環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)山羊奶中的牛奶成分

李婷婷，趙路遙，張桂蘭，趙曉燕，趙志勇，陳愛(ài)亮

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京100081；2.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海201403

羊奶不但營(yíng)養(yǎng)豐富，同時(shí)還可防止過(guò)敏，近年來(lái)在中國(guó)乳制品消費(fèi)中增長(zhǎng)迅速。然而，在乳制品行業(yè)中，羊奶摻假現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮。迄今已建立了多種乳制品鑒別方法，主要包括基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，如電泳[1]、免疫學(xué)技術(shù)和色譜分析技術(shù)[2-3]。一些研究指出，ELISA 可準(zhǔn)確檢測(cè)奶類(lèi)摻假。然而，由于蛋白質(zhì)易受熱和鹽的影響而變性，導(dǎo)致交叉反應(yīng)，因此，蛋白質(zhì)檢測(cè)方法不利于已加工產(chǎn)品的檢測(cè)。核酸檢測(cè)技術(shù)作為一種生物學(xué)方法已被廣泛認(rèn)為可以替代蛋白質(zhì)檢測(cè)方法對(duì)奶類(lèi)摻假進(jìn)行鑒別。Martin[4]開(kāi)發(fā)了一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法，針對(duì)12S RNA 線粒體基因設(shè)計(jì)特異性引物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)山羊、綿羊和牛奶的鑒別，牛的基因片段長(zhǎng)度為84 bp，綿羊?yàn)?21 bp，山羊?yàn)?22 bp。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其靈敏度可達(dá)0.1%，即使奶類(lèi)制品放置時(shí)間延長(zhǎng)，此方法也十分穩(wěn)定。Zha[5]建立了一種檢測(cè)鹿產(chǎn)品的多重PCR 檢測(cè)方法，針對(duì)16S rDNA 基因的D 環(huán)和保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，用于梅花鹿、馬鹿和馴鹿的特異性鑒定，可分別產(chǎn)生307、230 和141 bp 的特異性片段。多重PCR 是鑒定產(chǎn)物來(lái)源的有效、可靠的方法。Abdel-Rahman[6]開(kāi)發(fā)了用于鑒定羊奶、牛奶的PCR 和PCR-RFLP 技術(shù)，用線粒體細(xì)胞色素b 區(qū)段（Cyt-b，359 bp）的PCR-RFLP的限制性分析顯示了各種乳樣品之間的差異，提供了一種快速、特異和靈敏的檢測(cè)方法，適用于物種特定成分的檢測(cè)和鑒定。Dalmasso[7]建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，以區(qū)分乳制品中的牛及水牛源性成分，可檢測(cè)到混合奶中2%的牛奶成分，且無(wú)需任何PCR 后操作。盡管目前已開(kāi)發(fā)出基于蛋白質(zhì)和核酸的檢測(cè)乳類(lèi)制品的方法，但這些技術(shù)不僅需要熟練的操作技能和昂貴的設(shè)備，且擴(kuò)增耗時(shí)漫長(zhǎng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）以其可在等溫條件下快速擴(kuò)增DNA 片段并進(jìn)行可視化觀察而成為研究熱點(diǎn)，目前已有鑒別不同物種的LAMP 檢測(cè)方法[8-11]。

我們采用LAMP 檢測(cè)技術(shù)對(duì)羊奶是否摻假進(jìn)行鑒別，這種方法需要特殊引物。我們對(duì)引物的特異性和敏感度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并對(duì)市售的6 種不同奶制品做了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

山羊奶和牛奶樣品來(lái)自北京的養(yǎng)殖場(chǎng)，無(wú)菌收集鮮奶，立即在冷鏈條件下以無(wú)菌方式將樣品轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室；商業(yè)羊奶來(lái)自北京不同的超市。用TaKaRa Genomic DNA 提取試劑盒提取DNA，NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（賽默飛）測(cè)定DNA 的純度和濃度，濃度為10 ng/mL，其D260nm/D280nm值為1.7～2.0，可用于后續(xù)LAMP。

1.2 樣品制備

將山羊奶與牛奶按不同比例（100∶0，99∶1，95∶5，90∶10，75∶25，50∶50，25∶75，10∶90，5∶95，1∶99 和0∶100）混合制備樣品，提取DNA 用于后續(xù)擴(kuò)增。

1.3 特異性引物設(shè)計(jì)

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索山羊GAPDH 基因和牛的Cyt-b 基因序列，并針對(duì)這些序列用Primer Ex?plorer V5 軟件（http://primerexplorer.jp/）設(shè)計(jì)LAMP特異性引物組（表1），由上海生工公司合成。

