍
    動物醫(yī)學進展 2018年3期
    關鍵詞:革蘭葡萄球菌耐藥性

    杜 琳,王麗芳,馮小慧,張三粉,宋 潔,姚一萍,史 培,申 捷

    (1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院,內蒙古呼和浩特 010010;2.內蒙古自治區(qū)疫病預防控制中心,內蒙古呼和浩特 010010)

    全球范圍內,奶牛乳房炎是影響奶業(yè)發(fā)展的重要因素之一。每年因乳房炎造成的經(jīng)濟損失巨大,每年全球因奶牛乳房炎損失將近350億美元[1],其中美國損失20億美元[2],英國損失3億英鎊[3],荷蘭每頭牛因患乳房炎損失114歐元[4],我國每年損失150億元~450億元[5]。目前治療奶牛乳房炎主要依賴于抗生素的使用,從而導致藥物殘留等問題[6],威脅著我國的食品安全。奶牛乳房炎及其致病菌對奶牛的高感染率和強耐藥性,已經(jīng)嚴重制約奶業(yè)的健康發(fā)展,而且由于其流行范圍廣、感染部位多、多重耐藥性等也給臨床防治帶來巨大的困難[7]。我國奶業(yè)在奶牛乳房炎病原菌的防控和獸藥殘留方面面臨的問題尤為嚴峻。因此,為摸清我國奶牛被病原菌感染情況和耐藥情況,急需開展奶牛乳房炎病原菌的耐藥性風險評估,其研究成果不僅將為獸醫(yī)臨床用藥提供可靠的理論依據(jù),防止濫用抗生素,而且將為控制細菌耐藥性的擴散提供幫助。同時通過開展不同地域奶牛感染病原菌情況的了解,掌握各地區(qū)不同病原菌的感染率,將為國家政府部門有目的、有計劃、有步驟的開展病原菌防控和獸藥殘留監(jiān)管提供指導意見[8]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 奶樣 對我國生鮮乳主產(chǎn)省區(qū)黑龍江、內蒙、山東、河北及上海5個省(市、自治區(qū))共247批次患乳房炎(包括臨床乳房炎與隱性乳房炎)病牛乳樣。每個省(市、自治區(qū)),選擇4種規(guī)模的牧場奶牛存欄:①500頭以下;②500頭~ 1 000頭;③1 000頭~3 000頭;④大于3 000頭,每個類型10個~15個,其中內蒙古、黑龍江、上海、河北各50份樣本,山東47份。采樣時棄去前3把乳,無菌取乳樣50 mL左右,4℃保存待檢。

    1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 綿羊脫纖血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,青島海博生物技術有限公司產(chǎn)品;氟苯尼考、氨曲南、利福平、氧氟沙星、復方新諾明、氯霉素、萬古霉素、頭孢西丁、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、克林霉素、苯唑西林、妥布霉素、利奈唑胺、美羅培南、奧格門汀、紅霉素、氨芐西林、頭孢噻呋、阿奇霉素、哌拉西林,由上海星佰生物技術有限公司定制成革蘭陽性菌藥敏板、革蘭陰性菌藥敏板。藥敏試驗藥物的選擇參考美國臨床與實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)和農業(yè)部奶產(chǎn)品質量風險評估實驗室(北京)提出的藥敏試驗方案制定的藥敏試驗標準;2×EasyTaq?PCR Super Mix、細菌基因組DNA小量純化試劑盒,北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品;DNA標準DL 2 000、Agarose,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 取1 mL無菌采集的牛奶樣本,3 000 r/min離心10 min,去除上層脂肪層,取菌體沉淀,用滅菌棉拭子分別于綿羊脫纖血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB 培養(yǎng)基)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落形態(tài)。挑取疑似菌落染色鏡檢、進行純培養(yǎng)。并對分離獲得的流行菌株編號,對其分離時間、分離地點等信息進行記錄歸檔。

    1.2.2 分子生物學鑒定

    1.2.2.1 細菌基因組DNA的小量提取 參照全式金提取細菌基因組DNA小量純化試劑盒說明書進行。

    1.2.2.2 16 S rDNA基因的PCR擴增 以提取出的細菌基因組DNA為模板,根據(jù)GenBank上的DNA序列設計[9]通用引物,其引物序列為:Bacterial 16s-F:ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT,Bacterial 16s-R:CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT。反應程序為:94℃ 5 min;94℃ 45 s,55℃ 45 s,75℃ 90 s,反應進行30個循環(huán);72℃ 10 min。預期目的條帶大小為1 500 bp。

