百合鱗片組織培養(yǎng)研究

馬生軍，丁萬紅，李淑珍，靳元元，周晉

1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 綜合試驗場，新疆 烏魯木齊830012

百合（Lilium browmiiF.E.Brownvar.viridu?lumBaker），為百合科（Liliaceae）百合屬草本植物，別名喇叭筒、夜合花、野百合或博多百合等。百合性喜半蔭環(huán)境，自然生長在海拔300～1000 m的山坡草叢中、疏林下、山溝旁，是百合中既耐寒也耐熱的種類之一，產(chǎn)于我國河北、山西、河南、江西、浙江等地[1-4]。適宜栽培在半陰地，具有豐富腐殖質(zhì)，土層深厚排水良好的輕松沙壤土中。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，百合含有酚酸酐油脂、苷類、生物堿、多糖、微量元素及蛋白質(zhì)、磷脂、無機元素等多種成分[5-10]，具有止咳、祛痰、平喘、抗癌、降血糖等多種藥理作用[10-14]。百合性甘、寒，藥用部位為其干燥肉質(zhì)鱗葉，可用于養(yǎng)陰潤肺、清心安神，臨床用于治療陰虛久咳、虛煩驚悸、精神分裂等[15-16]。

百合的繁殖方法很多，有播種、鱗片扦插、小鱗莖繁殖和組織培養(yǎng)等。常規(guī)的繁殖方法為小鱗莖培養(yǎng)，但該法繁殖系數(shù)低、易感染病毒，不僅不能滿足生產(chǎn)上的需求，還容易造成其品質(zhì)和優(yōu)良性狀的退化，嚴(yán)重影響了百合的品質(zhì)和經(jīng)濟價值。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)可有效解決以上問題，其不僅繁殖周期短，而且繁殖系數(shù)大，有著分生繁殖無法比擬的優(yōu)勢。此外，用組織培養(yǎng)法實現(xiàn)百合的快速繁殖，對保護和合理開發(fā)利用百合資源具有非常重要的現(xiàn)實意義。我們采用組織培養(yǎng)法篩選百合繁殖的適宜條件，以期為百合的資源保護和開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

百合植株地下鱗莖來源于新疆烏魯木齊市明珠花卉市場；6-芐基腺嘌呤（6-BA）、赤霉酸（GA3）、α-萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等生長調(diào)節(jié)劑購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。FHP-300 種子發(fā)芽箱（上海鴻都電子科技有限公司）；哈東聯(lián)超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)公司）；78-1 型磁力加熱攪拌器（金壇市華峰儀器有限公司）；VIC-212 型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；MSL-3750 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋（日本三洋公司）；槍形鑷、直鑷、手術(shù)剪、解剖刀、培養(yǎng)皿、三角瓶（100 mL）。

1.2 無菌環(huán)境的建立

接種外植體時，必須保證接種環(huán)境的整潔與無菌，以降低污染率。接種前，用75%酒精擦拭超凈工作臺臺面，在超凈工作臺內(nèi)放入百合組培苗、無菌器具及用品，紫外線殺菌20 min。

1.3 培養(yǎng)基的配制

分別配制MS、B5、N6培養(yǎng)基的母液，按6.4 g/L瓊脂加熱融化，30 g/L 蔗糖用水溶解，并分別附加不同種類及濃度的激素。調(diào)培養(yǎng)基pH 值為5.8，激素均在滅菌前加入。高壓滅菌條件為121℃保持20 min。

1.4 外植體的接種

在超凈工作臺內(nèi)，用已在酒精燈上灼燒滅菌的槍形鑷將百合組培苗從錐形瓶中取出，置于已滅菌的大號培養(yǎng)皿中的濾紙上，吸干殘留水分。選取生長良好的百合鱗片，用直鑷和解剖刀切割成適當(dāng)大小，接入培養(yǎng)基。

1.5 培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，不僅能夠固定外植體，還能滿足外植體生長過程中的需求。

本實驗啟動培養(yǎng)基為MS、B5、N6，芽的誘導(dǎo)、增殖、壯苗與生根培養(yǎng)基以MS 培養(yǎng)基為主，并添加不同濃度的激素。植物組織培養(yǎng)要求一定的pH 值，本實驗培養(yǎng)基pH 值控制為5.8。①啟動培養(yǎng)基：以MS、B5、N6培養(yǎng)基為啟動培養(yǎng)基，并添加相同濃度的激素6-BA、NAA；②誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS 培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并添加不同濃度的激素6-BA、NAA；③增殖培養(yǎng)基：以MS 培養(yǎng)基為增殖培養(yǎng)基，并添加不同濃度的激素6-BA、NAA；④壯苗培養(yǎng)基：以MS 培養(yǎng)基為壯苗培養(yǎng)基，并添加不同濃度的激素6-BA、NAA、GA3；⑤生根培養(yǎng)基：以MS 培養(yǎng)基為對照生根培養(yǎng)基，并添加不同濃度的激素IBA。

