微孢子蟲基因組學(xué)及分子流行病學(xué)研究進(jìn)展

王琪琪，羅 瀟，張 莉,2，李海龍,2*

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，云南大理 671000；2.云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000)

微孢子蟲(Microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生性真核生物。在1857年微孢子蟲首次被鑒定為引起家蠶微粒子病的病原，給當(dāng)時(shí)歐洲的養(yǎng)蠶業(yè)造成重大損失，1959第一例人類微孢子蟲病發(fā)現(xiàn)于一個(gè)腦炎患兒，1985年報(bào)道比氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)感染艾滋病患者[1]。比氏腸微孢子蟲導(dǎo)致多數(shù)患者的臨床癥狀為慢性腹瀉，同時(shí)也感染多種野生動(dòng)物和家畜[2]。除了比氏腸微孢子蟲，其他一些微孢子蟲同樣可以感染多種脊椎動(dòng)物，也有的同時(shí)能感染脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物[3]。

微孢子蟲廣泛分布于全球各地的各種環(huán)境當(dāng)中，其卵囊對(duì)外界環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗力，使得微孢子蟲能夠通過深海熱泉、洲際塵埃等多種途徑進(jìn)行傳播[4-5]。微孢子蟲的孢子在感染時(shí)形成復(fù)雜的感染裝置，通過其產(chǎn)生的極絲所形成的管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)度過整個(gè)復(fù)制循環(huán)階段后最終分化成最初的孢子返回到環(huán)境當(dāng)中。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)微孢子蟲的基因組研究和分子流行病學(xué)研究逐漸增多，以下從基因組學(xué)和各宿主的分子流行病學(xué)兩方面對(duì)微孢子蟲近年來的研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述。

1 微孢子蟲基因組學(xué)研究

1.1 微孢子蟲比較基因組學(xué)

從1990年人類基因組計(jì)劃的提出到現(xiàn)在，各種各樣的模式生物和重要生物的全基因組測(cè)序相繼完成。關(guān)于微孢子蟲，目前已完成了兔腦炎微孢子蟲(Encephalitozooncuniculi)的全基因組精細(xì)圖譜，由我國西南大學(xué)等單位共同研究的家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)全基因組圖譜也已基本完成，比氏腸微孢子蟲、蝗蟲微孢子蟲(Paranosemalocustae)及蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)等的全基因組草圖拼接工作也已接近尾聲[6]。兔腦炎微孢子蟲的全基因組大小僅為2.9 Mb，這在真核生物的全基因組當(dāng)中最小，共編碼1 997個(gè)基因，對(duì)蝗蟲微孢子蟲和兔腦炎微孢子蟲的全基因組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)雖然這兩種微孢子蟲進(jìn)化地位相差較遠(yuǎn)，但兩者的基因之間有保守的共線性排列。對(duì)比氏腸微孢子蟲的全基因組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其基因組同樣具有高度精簡的特征，同時(shí)與兔腦炎微孢子蟲的全基因組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者之間的基因存在大量的同源關(guān)系。對(duì)蜜蜂微孢子蟲的全基因組進(jìn)行研究，并且與兔腦炎微孢子蟲進(jìn)行比較，得到了與比氏腸微孢子蟲類似的結(jié)果。由西南大學(xué)進(jìn)行的家蠶微孢子蟲全基因組研究發(fā)現(xiàn)，其基因組中AT含量高達(dá)70%，轉(zhuǎn)座元件高達(dá)36%，這一特征與蜜蜂微孢子蟲相似[6]。

1.2 微孢子蟲功能基因組學(xué)

微孢子蟲的基因組高度精簡，其自身缺乏三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化等重要代謝途徑，這就使得微孢子蟲必須依賴宿主細(xì)胞內(nèi)所提供的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增值。微孢子蟲的分泌蛋白能夠幫助其逃避宿主免疫反應(yīng)和攝取宿主營養(yǎng)物質(zhì)。目前，微孢子蟲的功能基因組學(xué)研究主要集中在家蠶微孢子蟲的孢壁蛋白。2013年李田等[7]基于家蠶微孢子蟲的全基因組數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析獲得97種分泌蛋白，為微孢子蟲分泌蛋白的研究提供了研究方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。我國學(xué)者基于家蠶微孢子蟲的基因組數(shù)據(jù)，分離鑒定了多種基因和蛋白，鑒定出一批微孢子蟲紡錘剩體的相關(guān)基因，分析了多種分泌蛋白和胞壁蛋白的功能等等，這些工作填補(bǔ)了微孢子蟲功能基因組學(xué)多項(xiàng)空白[8]。