    1.2.2.3 PCR產(chǎn)物的基因測序及序列分析 將PCR產(chǎn)物純化后連接pEasy-T1載體上,轉化至Trans-T1感受態(tài)細胞中,選取陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。所測基因序列與GenBank中已有序列進行Blast同源性比對。

    1.2.3 藥敏試驗 對分離出的主要病原菌進行藥敏試驗,按照CLSI推薦的肉湯稀釋法進行,用大腸埃希菌標準菌株(ATCC25922)作為質控菌,根據(jù)CLSI(2016)的標準判斷其耐藥性[10]。

    2 結果

    2.1 細菌的形態(tài)學鑒定結果

    對分離到的菌株進行形態(tài)學鑒定,金黃色葡萄球菌在高鹽甘露醇培養(yǎng)基上顯黃色,其外圍有一黃色的暈環(huán)。鏈球菌在50 mL/L綿羊脫纖血瓊脂平板上呈淡灰白色、隆起、閃光的小菌落。大腸埃希菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落中心呈紫黑色,有金屬光澤??死撞暇邴溈祫P培養(yǎng)基上呈紅色,用接種環(huán)挑取,有明顯的拉絲現(xiàn)象。

    革蘭染色并在油鏡下進行鏡檢,金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)革蘭陽性的球菌,排列成葡萄串狀。鏈球菌呈現(xiàn)革蘭陽性球菌,鏈狀排列。大腸埃希菌呈現(xiàn)革蘭陰性直桿菌,兩端鈍圓。克雷伯菌呈現(xiàn)較粗短的革蘭陰性桿菌。

    2.2 分子生物學鑒定結果

    用通用引物對分離株進行細菌16 S rDNA基因擴增,所得產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳,均擴增出1 500 bp大小的片段。在NCBI上進行Blast比對。其中大腸埃希菌65株,占 37.14%;金黃色葡萄球菌30株,占17.14%;糞腸球菌21株,占12.00%;克雷伯菌18株,占10.29%;鏈球菌13株,占7.43%;檸檬酸桿菌12株,占6.86%;腐生葡萄球菌5株,占2.86%;變形桿菌4株,占2.29%;黏質沙雷菌3株,占1.71%;表皮葡萄球菌2株,占1.14%;產(chǎn)色葡萄球菌1株,占0.57%;鄉(xiāng)間布丘菌1株,占0.57%。每個省(市、自治區(qū))的細菌分離情況見表1。

    2.3 藥敏試驗結果

    2017年上半年共采集黑龍江省、內蒙古自治區(qū)、河北省、上海市及山東省5個省(市、自治區(qū))247批次患病乳房炎奶牛乳樣,分離出革蘭陽性菌72株。對分離的革蘭陽性菌進行藥敏性試驗,以確定其耐藥情況。

    本年度調研中用于革蘭陽性菌耐藥性試驗的20種藥物來自11大類藥物,其中β內酰胺類7種、氨基糖苷類2種,四環(huán)素類1種,磺胺類1種,喹諾酮類2種,林可酰胺類1種,大環(huán)內酯類2種,氯霉素類1種,糖肽類1種,噁唑烷酮類1種,安莎霉素類1種。

    革蘭陽性菌的藥敏試驗結果見表2。本次試驗分離到的革蘭陽性菌大部分具有不同程度的耐藥性,并且大多數(shù)為多重耐藥菌,其中耐單一藥物的6株,耐藥種類數(shù)最多的只有1株,能夠耐受11種藥物。單種藥物藥敏結果表明,所分離得到革蘭陽性菌對氨曲南的耐藥率最高,達到了100%,其次為青霉素(80.56%)、氟苯尼考(56.94%)、紅霉素(52.78%)、氧氟沙星(43.06%)、頭孢西丁(43.06%)、美羅培南(43.06%)、克林霉素(43.06%)和妥布霉素(40.28%)耐藥率均高于40%。耐藥率低于10%的為萬古霉素(全部敏感)、苯唑西林(全部敏感)、利奈唑胺(全部敏感)、奧格門汀(全部敏感)、復方新諾明(2.78%)、氯霉素(2.78%)、環(huán)丙沙星(6.94%)和氨芐西林(9.72%)。

    表1 各個地區(qū)的細菌分布情況

    表2 革蘭陽性菌的藥敏試驗結果

    2017年上半年共采集黑龍江省、內蒙古自治區(qū)、河北省、北京市、上海市、山東省及四川省等5個省市自治區(qū)247批次患病乳房炎奶牛乳樣,分離出革蘭陰性菌103株。對分離的革蘭陰性菌進行藥敏性試驗,以確定其耐藥情況。

