納米磁珠偶聯(lián)CFP-10特異性單抗富集結(jié)核分枝桿菌方法的建立

張佳，張景海，馮曉燕，張賀秋

1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽110016；2.東方海洋（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京100070

結(jié)核病是通過呼吸道傳播，由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染病，隨著病情不斷惡化而導(dǎo)致全身多系統(tǒng)疾病[1]，嚴(yán)重?fù)p害人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，2016年全球新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核病例約1040 萬，中國新發(fā)病例占全球的8.6%[2]，是排名世界第三的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)核病疫情的防控刻不容緩。目前結(jié)核病的診斷仍主要依賴于傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和痰涂片抗酸染色[3]。涂片抗酸染色鏡檢觀察法是細(xì)菌學(xué)檢測常用的方法，但是由于敏感性低，對細(xì)菌的數(shù)量要求較高，只有當(dāng)痰液中細(xì)菌數(shù)達(dá)到5000～10000/mL 才能檢測到抗酸菌，陽性檢出率較低。因此，對標(biāo)本中致病菌進(jìn)行富集，對提高細(xì)菌學(xué)檢查的陽性率至關(guān)重要。傳統(tǒng)的富集方法存在各種不足，仍滿足不了臨床需要。作為一種新型富集方法，磁珠富集法受到越來越多研究者的關(guān)注，正逐漸應(yīng)用到結(jié)核病的診斷中。

培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）由結(jié)核分枝桿菌的RD1 區(qū)基因Rv3874編碼[4]，在體內(nèi)和早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）形成1∶1 異二聚體復(fù)合物而發(fā)揮生物學(xué)功能，激發(fā)強(qiáng)烈的特異性T 細(xì)胞應(yīng)答[5]。由于CFP-10 所在的RD1 區(qū)只存在于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，而其他分枝桿菌及卡介苗（BCG）中均缺失該區(qū)序列[6]，因此成為結(jié)核病診斷研究的熱點。我們制備了CFP-10 特異性單抗，并將該抗體與納米磁珠偶聯(lián)，用于捕獲富集結(jié)核分枝桿菌，以期能夠提高痰樣本抗酸染色檢測的陽性檢出率。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性BALB/c 小鼠（8～10 周齡）購自北京維通利華實驗動物有限公司；結(jié)核分枝桿菌H37Rv 株由中國疾病預(yù)防控制中心提供；大腸桿菌HB101感受態(tài)由本實驗室保存；原核表達(dá)質(zhì)粒pBVIL1 由本實驗室構(gòu)建并保存；抗CFP-10 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1028 為本實驗室前期制備保存；DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ及T4DNA 連接酶購自Promega 公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow 購自GE Health?care 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；胎牛血清購自康源生物公司；琥珀酰亞胺磁珠購自上海醫(yī)脈賽生物科技有限公司。

DYY-10C 電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR儀、Bio-PlexPro Wash Station（BIO-RAD 公司）；3-18K 低溫高速離心機(jī)（Sigma 公司）；酶標(biāo)板（廈門怡佳美實驗器材有限公司）。

1.2 CFP-10抗原制備

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的DNA為模板，針對CFP-10的開放讀框設(shè)計擴(kuò)增引物CFP-10-F（5′-GCGTCGACGAA GCAGCCAATAAGCAG-3′，下劃線序列為SalⅠ酶切位點）和CFP-10-R（5′-GCTCTAGAATGGTGAT GGTGATGGTGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3′，下劃線序列為XbaⅠ酶切位點）。PCR 擴(kuò)增，片段酶切后連接到原核表達(dá)載體pBVIL1，構(gòu)建pBVIL1-CFP-10 重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101 感受態(tài)，挑取單菌落送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序鑒定。

1.2.2 目的蛋白表達(dá)及純化 將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101 感受態(tài)，挑取單菌落于3 mL 含氨芐西林鈉的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日接種于新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期后于42℃過夜誘導(dǎo)。SDSPAGE 分析目的蛋白及表達(dá)形式。將pBVIL1-CFP-10 菌液擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵，Ni 柱親和層析純化蛋白，紫外分光光度計測定蛋白濃度。

1.3 CFP-10單抗制備

1.3.1 單抗制備與純化 復(fù)蘇1028 雜交瘤細(xì)胞，用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，10 d 后收集細(xì)胞，用10 mL 生理鹽水重懸細(xì)胞，每只小鼠腹腔注射0.5 mL（細(xì)胞密度約為1×107/mL）；2周后收集腹水，硫酸銨沉淀法純化抗體。