2 微孢子蟲分子流行病學(xué)

經(jīng)過最近20多年的發(fā)展，微孢子蟲的鑒定和基因型分型研究進(jìn)展明顯。針對(duì)感染人和多種哺乳動(dòng)物的比氏腸微孢子蟲，目前廣泛認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法是通過應(yīng)用普通PCR方法擴(kuò)增其核糖體基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，而后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行序列分析進(jìn)行基因型鑒定[2]。家蠶微孢子蟲主要是通過應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測(cè)小亞單位核糖體RNA(SSU rRNA)基因[9]。蜜蜂微孢子蟲等其他微孢子蟲的檢測(cè)和分型多是依據(jù)16 S rDNA片段[1]。微孢子蟲可以感染多種動(dòng)物，有些基因型所感染的宿主范圍很廣，而通常情況下單個(gè)種的微孢子蟲只能感染一些特定的宿主[3]。目前已經(jīng)報(bào)道的微孢子蟲有150個(gè)屬，大約1 400多個(gè)種，這些數(shù)字每年都可能有所增加[8]。微孢子蟲威脅著人類健康的同時(shí)也給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，其分子流行病學(xué)研究為防控該病提供了重要的參考依據(jù)。

2.1 蠶

微孢子蟲是蠶最致命的寄生蟲之一，它的存在阻礙了全球養(yǎng)蠶業(yè)的健康發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。馬露蕓等[10]對(duì)四川省2006年-2010年間的家蠶微粒子病調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染率受氣候和蠶具的影響，秋季感染率大于春季；野外昆蟲感染微孢子蟲后，會(huì)將微孢子蟲傳染給家蠶。黃旭華等[11]對(duì)廣西蠶區(qū)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，野外昆蟲與家蠶存在微孢子蟲交叉感染現(xiàn)象。蠶微粒子病的流行，除了受季節(jié)、野外昆蟲的影響，還會(huì)受氣候、病原的密度、養(yǎng)蠶環(huán)境、人為因素等的影響。家蠶微粒子病是由家蠶微粒子蟲屬引起的，除了這個(gè)屬，家蠶還能被其他4個(gè)屬的微孢子蟲感染，它們分別是具褶孢蟲屬(Pleistophoratypicales) 、泰羅漢孢蟲屬(Thelohaniagiardi) 變形孢蟲屬(Vairimorphanecatrix)和內(nèi)蟲網(wǎng)屬(Endoreticulatusfidelis)。

2.2 水產(chǎn)動(dòng)物

關(guān)于水產(chǎn)物種微孢子蟲病的流行病學(xué)研究報(bào)道相對(duì)較少，可能使我國微孢子蟲對(duì)水產(chǎn)行業(yè)的危害被低估。蝦感染微孢子蟲后生長緩慢，并可見其肌肉部分呈不透明的白色，因此病蝦被稱為“棉花蝦”，中華絨螯蟹感染后表現(xiàn)為“水癟子病”，梭子蟹表現(xiàn)為“牙膏病”，石斑魚標(biāo)粗過程中常表現(xiàn)為“瘦身病”。腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(E.hepatopenaei)又叫“蝦肝腸胞蟲”，是危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一種重要病原，雷燕等[12]建立了一種基于其SSU rRNA基因的PCR檢測(cè)方法，并對(duì)來自廣東、廣西、江蘇、山東、海南等地的755份凡納濱對(duì)蝦臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有21份為陽性。王元[13]對(duì)江蘇啟東海水中脊尾白蝦和三疣梭子蟹的“肌肉白化病”的病原進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦所感染的微孢子蟲與Potasporamorhaphis親緣關(guān)系最近，但是它們的形態(tài)差異明顯，將這種微孢子蟲暫歸類為未分類的Microsporidiumsp.；同時(shí)發(fā)現(xiàn)感染三疣梭子蟹的微孢子蟲與Ameson屬的形態(tài)結(jié)構(gòu)相同，并且SSU rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系相近，故將其歸為Amesonsp.。Ding Z等[14]首次對(duì)我國江蘇省中華絨螯蟹的“水癟子病”進(jìn)行了報(bào)道，引起國內(nèi)外同行的廣泛關(guān)注，他們發(fā)現(xiàn)該病的病原具有微孢子蟲的典型特征，并通過分子生物學(xué)分析表明其與Hepatosporaeriocheir具有99%相似，系統(tǒng)發(fā)育建樹分析也與Hepatosporaeriocheir同屬一個(gè)分支。