    本年度調研中用于耐藥性試驗的15種藥物來自7大類藥物,其中β內酰胺類7種,氨基糖苷類1種,四環(huán)素類1種,磺胺類1種,喹諾酮類2種,氯霉素類2種,大環(huán)內酯類1種。

    革蘭陰性菌的藥敏試驗結果見表3。本次試驗分離到的革蘭陰性菌大部分具有不同程度的耐藥性,并且大多數(shù)為多重耐藥菌,其中,耐單一藥物的8株(7.77%)。耐藥種類數(shù)最多的只有2株,能夠耐受10種藥物。單種藥物藥敏結果表明,所分離得到革蘭陰性菌對氨芐西林的耐藥性最高,達到了83.50%,其次為氟苯尼考(44.66%)、四環(huán)素(43.69%)耐藥率均高于40%。耐藥率低于10%的有美羅培南(全部敏感)、頭孢西丁(5.83%)和氨曲南(9.71%)。

    3 討論

    本試驗從黑龍江、內蒙、山東、河北和上海等地區(qū)共計247份乳房炎乳樣中分離到到細菌 175 株,通過形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定。確定最終分離到大腸埃希菌65株,金黃色葡萄球菌30株,糞腸球菌21株,克雷伯菌18株,鏈球菌13株,檸檬酸桿菌12株,腐生葡萄球菌5株,變形桿菌4株,黏質沙雷菌3株,表皮葡萄球菌2株,產(chǎn)色葡萄球菌1株,鄉(xiāng)間布丘菌1株。這說明乳房炎不僅僅是由單一細菌引起的,而是由多種細菌共同感染導致[11]。其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、克雷伯菌為奶牛乳房炎的主要病原菌。

    從每個省(市、自治區(qū))的細菌分離情況來看,細菌分布呈現(xiàn)明顯的區(qū)域性[12]。其中內蒙古地區(qū)大腸埃希菌的分離率明顯高于其他4個地區(qū),大腸埃希菌是引起乳房炎最重要的環(huán)境致病菌,大腸埃希菌廣泛存在于牛群的環(huán)境之中。牛舍中的糞便和牛床墊料都存在環(huán)境性病原菌,在擠奶、擠奶間歇期及干奶期時乳腺組織均可被感染,由于奶牛不斷地與環(huán)境中的病原菌接觸,加之在內蒙古地區(qū)采樣前不久,剛剛下過雨,這可能導致了奶牛的牛床和運動場較為泥濘,加重了大腸埃希菌等環(huán)境性致病菌的感染[13]。黑龍江地區(qū)的金黃色葡萄球菌分離率明顯高于其他4個地區(qū),金黃色葡萄球菌則是引起奶牛乳房炎最重要的傳染性病原菌,金黃色葡萄球菌對乳腺組織有高度的親和力,主要損害乳房上皮細胞和腺泡的功能,導致牛奶產(chǎn)量和質量下降[14]。河北地區(qū)的病原菌則以糞腸球菌為主,糞腸球菌是哺乳動物的正常菌群的一部分,當奶牛乳頭閉鎖不全或受損時,糞腸球菌機會性的侵入乳房,引起感染。

    表3 革蘭陰性菌的藥敏試驗結果

    本研究通過藥物敏感性試驗進行分析,結果表明乳房炎病原菌對臨床上使用的抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性,尤其革蘭陽性菌對氨曲南、青霉素、氟苯尼考、紅霉素、氧氟沙星、頭孢西丁、美羅培南、克林霉素及妥布霉素耐藥。革蘭陰性菌對氨芐西林、氟苯尼考及四環(huán)素耐藥。因此,在使用獸藥時應根據(jù)各地區(qū)流行菌株的耐藥特點,選擇敏感性高的藥物。

    目前,細菌的耐藥性已得到了國內和國際上的廣泛關注[15-16],我國為了加強獸用抗菌藥物管理,保障動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全,我國農業(yè)部獸醫(yī)局在2017年組織起草了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃(2017年-2020年)》,對生鮮乳中主要病原微生物的分離鑒定以及耐藥性的檢測,為獸藥殘留監(jiān)控、動物源性細菌耐藥監(jiān)測、監(jiān)管體系建設與完善提供專業(yè)指導,為牧場和奶牛的飼養(yǎng)管理提供更切實有效的用藥方案,切實保障養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動物性食品安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)環(huán)境安全。

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