1.3.2 ELISA 法測抗體效價 用碳酸鹽包被緩沖液稀釋CFP-10 抗原濃度為2.5 μg/mL，每孔包被100 μL。用抗體稀釋液分別將CFP-10 單抗稀釋至1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/20000、1/40000、1/80000、1/160000、1/320000、1/640000、1/1280000，100 μL/孔加樣并設(shè)置空白孔（100 μL 抗體稀釋液）。用酶標(biāo)儀雙波長（450 nm/630 nm）測定各孔的吸光度值。

1.3.3 磁珠偶聯(lián)CFP-10 單抗 取50 μL（2.5 mg）納米磁珠（粒徑300 nm）于EP 管中，用洗滌緩沖液洗滌磁珠，磁場吸附，棄上清；用偶聯(lián)緩沖液重懸磁珠和稀釋CFP-10 單抗；將等體積的重懸磁珠和偶聯(lián)蛋白溶液置于旋轉(zhuǎn)混合儀中，4℃振蕩過夜；磁場分離磁珠，移除含蛋白的上清液，紫外分光光度計測定蛋白濃度；加入封閉緩沖液重懸磁珠，置于旋轉(zhuǎn)混合儀中，室溫混合4 h；磁場吸附，棄上清；用封閉緩沖液洗滌偶聯(lián)蛋白的磁珠，磁場吸附，棄上清；用1 mL 封閉緩沖液重懸磁珠，于2～8℃儲存。

1.4 磁珠偶聯(lián)CFP-10單抗的驗證

1.4.1 HRP 標(biāo)記CFP-10 單抗 用碳酸鹽緩沖溶液調(diào)整CFP-10 單抗?jié)舛葹? mg/mL 待用。用分析天平稱量10 mg HRP，溶于蒸餾水中避光攪拌；緩慢滴加NaIO4水溶液避光攪拌；緩慢滴加乙二醇室溫攪拌；將活化好的HRP 溶液分2 等份加入2 種抗體中，4℃透析過夜；加NaBH4混勻，4℃冰箱中放置2 h；加等體積的甘油混勻，-20℃保存。

1.4.2 雙抗體夾心ELISA 法測定 偶聯(lián)CFP-10單抗的磁珠用PBS 緩沖液稀釋至1/10，100 μL/孔；調(diào)整CFP-10 抗原濃度依次為1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、62.5 ng/mL、6.25 ng/mL，每孔加入100 μL（對照組無關(guān)抗原稀釋同上）；室溫振蕩孵育1 h，磁珠洗板機(jī)洗滌5次；酶稀液稀釋HRP 標(biāo)記的CFP-10 單抗，100 μL/孔；室溫振蕩孵育30 min，磁珠洗板機(jī)洗滌5次；顯色液A 與顯色液B（1∶1）混合，100 μL/孔，37℃避光10 min；硫酸終止液50 μL/孔終止反應(yīng)；采用酶標(biāo)儀雙波長（450 nm/630 nm）測定各孔的吸光度值。

1.4.3 免疫熒光法測定 取10 μL 偶聯(lián)抗體的磁珠及等量未偶聯(lián)抗體的空磁珠，均勻涂在黏附性玻片上自然晾干；分別設(shè)置實驗組（偶聯(lián)抗體的磁珠+二抗）、對照組（空磁珠+二抗）；山羊抗小鼠FITC 標(biāo)記的二抗用PBS 稀釋至1/200 后加100 μL覆蓋在磁珠上，避光孵育1 h；PBS 洗滌后用50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 磁珠富集結(jié)核分枝桿菌抗酸染色

用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)將結(jié)核分枝桿菌聚集的團(tuán)塊分散，紫外分光光度計測得吸光度值，計算結(jié)核分枝桿菌濃度，詳情參考文獻(xiàn)[7]。將已知濃度的結(jié)核分枝桿菌稀釋后取總菌量為50 000、3000 和300 的分枝桿菌，均分成2 份，設(shè)置實驗組與對照組。實驗組：不同總菌數(shù)的結(jié)核分枝桿菌懸液加入稀釋至1/10 后體積為10 μL 的偶聯(lián)抗體的磁珠，加PBS 緩沖液使各組混懸液體積補(bǔ)齊至100 μL，室溫振蕩富集1 h 后進(jìn)行抗酸染色。對照組：直接將同等總菌數(shù)的結(jié)核分枝桿菌懸液涂片后進(jìn)行抗酸染色。

2 結(jié)果

2.1 CFP-10抗原制備

2.1.1 CFP-10 基因的克隆及鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，CFP-10 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，基因長度為111 bp（圖1）。

2.1.2 CFP-10 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化鑒定 SDSPAGE 分析pBVIL1-CFP-10 誘導(dǎo)表達(dá)菌液，目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。重組蛋白由150 個氨基酸殘基的pBVIL1 重組載體和37 個氨基酸殘基的目的蛋白CFP-10 組成，在相對分子質(zhì)量23×103處有比較明顯的特異蛋白表達(dá)帶，與預(yù)期大小相符（圖2）。pBVIL1-CFP-10 菌液擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵，Ni 柱親和層析純化蛋白，紫外分光度計測定CFP-10 抗原濃度為0.7 mg/mL。

