赤土茯苓苷對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠應(yīng)激性胃潰瘍的保護(hù)作用

馮小東

(西安石油大學(xué)體育系，陜西西安 710065)

適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)能夠使人機(jī)體免疫力增強(qiáng)，還能調(diào)節(jié)心理情緒，從而促進(jìn)身心健康。應(yīng)激性胃潰瘍是指機(jī)體創(chuàng)傷或者嚴(yán)重全身感染時(shí)引發(fā)的急性胃炎，屬于一種急性胃黏膜病變[1]。近年來(lái)，應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)病率越來(lái)越高。對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍的防治是當(dāng)務(wù)之急。土茯苓(Smilaxglabra)是一種天然中藥材，是隸屬于百合科的干燥根莖。赤土茯苓是土茯苓的一種，醫(yī)學(xué)上常用作解毒等。赤土茯苓苷(Smiglabrin)是從赤土茯苓中提取并分離出來(lái)的一種單體黃酮苷類有效成分，研究發(fā)現(xiàn)赤土茯苓苷對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍有保護(hù)作用[2-4]。本文選取60只雄性小鼠，隨機(jī)分為生理鹽水組、草藥組、粗品組及3組赤土茯苓苷組(SmiⅠ組、SmiⅡ組、SmiⅢ組)，連續(xù)灌胃10 d后觀察小鼠胃部的潰瘍情況，評(píng)價(jià)6組小鼠胃黏膜出血量、胃黏膜Se-GSH-Px活性以及顯微鏡下胃部潰瘍指數(shù)和出血點(diǎn)數(shù)。通過(guò)5個(gè)指標(biāo)來(lái)討論赤土茯苓苷對(duì)運(yùn)動(dòng)后應(yīng)激性胃潰瘍的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 赤土茯苓，購(gòu)自安國(guó)市華仁藥材有限公司；甲醛、乙酸乙酯、乙醇、石油醚、聚酰胺粉、甲醇，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取出生2個(gè)月以上，體重在23.1 g～27.2 g的成年小鼠60只，雄性，品系為C57BL/6。

1.1.3 主要設(shè)備 解剖鏡(奧林巴斯解剖鏡SZX16型)，購(gòu)自上海賴氏電子科技有限公司；顯微鏡(SEZ-300體視顯微鏡)，購(gòu)自深圳市法尼奧科技有限公司；紫外分光光度計(jì)(752N)，購(gòu)自上海科曉科學(xué)儀器有限公司；石蠟組織切片機(jī)(202c)，購(gòu)自邢臺(tái)慧思科技有限公司；H.H.S電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 粗品制備 將購(gòu)置的赤土茯苓直接用粉碎機(jī)粉碎后用乙醇反復(fù)提取7次，將濾液合并減壓回收。取一部分減壓回收物用甲醇重結(jié)晶得到粗品。

1.2.2 赤土茯苓苷制備 ①粗品制備剩余濾液減壓回收物收集備用；②將粗品提取過(guò)程中所得濾渣用乙醇重新提取7次，冷卻后過(guò)濾，將濾液合并減壓回收；③將第1、2步驟所得減壓回收物分別同時(shí)處理，在減壓回收物中加入5倍水稀釋后用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯萃取得萃取液。隨后，將兩部分萃取液合并，繼續(xù)減壓濃縮；④將③所得物用聚酰胺粉攪拌均勻，濕法上柱，水和乙醇梯度洗脫合并相同部分收集物，減壓回收溶劑，甲醇重結(jié)晶，所得提取物經(jīng)色譜分析檢測(cè)即為赤土茯苓苷[5]。