2.3 哺乳動(dòng)物

比氏腸微孢子蟲幾乎感染所有的哺乳動(dòng)物，對(duì)全國各地幾種主要的哺乳動(dòng)物的感染情況和基因型進(jìn)行總結(jié)(表1)，發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物之間或者同種動(dòng)物不同地區(qū)之間感染率不同，大多數(shù)動(dòng)物感染的基因型多樣，而且一些基因型可以同時(shí)感染多種動(dòng)物，還發(fā)現(xiàn)了大量新的基因型。家畜微孢子蟲病的傳播可能導(dǎo)致潛在的人畜共患微孢子蟲病流行。

2.4 人

微孢子蟲已經(jīng)成為危害人類身體健康重要的寄生蟲之一，90%以上的微孢子蟲病都由E.bieneusi引起，它不僅在艾滋病人中發(fā)現(xiàn)，也在器官移植、兒童和正常人群中報(bào)道過。徐利納[27]收集河南省鄭州市某兒童醫(yī)院1 996份兒童新鮮糞便，對(duì)樣品進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)微孢子蟲感染率為1.5%，7歲～10歲這個(gè)年齡段的感染率最高為2.8%。Zhang X等[28]調(diào)查的吉林省長春市某醫(yī)院的40名兒童腹瀉樣品，發(fā)現(xiàn)9名兒童感染微孢子蟲，感染率為22.5%。Wang L等[29]調(diào)查的573名上海某醫(yī)院兒童病人，發(fā)現(xiàn)24名微孢子感染者，陽性率為4.2%。Yang J等[30]報(bào)道的哈爾濱市和大慶市的255名12歲以下的兒童，樣本來源于社區(qū)醫(yī)院(n=40)，幼兒園(n=37)和小學(xué)(n=178)，感染率為7.5%(19/255)，有3個(gè)已知的基因型(CS-4，EbpC,Henan-IV)和5個(gè)新基因型(NEC1～NEC5)；社區(qū)醫(yī)院兒童的感染率22.5%(9/40)遠(yuǎn)大于小學(xué)兒童的感染率5.61%(10/178)；哈爾濱6歲～12歲的兒童感染率高于大慶兒童的感染率。Wang L等[31]調(diào)查的河南省683名人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性患者和683名HIV陰性患者中，有7個(gè)已知基因型(EbpC 、D、IV、Peru8、Peru11、PigEBITS7、EbpD)和5個(gè)新基因型(Henan-I～Henan-V)，但兩者感染率并無太大差異(表2)。

表1 我國哺乳動(dòng)物比氏腸微孢子蟲感染率及基因型

目前已發(fā)現(xiàn)有240多種比氏腸微孢子蟲的基因型可以感染人類，通過系統(tǒng)的進(jìn)化分析，這些基因型已經(jīng)分為8個(gè)組(Group1-8)，其中1組(Group1)是人獸共患基因型組，有30多種為人獸共患基因型，主要有EbpC、BEB4、D、I、J、BEB6、Henan-IV、Peru 6、EbpA、O、Peru8、Peru11、BEB4等[29,31-32]；其他組只能感染特定的宿主，具有宿主特異性。預(yù)計(jì)將來還會(huì)有更多的人獸共患基因型被發(fā)現(xiàn)。

表2 我國人微孢子蟲感染率及基因型

3 展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，微孢子蟲的基因組學(xué)和分子流行病學(xué)研究逐漸深入，多種微孢子蟲的全基因組測(cè)序和拼接工作相繼完成，為研究其致病機(jī)制、診斷和防治方法等方面提供了基因組數(shù)據(jù)支持，但目前仍有多種危害嚴(yán)重的微孢子蟲基因組研究工作尚未完成。同時(shí)，目前國內(nèi)已有的微孢子蟲的分子流行病學(xué)研究工作只是冰山一角，尤其是對(duì)人和水產(chǎn)動(dòng)物，尚需投入大量人力和物力才能掌握微孢子蟲在各個(gè)地區(qū)和各種動(dòng)物之間的分子流行病學(xué)規(guī)律，為微孢子蟲病的防控奠定基礎(chǔ)。

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