植物天冬氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)與功能

高杉，藍(lán)興國

東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040

天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinases，APs）（EC3.4.23）是四大類蛋白水解酶之一，廣泛存在于多種生物中[1]。APs 在MEROPS 數(shù)據(jù)庫（http://merops.sanger.ac.uk/）中被劃分為16 個(gè)家族，植物中的APs 主要分布于AA 和AD 族中[2]。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sati?vaL.）基因組中，目前分別發(fā)現(xiàn)69 和96 個(gè)APs 基因[3-4]。近年來，對植物APs 結(jié)構(gòu)與功能的研究表明這些APs 在植物生長發(fā)育、脅迫等方面有重要的生物學(xué)功能。

1 植物天冬氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)與分類

植物APs 主要分為3 種類型：A 類為典型的APs，B 類為類珠心（nucellin-like）特異的APs，C類為非典型的APs。典型的植物APs 主要含有N端的信號(hào)肽（signal peptide）、前導(dǎo)片段（proseg?ment）、ASP 結(jié)構(gòu)域（ASP domain）、植物特有插入片段（plant specific insert，PSI）和C 端結(jié)構(gòu)域（car?boxy-terminal）。ASP 結(jié)構(gòu)域包含2 個(gè)保守的植物ASP 活性位點(diǎn)，即天冬氨酸-蘇氨酸-甘氨酸（DTG）和天冬氨酸-絲氨酸-甘氨酸（DSG）[3]。PSI是植物APs 特有結(jié)構(gòu)域，包括50～100 個(gè)氨基酸殘基[5]，在APs 成熟過程中被加工并切除[6]。依據(jù)是否含有PSI，可將植物典型的APs 分為A1 和A2 兩類（表1）。類珠心特異的APs 在蛋白結(jié)構(gòu)上含有N 端的信號(hào)肽、ASP 結(jié)構(gòu)域和C 端結(jié)構(gòu)域。與典型植物天冬氨酸蛋白酶相比，類珠心特異的APs不含前導(dǎo)片段和PSI。在擬南芥中，類珠心特異的APs 主要有A41（At1g77480）、A47（At1g44130）、A53（At4g33490）、A46（At1g49050）。非典型的APs被細(xì)分為6個(gè)亞類（C1、C2、C3、C4、C5 和CX）。C1 亞類含有一個(gè)信號(hào)肽和一段25～30 個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)片段；C2 亞類具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽特征的富絲氨酸蛋白，但其一個(gè)非常罕見的特征是缺乏前導(dǎo)片段，蛋白水解活性必須受pH 或通過內(nèi)源性抑制劑調(diào)節(jié)；C3 亞類包含長前導(dǎo)片段；C4 亞類特異性具有C 端延伸區(qū)段；C5 亞類含有DTS 活性位點(diǎn)而不是DTG 活性位點(diǎn)；非典型的APs 序列中不符合上述描述的組被列入CX 亞類（表1）[7]。

表1 擬南芥天冬氨酸家族基因基本信息

2 植物天冬氨酸蛋白酶的加工機(jī)制

目前鑒定的大多數(shù)植物APs 都是用前體結(jié)構(gòu)域合成的，隨后轉(zhuǎn)化為成熟的雙鏈酶[6]。蛋白水解加工在轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)切除信號(hào)肽、前導(dǎo)片段以及全部或部分去除C 端部分的PSI。前導(dǎo)片段的去除可以通過自動(dòng)催化過程實(shí)現(xiàn)，僅須降低pH值，或者可能需要其他分子的催化作用[8]。植物APs 前體的加工涉及去除前導(dǎo)片段和PSI 結(jié)構(gòu)域，然而每個(gè)肽段從前體中除去的機(jī)理和順序不盡相同。第一類是PSI 在前導(dǎo)片段之前被完全移除。刺苞菜薊（Cynara cardunculusL.）中cardosin A 的前體procardosin A 是相對分子質(zhì)量為64 000的含有PSI 的前體，在低pH 值條件下PSI 被切割并且可被胃蛋白酶抑制劑A 抑制[9]。第二類是先去除前導(dǎo)片段，然后再切割PSI。大麥天冬氨酸蛋白酶最先進(jìn)行N 端前導(dǎo)片段的加工，然后再切割PSI[10]。由于體外獲得的中間形式和最終產(chǎn)物與體內(nèi)檢測的產(chǎn)物略有不同，可能蛋白質(zhì)的完全成熟還需要其他蛋白酶的參與[11]。第三類是切除了前導(dǎo)片段和部分PSI。在畢赤酵母中表達(dá)重組成熟的cyprosin，首先切除前導(dǎo)片段和大部分PSI，然后通過二硫鍵把輕鏈和重鏈結(jié)合在一起[12]。此外，畢赤酵母中重組progaline B 的活化須首先部分去除存在于植物APs 中的PSI，將前體蛋白切割成2 條多肽鏈，隨后去除前導(dǎo)片段[13]。