表1 LAMP 引物設(shè)計(jì)

1.4 LAMP反應(yīng)

LAMP 反應(yīng)總體積為25 μL，包括引物FIP、BIP 各1.28 μmol/L，引物F3、B3 各0.16 μmol/L，BstDNA 聚合酶8 U，dNTP（北京燕棲灣生物技術(shù)有限公司）1.4 mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20 nmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO410 mmol/L，MgSO48 mmol/L，Tween-20（北京生物生工科技有限責(zé)任公司）0.1%，提取的DNA 2 μL，鈣黃綠素2.5 μmol/L。將反應(yīng)混合物于60℃溫育45 min，然后加熱至80℃并保持5 min 以終止反應(yīng)。如果有擴(kuò)增反應(yīng)，則混合物的顏色從橙色變?yōu)榫G色，否則反應(yīng)混合物仍保持橙色。

1.5 熒光定量PCR

為了證明牛和山羊引物的特異性，我們用實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增不同的動(dòng)物模板，反應(yīng)體系主要包括引物FIP、BIP 各1.28 μmol/L，引物F3、B3 各0.16 μmol/L，BstDNA 聚 合 酶8 U，dNTP 1.4 mmol/L，Tris- HCl（pH8.8）20 nmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO410 mmol/L，MgSO4，8 mmol/L，Tween-20 0.1% ，提 取 的DNA 2μL，EvaGreen 1.25 μL。反應(yīng)程序：60℃ 40 s，61℃ 40 s，45 個(gè)循環(huán)，然后80℃5 min。

1.6 靈敏度和實(shí)際樣品檢測(cè)

為了確定實(shí)驗(yàn)的靈敏度，將不同體積的山羊奶和牛奶混合，提取DNA 進(jìn)行LAMP。為了測(cè)試所開(kāi)發(fā)的方法在實(shí)際樣品中的適用性，從北京的不同市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)了6 種山羊奶產(chǎn)品，并分別用山羊和牛引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

圖1 LAMP 引物特異性

2 結(jié)果

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)

針對(duì)羊的GAPDH 基因和Cyt-b 基因設(shè)計(jì)物種特異性引物，熒光定量PCR 擴(kuò)增不同的模板。結(jié)果如圖1，采用羊引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，只有含羊模板反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而不含羊模板未出現(xiàn)擴(kuò)增；當(dāng)使用牛的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，只有含牛模板反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而不含牛模板反應(yīng)未出現(xiàn)擴(kuò)增。

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

為了確定實(shí)驗(yàn)靈敏度，將山羊奶與牛奶按不同比例混合后提取DNA，分別采用山羊特異性引物和牛特異性引物進(jìn)行LAMP。結(jié)果見(jiàn)圖2，用山羊引物擴(kuò)增時(shí)其顏色由綠色逐漸變?yōu)槌壬?，而用牛引物擴(kuò)增時(shí)其顏色由橙色逐漸變成綠色。

2.3 商業(yè)樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性，對(duì)北京市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的6 種不同的羊奶產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖3，用羊引物擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)均從橙色變?yōu)榫G色，而用牛引物擴(kuò)增時(shí)，其中5 號(hào)樣品（第8 管）的反應(yīng)由橙色變?yōu)榫G色，說(shuō)明此羊奶產(chǎn)品中含有牛源性成分（圖3）。

3 討論

目前已開(kāi)發(fā)出多種乳制品摻假檢測(cè)技術(shù)，主要包括ELISA、毛細(xì)管電泳、色譜技術(shù)，但這些技術(shù)往往需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，耗時(shí)較長(zhǎng)。隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，一些生物化學(xué)方法逐漸被報(bào)道，基于DNA 的檢測(cè)技術(shù)以其靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為主流。其中基于DNA 的PCR 檢測(cè)技術(shù)雖靈敏度高、特異性好，且Bottero[12]研發(fā)了一步法檢測(cè)牛和水牛成分的PCR 方法，但PCR 檢測(cè)需要昂貴的儀器，因此不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了山羊與牛的特異性引物，用于山羊奶的快速可見(jiàn)檢測(cè)，靈敏且直觀。與傳統(tǒng)PCR 技術(shù)相比，LAMP 無(wú)需特殊設(shè)備，65℃50 min 即可完成。本研究建立的LAMP 檢測(cè)技術(shù)可檢測(cè)到含量為1%的牛奶成分，用鈣黃綠素染料可直接對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行觀察，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求，有助于未來(lái)奶制品現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。

圖2 引物靈敏度

圖3 6 種商品奶的檢測(cè)