1.2.3 試驗(yàn)方案 將小鼠隨機(jī)分為6組，生理鹽水組、草藥組、粗品組及3組赤土茯苓苷組(SmiⅠ組、SmiⅡ組、SmiⅢ組)。生理鹽水組每次服用生理鹽水2 mL，草藥組每次服用300 mg直接粉碎的赤土茯苓，粗品組每次服用300 mg制備粗品，赤土茯苓苷組又分為SmiⅠ組給藥量300 mg、SmiⅡ組給藥量200 mg和SmiⅢ組給藥量100 mg。人為給小鼠制造水浸應(yīng)激環(huán)境，全部小鼠連續(xù)灌胃給藥10 d，第10次灌胃后讓小鼠禁食24 h，再進(jìn)行灌胃給藥1次，隨后將全部小鼠四肢固定浸在電熱恒溫水浴鍋中，使水面處于小鼠劍突部，水溫設(shè)置為21℃，24 h后松開(kāi)小鼠四肢后處死，先將0.5 mL 10 mL/L甲醛溶液注入到小鼠胃里，15 min后將小鼠胃取出。隨后沿著胃大彎處解剖，小心清潔胃部?jī)?nèi)容物，首先測(cè)定GMBF，后置于載玻片上展平觀察整個(gè)胃部出血點(diǎn)以及潰瘍指數(shù)。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)

1.2.4.1 潰瘍抑制率 潰瘍抑制率[6]為對(duì)照組的潰瘍指數(shù)與試驗(yàn)組之差占對(duì)照組潰瘍指數(shù)的百分比。公式：潰瘍抑制率=(空白組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù))/空白組潰瘍指數(shù)〕×100%

1.2.4.2 胃黏膜Se-GSH-Px活性 DTNB法觀察胃黏膜GSH水平能夠有效評(píng)價(jià)小鼠胃部脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)情況。

1.2.4.3 胃黏膜血流量GMBF 用LDF100C激光多普勒血流測(cè)定模塊得TSD143表面型探頭分別置于潰瘍邊緣面的4個(gè)不同部位，每個(gè)部位1 min，測(cè)定4個(gè)數(shù)據(jù)的平均值為胃黏膜血流量，結(jié)果以血流灌注單位BPU表示[7]。

1.2.5 切片制作方法 用針管先將10 mL/L的甲醛0.5 mL注入胃中，15 min后取胃，沿胃大彎剖 開(kāi)，緩慢沖凈胃內(nèi)容物，放于載玻片上展平，取腺胃部制作切片，HE染色，病理組織觀察。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 赤土茯苓苷對(duì)水浸應(yīng)激所致小鼠胃潰瘍的影響

每個(gè)小鼠都進(jìn)行應(yīng)激環(huán)境處理，將每組10只小鼠的胃潰瘍指數(shù)和出血點(diǎn)數(shù)均取平均值匯總?cè)绫?所示。從表1中可以看出，SmiⅠ組、SmiⅡ組和SmiⅢ組的潰瘍指數(shù)和出血點(diǎn)都明顯低于其他3組，草藥組和粗品組的潰瘍指數(shù)低于生理鹽水對(duì)照組。

從6組小鼠胃部潰瘍指數(shù)分布圖1可以發(fā)現(xiàn)，每組間10只小鼠的潰瘍指數(shù)并無(wú)顯著規(guī)律，說(shuō)明具有可比性。

2.2 赤土茯苓苷對(duì)小鼠胃黏膜Se-GSH-Px活性的影響

試驗(yàn)中小鼠給藥赤土茯苓苷均經(jīng)過(guò)提取與分離制備的純品，提純后的藥品經(jīng)成分測(cè)定后確定為赤土茯苓苷。從表2中可以看出，SmiⅠ組、SmiⅡ組、SmiⅢ組給藥赤土茯苓苷，與生理鹽水對(duì)照組相比，小鼠Se-GSH-Px活性水平明顯升高(P<0.05)。分別對(duì)SmiⅠ組、SmiⅡ組、SmiⅢ組給予不同赤土茯苓苷藥量干預(yù)后，小鼠胃黏膜Se-GSH-Px活性升高情況不同，其中給予300 mg赤土茯苓苷的藥量對(duì)小鼠體內(nèi)超氧自由基的清除效果最好，間接說(shuō)明水浸應(yīng)激環(huán)境形成的胃潰瘍改善效果最明顯。草藥組和粗品組雖然也在給予赤土茯苓干預(yù)，但是這2組小鼠的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性升高幅度不明顯，試驗(yàn)結(jié)果顯示赤土茯苓直接灌胃和粗品灌胃的胃潰瘍保護(hù)效果不佳。

表1 赤土茯苓苷對(duì)水浸應(yīng)激所致小鼠胃潰瘍的影響

注：*P<0.05 **P<0.01。

Note：*P<0.05 **P<0.01.