培養(yǎng)溫度26±1℃，光照周期12 h/d，光照強度1200 lx。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基對百合增殖的影響

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要因素。參照劉國民[17-20]等報道的方法，選用長勢良好、高度相近的百合芽苗，分別接種于MS、B5、N6培養(yǎng)基上。3 種培養(yǎng)基選取相同濃度的6-BA、NAA 配比，觀察統(tǒng)計不同培養(yǎng)基上不定芽的增殖率及長勢，結(jié)果見表1。接種30 d 后，從生芽苗的增殖倍數(shù)及生長情況看，當(dāng)6-BA 和NAA 的濃度配比一定時，MS 培養(yǎng)基的增殖效果最好，增殖倍數(shù)達3.06，苗生長健壯，叢生芽較多，葉色濃綠。B5培養(yǎng)基中叢生芽的增殖倍數(shù)相對較低，為2.53，叢生芽也較多，苗生長情況良好。N6培養(yǎng)基中叢生芽的增殖倍數(shù)最低，為2.39，苗長勢較差，葉色淡綠，叢生芽少。統(tǒng)計結(jié)果表明，MS 培養(yǎng)基中叢生芽的增殖倍數(shù)和生長情況均優(yōu)于B5和N6培養(yǎng)基，因此MS 培養(yǎng)基為百合最適增殖培養(yǎng)基（圖1）。

2.2 不同濃度的激素配比對百合不定芽誘導(dǎo)分化的影響

細(xì)胞分裂素具有刺激細(xì)胞分裂、促進細(xì)胞生長等作用。細(xì)胞分裂素6-BA 主要對植物細(xì)胞的分裂以及莖、芽的分化起作用。在組織培養(yǎng)中加入6-BA，目的是刺激細(xì)胞分裂和由器官上分化不定芽，以及促進葉片生長、莖長高和抑制根的形成。一般認(rèn)為6-BA 和NAA 的組合最適于百合鱗片再生芽[21]。

在無菌操作條件下，挑選生長良好、大小相近的百合鱗片接入培養(yǎng)基，觀察百合鱗片不定芽的誘導(dǎo)分化情況，結(jié)果見表2。接種8 d 后，百合鱗片表面開始出現(xiàn)黃綠色的圓形突起并逐漸分化成芽，接種30 d 后，觀察并統(tǒng)計結(jié)果。當(dāng)6-BA的濃度為0.5 和1.0 mg/L 時，隨著NAA 濃度的升高，不定芽的誘導(dǎo)率及生長呈下降趨勢；當(dāng)6-BA的濃度為2.0 mg/L 時，不同NAA 濃度條件下的芽誘導(dǎo)率均偏低，表明高濃度的NAA 和6-BA 對不定芽的誘導(dǎo)均有一定的抑制作用。當(dāng)NAA 濃度為0.5 mg/L 時，隨著6-BA 濃度的增加，芽的誘導(dǎo)率呈先上升后下降的趨勢；當(dāng)6-BA 濃度為1.0 mg/L 時，芽的誘導(dǎo)率最高，達62%，苗生長健壯，葉色濃綠。由此可知，百合不定芽誘導(dǎo)分化的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA（圖2）。

表1 不同培養(yǎng)基對百合增殖的影響

表2 不同激素的濃度配比對百合不定芽誘導(dǎo)分化的影響

圖1 百合的初代培養(yǎng)

圖2 百合芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.3 不同濃度的激素配比對百合叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

細(xì)胞分裂素6-BA 影響頂端優(yōu)勢的變化和莖芽的分化，可以解除頂端優(yōu)勢促進側(cè)芽的增殖，由于其對細(xì)胞分裂的作用，在組織培養(yǎng)中常和生長素NAA 一起使用，相互促進莖芽的增殖及細(xì)胞的分裂與生長。在無菌操作條件下，將長勢良好的百合芽苗切割成小簇，接種到增殖培養(yǎng)基上，接種30 d 后統(tǒng)計叢生芽增殖倍數(shù)及生長情況，結(jié)果見表3。當(dāng)6-BA 濃度為1.0 mg/L 時，NAA 濃度越低，叢生芽增殖效果越好；NAA 濃度為0.1 mg/L時，叢生芽的增殖倍數(shù)最高，達3.90，苗健壯，長勢良好，葉色濃綠。當(dāng)NAA 濃度為0.5 mg/L 時，隨著6-BA 濃度的降低，叢生芽增殖倍數(shù)呈上升趨勢；6-BA 濃度為0.5 mg/L 時，叢生芽生長效果良好，增殖倍數(shù)達2.75。激素濃度偏低及偏高均不利于叢生芽增殖。由此可知，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（圖3）。

