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    利用核磁共振(31P-NMR)測(cè)定b型流感嗜血桿菌莢膜多糖中磷含量的新方法研究

    2018-04-10 08:39:36普元倩朱文勇吳雅楠靳瑋華李衛(wèi)東廖國(guó)陽(yáng)
    生物技術(shù)通訊 2018年6期
    關(guān)鍵詞:化學(xué)法內(nèi)標(biāo)磷酸

    普元倩,朱文勇,吳雅楠,靳瑋華,李衛(wèi)東,廖國(guó)陽(yáng)

    1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理671000;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南 昆明650018

    b 型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzaetype b,Hib)是引起嬰幼兒嚴(yán)重細(xì)菌感染的主要致病菌,可導(dǎo)致腦膜炎、肺炎、敗血癥、會(huì)厭炎、蜂窩組織炎、心包炎、脊髓炎等多種侵襲性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全球每年約330 萬(wàn)5 歲以下兒童受到Hib 感染,其中38 萬(wàn)~50 萬(wàn)兒童死于Hib 感染性疾病,并且有30%~40%的兒童出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥與殘疾[1]。Hib 疫苗的研發(fā)和使用能夠降低Hib 疾病的發(fā)病率。在Hib 疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中,其莢膜多糖的質(zhì)量控制至關(guān)重要,其中包括血清型鑒定,磷含量、蛋白含量、核糖含量的測(cè)定等。傳統(tǒng)上采用《中國(guó)藥典》三部(2010 版)收錄的化學(xué)法對(duì)Hib 莢膜多糖中的磷含量進(jìn)行測(cè)定。由于這類(lèi)方法一般使用強(qiáng)腐蝕性酸,操作復(fù)雜、危險(xiǎn)系數(shù)高,且靈敏度較低,有時(shí)易受到干擾,不能用于細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中多糖磷含量的檢測(cè)。定量核磁共振波譜(quantitative nucle?ar magnetic resonance spectroscopy,QNMR)方 法操作簡(jiǎn)便,樣品用量少,無(wú)其他元素干擾,無(wú)需對(duì)照品即可進(jìn)行定量分析。 目前QNMR 包括1H-、13C-、19F-、31P-、14N-、15N-NMR 及一些二維技術(shù)[2],廣泛應(yīng)用于化學(xué)藥物[3-4]、食品農(nóng)業(yè)[5-6]、中藥與植物提取物[7-8]、代謝組學(xué)[9-10]、生物學(xué)[11-12]等研究領(lǐng)域。在細(xì)菌多糖質(zhì)量控制中,氫核磁共振波譜(1H-NMR)技術(shù)已用于原料多糖的型別鑒定[13-14]、含量測(cè)定、計(jì)算多糖中特異化學(xué)基團(tuán)(如O-乙?;┑暮縖15]、多糖純度(如Pn C-PS、殘余化學(xué)試劑)分析[14]。目前,NMR 已經(jīng)是《歐洲藥典》和WHO 推薦的多糖質(zhì)量控制方法[17-18]。我們運(yùn)用31P-NMR 譜的定量功能,采用內(nèi)標(biāo)法,摸索適當(dāng)?shù)臏y(cè)試條件,并與傳統(tǒng)化學(xué)方法進(jìn)行比較,建立了31P-NMR 測(cè)定Hib 莢膜多糖中磷含量的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    磷酸氫二鉀(99%純度)、六甲基磷酰三胺(99%純度,為核磁共振化學(xué)位移內(nèi)標(biāo)試劑)購(gòu)自Sigma公司;Hib莢膜多糖(批號(hào):20130826,20130909,20130923;2~8℃保存)由昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室制備;重水(D2O,99.9%純度)購(gòu)自CIL 公司;硫酸購(gòu)自川東化工集團(tuán)有限公司;高氯酸購(gòu)自金鹿化工有限公司;鉬酸銨購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉購(gòu)自西隴化工股份有限公司;1-氨基-2-萘酚-4-磺酸購(gòu)自上海金山亭新化工試劑廠;蒸餾水由昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備;400 MHz 核磁共振儀購(gòu)自Bruker 公司;四環(huán)凍干機(jī)購(gòu)自北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo 公司;核磁共振樣品管(d=5 mm)購(gòu)自Wilmad-Lab?Glass 公司。