圖1 6組小鼠胃部潰瘍指數(shù)分布圖Fig.1 Gastric ulcer index distribution in six groups of mice表2 赤土茯苓苷對(duì)小鼠胃黏膜Se-GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of Smilax glabra glycosides on gastric mucosa Se-gsh-px activity in mice

組別Groups劑量/mgDose小鼠數(shù)Mouse№Se?GSH?Px/(U/min·mg)生理鹽水組Salinegroup—102．05±0．47草藥組Herbalmedicinegroup300102．13±0．62粗品組Crudeproductgroup300102．25±0．53SmiⅠ組SmiⅠgroup300102．83±0．72?SmiⅡ組SmiⅡgroup200102．53±0．54?SmiⅢ組SmiⅢgroup100102．80±0．74?

注：*P<0.05 **P<0.01。

Note：*P<0.05 **P<0.01.

2.3 赤土茯苓苷對(duì)小鼠GMBF含量的影響

對(duì)照組和試驗(yàn)組小鼠的GMBF情況如表3所示。試驗(yàn)中小鼠給藥赤土茯苓苷均經(jīng)過(guò)提取與分離制備的純品，提純后的藥品經(jīng)成分測(cè)定后確定為赤土茯苓苷。本研究中對(duì)60只小鼠胃黏膜血流量的平均值做以對(duì)比，由表3中可以看出，生理鹽水組的GMBF平均值明顯低于試驗(yàn)組的平均值，說(shuō)明生理鹽水組的小鼠胃潰瘍程度要明顯重于SmiⅠ組、SmiⅡ組、SmiⅢ組，間接說(shuō)明赤土茯苓苷能夠有效緩解應(yīng)激性胃潰瘍的病情。SmiⅠ組、SmiⅡ組、SmiⅢ組中，不同的給藥量為小鼠的胃黏膜血流量控制帶來(lái)不同的效果，其中給藥量300 mg組的胃黏膜血流量最大，說(shuō)明該組10只小鼠基本能夠滿足胃潰瘍治愈的需求。草藥組和粗品組各組平均胃黏膜血流量水平有所升高，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到保護(hù)應(yīng)激性胃潰瘍的作用，雖然同樣給予小鼠300 mg的藥量，但是試驗(yàn)效果卻差別甚遠(yuǎn)。表明300 mg赤土茯苓苷對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍的保護(hù)效果最明顯。

表3 赤土茯苓苷對(duì)小鼠GMBF的影響

注：*P<0.05。

Note：*P<0.05.

2.4 顯微鏡下觀察小鼠胃部潰瘍治愈情況

由圖2可見(jiàn)，顯微鏡下觀察解剖展平后的小鼠胃部顯示，綜合60只小鼠的胃部情況，生理鹽水對(duì)照組的潰瘍處黏膜層細(xì)胞脫落明顯，胃壁肌肉層出現(xiàn)斷裂的現(xiàn)象，黏膜下層有少許水腫并且伴有少量漿膜下輕微水腫。在潰瘍周圍的胃黏膜細(xì)胞出現(xiàn)變性的癥狀，毛細(xì)血管也有些許破裂，小動(dòng)脈內(nèi)有血栓現(xiàn)象。

赤土茯苓苷試驗(yàn)組的30只小鼠顯微鏡下結(jié)果表現(xiàn)為，潰瘍處黏膜層細(xì)胞有脫落的現(xiàn)象，但是胃壁肌肉層是完整的沒(méi)有出現(xiàn)斷裂狀況，黏膜下層和漿膜下的細(xì)胞也沒(méi)有看到水腫等病變。在潰瘍周圍的胃黏膜細(xì)胞，試驗(yàn)組的30只小鼠基本表現(xiàn)為細(xì)胞疏松，有小部分細(xì)胞脫落，黏膜下層少許水腫，但是肌肉層以及漿膜層無(wú)明顯病變。