2.2 CFP-10單抗制備

硫酸銨沉淀法純化小鼠腹水中的CFP-10 單抗，紫外分光光度計測得單抗?jié)舛葹?.5 mg/mL，ELISA 法測得單抗效價為1∶640 000（圖3）。

2.3 磁珠偶聯(lián)CFP-10單抗及驗證

圖1 CFP-10 基因擴(kuò)增結(jié)果

磁珠偶聯(lián)加入CFP-10 單抗7.5 mg。偶聯(lián)后經(jīng)磁場移除磁珠的上清液CFP-10 單抗剩余量為5.8 mg，計算出磁珠偶聯(lián)上CFP-10 單抗1.7 mg。雙抗體夾心法偶聯(lián)抗體能檢測到抗原的最低濃度為62.5 ng/mL（圖4）。免疫熒光實驗顯示偶聯(lián)上抗體的磁珠與FITC 標(biāo)記的二抗孵育后可見熒光，而對照無熒光（圖5）。

圖2 CFP-10 表達(dá)的SDS-PAGE 鑒定

圖3 CFP-10 單抗抗體效價鑒定

圖4 磁珠偶聯(lián)CFP-10 單抗ELISA 鑒定折線圖

圖5 偶聯(lián)CFP-10 特異性單抗磁珠的免疫熒光鑒定圖（×40）

圖6 結(jié)核分枝桿菌抗酸染色圖（×100 油鏡）

2.4 磁珠富集結(jié)核分枝桿菌抗酸染色

將結(jié)核分枝桿菌調(diào)整為總菌數(shù)分別為50 000、3000、300 的菌懸液，設(shè)置為利用偶聯(lián)CFP-10 特異性單抗進(jìn)行富集的實驗組和未進(jìn)行富集的對照組，分別進(jìn)行抗酸染色，結(jié)果如圖6。與對照組相比，含不同數(shù)量菌懸液的3 個實驗組中結(jié)核分枝桿菌均明顯多于對照組，且結(jié)核分枝桿菌多富集在磁珠周圍，說明磁珠偶聯(lián)CFP-10 特異性單抗能有效富集結(jié)核分枝桿菌。

3 討論

2014年世界衛(wèi)生大會提出到2035年消滅全球結(jié)核病預(yù)防、控制和治療策略[8]，這給發(fā)展中國家結(jié)核病防控提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前結(jié)核病的檢測仍主要依賴于細(xì)菌學(xué)方法，富集結(jié)核分枝桿菌能提高結(jié)核病的陽性檢出率，對于結(jié)核病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。傳統(tǒng)的富集方法仍存在各種不足，如離心沉淀法在操作中樣本暴露在外，存在生物安全隱患；漂浮集菌法高壓滅菌時間相對較長，但漂浮到液面的結(jié)核分枝桿菌仍不能保證完全黏附在玻片上，并受實驗者主觀因素影響；夾層杯法富集后導(dǎo)致嚴(yán)重背景干擾，易出現(xiàn)假陽性，影響最終實驗結(jié)果。近年來，國外介紹了利用超順磁性顆粒珠富集分枝桿菌，因其具有快速簡便、不需要特殊儀器、穩(wěn)定性高、無須冷藏保存等優(yōu)點，除了被用來分離富集標(biāo)本中的細(xì)菌及細(xì)胞外[9-10]，也有將其用于富集分枝桿菌，尤其是免疫磁珠。Grant 等[11]用磁珠連接抗副結(jié)核分枝桿菌的多克隆抗體，通過外加磁場沉淀牛奶標(biāo)本中的副結(jié)核分枝桿菌，沉淀物用金胺“O”熒光染色鏡檢。

本研究首次用納米磁珠偶聯(lián)針對致病性結(jié)核分枝桿菌抗原的CFP-10 單抗。CFP-10 所在的RD1 區(qū)只存在于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，因此我們制備的免疫磁珠增加了結(jié)核分枝桿菌的特異性。本實驗結(jié)果表明，實驗組納米磁珠偶聯(lián)上CFP-10 特異性單抗富集結(jié)核分枝桿菌總數(shù)明顯多于對照組，且被染成紫紅的結(jié)核分枝桿菌與納米磁珠的褐色背景形成鮮明的顏色對比，在鏡下形態(tài)清晰容易找到，富集效果良好，證明了初步建立的富集方法可行，為提高結(jié)核病臨床細(xì)菌學(xué)檢測的陽性檢出率奠定了基礎(chǔ)。