3 植物天冬氨酸蛋白酶的功能

通過對植物APs 遺傳突變體的表型分析，結(jié)合對APs 的生理生化方面的研究，已發(fā)現(xiàn)植物APs 在植物生物脅迫、非生物脅迫、種子萌發(fā)、有性生殖及植物衰老等方面具有重要作用。

3.1 生物脅迫

植物在生長發(fā)育過程中會(huì)受到病原菌的生物脅迫，APs 在這過程中發(fā)揮著重要作用。編碼擬南芥天冬氨酸蛋白酶A62（AT1g92290）的組成型抗病性基因CDR1，其過表達(dá)導(dǎo)致矮化病和對毒性丁香假單胞菌的抗性；反義CDR1植物對病原體的抵抗力減弱，比野生型更易受病原菌株的影響，由此證明該基因可能與病原菌種的抵抗相關(guān)[14]。編碼擬南芥A46（At1g49050）的APCB1參與BAG6介導(dǎo)的基礎(chǔ)抗性，靶向失活天冬氨酸蛋白酶APCB1基因?qū)е驴共⌒詥适15]。編碼水稻天冬氨酸蛋白酶的基因OsCDR1（OsAP5）在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中表現(xiàn)為相關(guān)防御基因增加與細(xì)菌真菌病原體抗性的增強(qiáng)，證明其參與水楊酸介導(dǎo)的抗病性[16]。用稻瘟病真菌（Magnaporthe oryzae）、葉枯病菌（Xanthomonas or orzazae pv.oryzae）或黃瓜花葉病毒（CMV）感染，水稻維管組織中的OsAP77表達(dá)明顯增強(qiáng)，認(rèn)為水稻OsAP77基因參與了生物脅迫機(jī)制[17]。此外，在馬鈴薯中也鑒定出響應(yīng)生物脅迫的APs。馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶StAsp 在致病疫霉感染后的葉片中累積，StAsp 表達(dá)水平與馬鈴薯栽培種對致病疫霉的抗性程度正相關(guān)[18]。把馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶StAP-PSI 轉(zhuǎn)化擬南芥植株，顯著增強(qiáng)擬南芥對灰葡萄孢菌感染的抗性。StAP-PSI 被分泌到葉質(zhì)外體中并直接作用于病原體，從而補(bǔ)充植物先天性免疫反應(yīng)[19]。

3.2 非生物脅迫

編碼擬南芥天冬氨酸蛋白酶A5（At3g18490）的ASPG1（Aspartic Protease In Guard Cell 1）參與非生物脅迫反應(yīng)。過度表達(dá)ASPG1導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞中脫落酸（ABA）敏感性增加，減少植物中水的損失，可以賦予擬南芥抗旱性[20]。用水楊酸（SA）、異煙酸（INA）、過氧化氫（H2O2）和ABA 處理水稻，OsAP77在維管組織中的表達(dá)增加[17]。普通大豆（Phaseolus vulgaris）葉片中天冬氨酸蛋白酶前體PvAP1 的表達(dá)受水分脅迫的嚴(yán)格調(diào)控[21]。耐寒菠蘿（Ananas comosus）中的天冬氨酸蛋白酶AcAP1，在采摘后冷卻處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出前體基因表達(dá)的上調(diào)，而易感性表現(xiàn)出采摘后冷卻處理的下調(diào)，表明AcAP1 與收割后低溫脅迫下抗黑心病的發(fā)展呈正相關(guān)[22]。這些研究結(jié)果說明植物APs 參與了植物的非生物脅迫反應(yīng)。

3.3 種子萌發(fā)

擬南芥2S 白蛋白（albumin）是一種液泡蛋白，經(jīng)翻譯后加工形成成熟的2S 白蛋白，植物APs 在此過程中發(fā)揮重要作用[23]。蓖麻種子中的APs 在體外能夠?qū)?S 白蛋白的前肽（pro2S）進(jìn)行部分加工。亞細(xì)胞定位表明，天冬氨酸內(nèi)肽酶定位于蓖麻籽成熟胚乳液泡的基質(zhì)區(qū)域，因此認(rèn)為蓖麻種子的APs 可能參與了pro2S 白蛋白前體的成熟過程[24]。此外，擬南芥的ASPG1參與種子的萌發(fā)，突變ASPG1導(dǎo)致種子休眠且種子活力降低，當(dāng)在無營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長時(shí)，突變體aspg1-1的幼苗停止發(fā)育。因此，ASPG1對種子休眠、種子壽命和種子萌發(fā)很重要[25]。水稻OsAp41編碼的Oryzasin1在萌發(fā)的種子、幼嫩的根和葉中表達(dá)量較高，水稻開花后2～4 周，Oryzasin1的表達(dá)呈上升趨勢，種子形成后其表達(dá)量下降，說明Oryzasin1在種子形成過程中發(fā)揮重要作用，推測其通過降解儲(chǔ)備蛋白以供萌發(fā)需要[26]。另外，小麥中的天冬氨酸蛋白酶WAP1和WAP2 可以在體外消化貯藏蛋白谷蛋白，推測其可能參與種子萌發(fā)過程[27]。