A.生理鹽水組；B.草藥組；C.粗品組；D. SmiⅠ組；E. SmiⅡ組；F. SmiⅢ組 A. Normal saline group；B.Herbal medicine group；C.Crude product group；D.Smi Ⅰ group；E.Smi Ⅱ group；F.Smi Ⅲ group圖2 小鼠胃組織病理學(xué)切片(HE染色)Fig.2 Histopathological sections of stomachs in mice(HE staining)

3 討論

水浸應(yīng)激所致胃潰瘍，主要是胃黏膜下層微小動(dòng)脈痙攣以及毛細(xì)血管有血栓形成導(dǎo)致胃黏膜下層微循環(huán)障礙，組織缺血、缺氧、細(xì)胞變性壞死，進(jìn)而微小血管破裂出血，黏膜屏障消失，H+反流而不能被有效清除。微循環(huán)障礙時(shí)胃黏膜氧自由基清除酶系統(tǒng)活性降低，而白細(xì)胞等激活產(chǎn)生的自由基增加，從而使自由基聚積造成組織細(xì)胞損害。

研究發(fā)現(xiàn)，赤土茯苓粗提物對(duì)胃潰瘍有一定的保護(hù)作用，但是對(duì)胃潰瘍的保護(hù)作用遠(yuǎn)不及赤土茯苓苷的作用。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)11次對(duì)小鼠灌胃赤土茯苓苷對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍起了保護(hù)作用。赤土茯苓苷對(duì)水浸應(yīng)激所致小鼠胃潰瘍的干預(yù)，給藥量不同，潰瘍抑制的效果也不同，300 mg劑量赤土茯苓苷干預(yù)組的潰瘍抑制率最高，潰瘍指數(shù)和出血點(diǎn)數(shù)2個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組的差異最大，在6組中最低(P<0.01)。說(shuō)明赤土茯苓苷300 mg的干預(yù)能夠很好地對(duì)水浸應(yīng)激性胃潰瘍起到保護(hù)作用。

應(yīng)激性胃潰瘍的形成原因主要是攻擊因子和防御因子系統(tǒng)失衡。攻擊因子包括胃部胃酸過(guò)多的腐蝕、代謝中氧自由基的損傷及藥物等化學(xué)物品對(duì)胃黏膜的損害。其中代謝中氧自由基過(guò)多則需要更多谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Se-GSH-Px)消除自由基給機(jī)體造成的損害。小鼠水浸應(yīng)激環(huán)境下，體內(nèi)的脂類過(guò)氧化效應(yīng)明顯。這是由于應(yīng)激反應(yīng)使得小鼠兒茶酚胺水平增高，進(jìn)而激化氧自由基。超氧自由基擁有活性非常強(qiáng)的氧化因子，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的維持有重大意義的不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而損傷線粒體等細(xì)胞，最終導(dǎo)致胃黏膜損傷，造成胃潰瘍的形成[6]。

胃黏膜血流可為胃黏膜細(xì)胞的新陳代謝提供氧和豐富的營(yíng)養(yǎng)元素，以維持細(xì)胞功能的有效運(yùn)行和結(jié)構(gòu)的完整性。胃黏膜血流量還能帶走反滲透進(jìn)入胃黏膜中的氫離子，以此維持組織細(xì)胞內(nèi)酸堿性處于正常范圍。但凡胃黏膜內(nèi)的平衡系統(tǒng)發(fā)生變化，胃黏膜血流量就會(huì)相應(yīng)改變。一旦引起胃黏膜血流量的減少，就直接導(dǎo)致細(xì)胞的氧供應(yīng)不足，造成胃黏膜缺血甚至形成潰瘍面。早前就有學(xué)者的研究認(rèn)為應(yīng)激刺激使得交感神經(jīng)異常興奮，致使機(jī)體分泌更多兒茶酚胺，最終導(dǎo)致為小血管痙攣性收縮，胃黏膜出血量降低[7]。

結(jié)果顯示，赤土茯苓苷給藥組能夠減少胃黏膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，試驗(yàn)組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明赤土茯苓苷抗氧化及清除自由基的作用與胃黏膜的保護(hù)有關(guān)。赤土茯苓苷能抑制血小板聚積，促其解聚，抗血栓形成。這對(duì)改善胃黏膜微循環(huán)、防止微血管破裂出血有非常重要的意義。

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