    1.2 NMR法

    1.2.1 核磁法樣品配制 用D2O 分別配制50 mmol/L 內(nèi)標(biāo)溶液、50 mmol/L 磷酸氫二鉀溶液、100 mmol/L Hib 莢膜多糖樣品溶液,其中Hib 多糖以其重復(fù)單元計(jì)算物質(zhì)的量,每一重復(fù)單元相對(duì)分子質(zhì)量為368[19](磷酸二氫鉀、3 批樣品多糖、內(nèi)標(biāo)試劑均先冷凍干燥過(guò)夜)。

    1.2.231P-NMR 譜參數(shù)設(shè)置31P-NMR 圖譜采集所用儀器參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。

    1.2.3 核磁定量精密度、重復(fù)性及精確度驗(yàn)證取100 μL 磷酸氫二鉀溶液、300 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,加D2O 600 μL 混勻,配制成終濃度為5 mmol/L 磷酸氫二鉀溶液和15 mmol/L 內(nèi)標(biāo)溶液混合液,取550 μL 至核磁樣品管。同法配制10、15、20、25 mmol/L 樣品混合液,內(nèi)標(biāo)終濃度固定為15 mmol/L。每個(gè)濃度均配制5 個(gè)平行核磁樣品,分別按表1 優(yōu)化參數(shù)設(shè)置進(jìn)行31P-NMR 測(cè)試。利用31PNMR 譜圖中質(zhì)子峰面積與質(zhì)子數(shù)成正比的原理,通過(guò)下式[20]計(jì)算含量,進(jìn)而進(jìn)行平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、誤差和相對(duì)誤差的分析。

    式中,WS為樣品質(zhì)量,AS為樣品定量峰面積,nS為樣品定量峰包含磷原子數(shù),WR為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量,AR為內(nèi)標(biāo)定量峰面積,nR為內(nèi)標(biāo)定量峰包含磷原子數(shù),MS為樣品摩爾質(zhì)量,MR為內(nèi)標(biāo)摩爾質(zhì)量,S為磷酸氫二鉀,R為六甲基磷酰三胺。

    1.2.4 核磁法測(cè)定Hib 莢膜多糖中的磷含量 分別取3 批多糖溶液300 μL、內(nèi)標(biāo)溶液300 μL,加D2O 400 μL 混勻,吸取550 μL 至核磁樣品管,配制成含15 mmol/L 多糖和15 mmol/L 內(nèi)標(biāo)溶液,按1.2.2 項(xiàng)參數(shù)設(shè)置進(jìn)行31P-NMR 測(cè)試。同樣利用上述公式得到多糖中的磷含量。

    1.3 化學(xué)法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用蒸餾水配置20 μg/mL磷酸氫二鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、100 μg/mL 磷酸氫二鉀溶液(作為供試樣品)、100 μg/mL 3 批多糖樣品(磷酸氫二鉀、3 批多糖樣品均先冷凍干燥過(guò)夜),參照《中國(guó)藥典》三部(2010 版)附錄ⅦA 操作[21],以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2 定量精密度、重復(fù)性及精確度驗(yàn)證 先將100 μg/mL 磷酸氫二鉀樣品作為供試品用蒸餾水依次稀釋至6、9、12、15、18 μg/mL,每個(gè)濃度各5個(gè)平行,按《中國(guó)藥典》三部(2010 版)附錄ⅦA 操作[21],測(cè)定吸光度值,代入回歸方程即得供試品質(zhì)量濃度,計(jì)算磷酸氫二鉀質(zhì)量,并計(jì)算平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)誤差。

    1.3.3 測(cè)定Hib 莢膜多糖中的磷含量 配制3 批100 μg/mL 多糖樣品溶液,參考《中國(guó)藥典》三部(2010 版)附錄ⅦA 進(jìn)行檢測(cè)[21]。

    2 結(jié)果

    2.1 磷酸氫二鉀31P-NMR譜

    將一定量的內(nèi)標(biāo)物六甲基磷酰三胺溶液和磷酸氫二鉀溶液加入核磁管,按表1 優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行31P-NMR 測(cè)定,其31P-NMR 譜見(jiàn)圖1??梢钥闯?,所選內(nèi)標(biāo)物的定量峰a 與磷酸氫二鉀的定量峰b 完全分離,對(duì)不同的物質(zhì)峰進(jìn)行歸屬,在化學(xué)位移30 和0 ppm 出現(xiàn)2 個(gè)較大的尖銳峰,且無(wú)其他雜峰干擾。