2.4 不同濃度的激素配比對百合組培苗壯苗的影響

GA3廣泛存在于植物界中，可以促進莖、葉伸長，破除休眠。低濃度的GA3不僅能促進矮小植株莖節(jié)伸長，還能刺激在培養(yǎng)中形成的不定胚正常發(fā)育成小植株。在無菌操作條件下，將在增殖培養(yǎng)基中生長健壯的芽苗分割成小簇轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中，30 d 后統(tǒng)計組培苗的生長情況，結(jié)果見表4。低濃度GA3對組培苗的生長有顯著促進作用。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培養(yǎng)基上，苗生長健壯，最高株高達4.40 cm，植株高度多為2.5～4.0 cm；在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培養(yǎng)基上，最高株高為4.60 cm，植株高度多為2.5～3.5 cm，苗長勢良好。在加入GA3的2 組組培苗中，植株高度及生長情況均優(yōu)于未加入GA3的組培苗。由此可知，百合最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3（圖4）。

表3 不同濃度的激素配比對百合叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

表4 不同濃度的激素配比對百合組培苗壯苗的影響

圖3 百合的增殖培養(yǎng)

圖4 百合的壯苗培養(yǎng)

2.5 不同濃度激素配比對百合誘導(dǎo)生根的影響

生長素在植物體中的合成部位是葉原基、嫩葉和發(fā)育中的種子，成熟的葉片和根尖也產(chǎn)生生長素。在組織培養(yǎng)中，生長素主要用于誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分裂和根的分化。IBA 為外源植物激素，促進插枝生根，是生根刺激劑。生根培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加不同濃度的IBA。

在無菌操作條件下，挑選生長健壯、長2～3 cm 的百合芽苗接入生根培養(yǎng)基；8～10 d，百合鱗莖基部開始產(chǎn)生白色柱狀突起，并逐漸長成白色根系；接種30 d 后百合苗全部生根，結(jié)果見表5，較高濃度的IBA 對百合生根促進效果較好。在不加任何激素的MS 培養(yǎng)基上，組培苗平均根數(shù)為3.22，平均根長為1.15 cm，最長根長為3.30 cm；在加入IBA 的培養(yǎng)基中，隨著IBA 濃度的增加，組培苗的生根數(shù)及生根效果呈上升趨勢。當(dāng)IBA 濃度為1.0 mg/L 時，平均根數(shù)最多，達4.17，平均根長達1.69 cm，根粗壯，苗長勢好。因此，百合最佳生根培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L IBA（圖5）。

圖5 百合的生根培養(yǎng)

3 討論

植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度是影響植物組織培養(yǎng)最重要的因素，而激素是常見的一類植物生長調(diào)節(jié)劑，對植物的生長和發(fā)育起著非常重要的作用。植物生長調(diào)節(jié)劑對組培苗生長有一定的調(diào)節(jié)作用，植物生長發(fā)育期間體內(nèi)激素處于一個動態(tài)變化過程。不同植物和品種對生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度反應(yīng)不同，選擇適宜的激素配比才能達到較好的增殖效果。在植物組織培養(yǎng)過程中，常添加一定濃度的生長素促進生根，但因植物種類不同，對生長素的種類及濃度要求也不盡相同[22]。不同的激素種類和質(zhì)量濃度對植株不定芽誘導(dǎo)有顯著影響，當(dāng)外植體體內(nèi)細(xì)胞分裂素與生長素積累到一定比例時，才能誘導(dǎo)不定芽的形成[23]。較低濃度的生長素與較高濃度的細(xì)胞分裂素有利于誘導(dǎo)出芽，研究認(rèn)為NAA 和6-BA 的組合效果較好[24-25]。

在百合叢生芽的增殖中，當(dāng)6-BA 和NAA 的濃度配比為10∶1 時，叢生芽的增殖倍數(shù)及增殖效果最好，此結(jié)論和張藝萍等[26-27]的結(jié)果一致。低濃度的GA3對百合組培苗壯苗促進效果良好，但同時致使百合叢生芽的增殖數(shù)略低，表明GA3對百合叢生芽的增殖存在一定的抑制作用。百合生根結(jié)果顯示，在不加任何激素的MS 培養(yǎng)基和加入IBA 的培養(yǎng)基上均可以誘導(dǎo)出根，而IBA 的加入對生根有促進作用。當(dāng)IBA 濃度較高為0.1 mg/L 時，促進作用明顯。

表5 不同濃度的激素配比對百合誘導(dǎo)生根的影響