3.4 有性生殖

天冬氨酸蛋白酶在絨氈層和配子體發(fā)育中起重要作用。沉默編碼擬南芥A51（At4g12920）的AtUNDEAD的表達(dá)，導(dǎo)致絨氈層PCD 出現(xiàn)較早，花粉敗育，說明植物APs 對于絨氈層和花粉發(fā)育是必需的[28]。水稻OsAP25和OsAP37也參與絨氈層的降解，過表達(dá)OsAP25和OsAP37誘導(dǎo)植物和酵母細(xì)胞死亡，同時(shí)參與轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)節(jié)水稻花藥中絨氈層細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，揭示了APs在水稻生殖發(fā)育動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中的重要作用[29]。編碼擬南芥天冬氨酸蛋白酶A35（At5g02190）的PCS1與胚胎發(fā)育和有性生殖有關(guān)，PCS1功能喪失突變導(dǎo)致雄性和雌性配子體的變性及發(fā)育中胚胎細(xì)胞的過度死亡；相反，PCS1過表達(dá)通常導(dǎo)致花藥開裂處和隔膜處細(xì)胞存活，表明PCS1對胚胎發(fā)育是必需的[30]。Gao 等[31]描述了新的擬南芥APs A36（At5g36260）和A39（Atlg65240），二者是膜錨定蛋白，與GPI 錨定蛋白COBRA-Like10 共定位于花粉管細(xì)胞壁的頂端區(qū)域。a36a39突變體顯示明顯的敗育，花粉粒發(fā)生類似凋亡的程序性細(xì)胞死亡，表明A36 和A39 是參與配子體發(fā)生和擬南芥花粉導(dǎo)向的重要因素。水稻OsAP65 蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)的囊泡中，其編碼基因的缺失導(dǎo)致花粉萌發(fā)和花粉管的生長受到抑制，最終導(dǎo)致雄配子體的敗育[32]。大麥天冬氨酸蛋白酶基因nucellin則是在發(fā)生雙受精后進(jìn)行表達(dá)。授粉前nucellin基因僅在靠近合胞體端的胚囊附近的珠心細(xì)胞簇中以非常低的水平表達(dá)，但授粉后其在整個(gè)胚胎周圍的大部分珠心細(xì)胞中高度表達(dá)。nucellin基因表達(dá)的時(shí)間和空間模式與珠心細(xì)胞同步，推測nucellin與珠心細(xì)胞死亡有關(guān)[33]。

3.5 植物衰老

隨著植物莖、葉、種子等器官的衰老，表現(xiàn)為生長速率的下降，如光合速率下降、核酸和蛋白質(zhì)含量下降、線粒體體積減小導(dǎo)致呼吸速率下降、激素水平變化等。在植物衰老過程中，APs 主要參與光合作用關(guān)鍵酶的降解、激素調(diào)控及細(xì)胞器降解等過程。煙草CND41 是一種在葉綠體中表達(dá)的與DNA 結(jié)合的天冬氨酸蛋白酶，它通過降解二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco），在葉片老化中發(fā)揮重要作用[34]。馬鈴薯SPAP1 是一種功能性典型的天冬氨酸蛋白酶，參與乙烯利介導(dǎo)葉片的衰老。SPAP1 促進(jìn)的葉片衰老及其活性很可能與PSI 結(jié)構(gòu)域無關(guān)[35]。天冬氨酸蛋白酶在白楊（Pop?ulus tremula）的幼葉中表達(dá)很少，但在衰老葉片中的表達(dá)量明顯升高，可能與細(xì)胞中葉綠體的降解緊密相關(guān)[36]。在豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）中通過基因組文庫篩選分離天冬氨酸蛋白酶基因，發(fā)現(xiàn)豇豆APs 在葉和莖中積累但在根中不積累，在衰老的葉片中轉(zhuǎn)錄物累積增加，表明該酶可能參與葉片衰老過程[37]。

3.6 其他功能

豬籠草（Nepenthes macferlaneiL.）產(chǎn)生各種水解酶，捕食昆蟲以獲得蛋白質(zhì)，這些水解酶中包括天冬氨酸蛋白酶[38]。另外，稻根霉菌（Rhizopus oryzae）產(chǎn)生的天冬氨酸蛋白酶Rhio1 能觸發(fā)各種過敏性疾病，說明Rhio1 具有免疫學(xué)特征，將有助于診斷霉菌過敏[39]。

4 結(jié)語

目前雖然對植物APs 的結(jié)構(gòu)和功能有了一定的認(rèn)識(shí)，但大部分APs 的作用機(jī)制尚不清楚。在擬南芥和水稻中，大部分APs 的生物學(xué)功能尚未得到研究，而且對其下游底物及信號(hào)傳遞因子知之甚少。未來，需要通過大規(guī)模系統(tǒng)生物學(xué)方法結(jié)合遺傳學(xué)方法（如CRISPR/Cas9），進(jìn)一步解析APs 的生物學(xué)功能。