    2.2 NMR法的精密度及準(zhǔn)確度

    公式計(jì)算結(jié)果如表2 所示,不同濃度的相對(duì)誤差均小于3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)除最低濃度(5 mmol/L)和最高濃度(25 mmol/L)外,均小于1.0%;其中,RSD 最小(0.7%)的樣品濃度為15 mmol/L,相對(duì)誤差也幾近最?。?.1%),表明該濃度下的數(shù)據(jù)精密度,重復(fù)性最好。

    圖1 磷酸氫二鉀加入六甲基磷酰三胺31P-NMR 譜

    2.2 化學(xué)法的精密度及準(zhǔn)確度

    標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。所有樣品的相對(duì)誤差均超過(guò)5%,明顯高于31P-NMR 法,說(shuō)明精確性不如31P-NMR 法。不同濃度樣品的RSD 為1%~3%,18 μg/mL 時(shí)RSD 最 大(3.185%),12 μg/mL 時(shí)RSD 最?。?.222%),說(shuō)明各平行濃度間重復(fù)性不夠好,可能由于炭化消化過(guò)程中玻璃試管壁厚度不均一導(dǎo)致受熱不均,有個(gè)別管底殘留液難以炭化,使得相對(duì)誤差與RSD 值偏大,見(jiàn)表3。

    2.3 Hib多糖中磷含量的測(cè)定結(jié)果

    31P-NMR 法定量Hib 多糖中的磷含量時(shí),多糖定量峰在化學(xué)位移0.06 ppm 處呈獨(dú)立單峰(圖3,d 峰),與內(nèi)標(biāo)定量峰c 完全分離,其峰面積可以作為公式中的AS進(jìn)行計(jì)算。31P-NMR 法和化學(xué)法檢測(cè)的3 批多糖中的磷含量無(wú)明顯差異,均在《中國(guó)藥典》三部(2010 版)合格范圍內(nèi)(68~90 mg/g)(表4),表明2 種方法均可用于3 批多糖的磷含量檢測(cè),且檢測(cè)結(jié)果均合格。

    圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    表2 31P-NMR法的精密度和精準(zhǔn)度

    表3 化學(xué)法的精密度和精準(zhǔn)度

    3 討論

    磷含量是Hib 莢膜多糖質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要檢測(cè)指標(biāo)。傳統(tǒng)化學(xué)法操作步驟多,人為操作及測(cè)量誤差不可避免;而31P-NMR 法只對(duì)磷原子有吸收峰,無(wú)其他元素的干擾,不破壞樣品,操作簡(jiǎn)單、快速,相應(yīng)地減少了測(cè)量過(guò)程中誤差出現(xiàn)的幾率。本實(shí)驗(yàn)中化學(xué)法所得結(jié)果與實(shí)際理論值的相對(duì)誤差控制在10% 以內(nèi),但普遍高于31PNMR 法的相對(duì)誤差,因此,在精密度方面,31PNMR 法要優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)法。在重復(fù)性上,31PNMR 法的RSD 值遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)化學(xué)法,表明31PNMR 法較化學(xué)法更穩(wěn)定。

    圖3 Hib 多糖加入六甲基磷酰三胺31P-NMR 譜

    表4 31P-NMR法和化學(xué)法測(cè)定Hib多糖中的磷含量(mg/g)

    在QNMR 中,當(dāng)磷酸二氫鉀濃度為15 mmol/L時(shí),磷酸氫二鉀定量峰面積與內(nèi)標(biāo)定量峰面積接近1∶1,其RSD 值(0.7%)最小,即精密度最好。綜合以上因素,采用核磁法測(cè)量Hib 莢膜多糖中的核糖含量時(shí),應(yīng)選擇與內(nèi)標(biāo)定量峰面積相近的濃度進(jìn)行。

    本研究建立了31P-NMR 法測(cè)定Hib 莢膜多糖中磷含量的方法,該方法精密度高、重復(fù)性好、精確度高,各方面均優(yōu)于化學(xué)法,且檢測(cè)快速準(zhǔn)確,不破壞原物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu),不依賴被測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品即可進(jìn)行定量分析,可作為檢測(cè)細(xì)菌多糖中磷含量的一個(gè)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快捷的方法。

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