長鏈非編碼RNA作為肝細胞癌診斷新型血清標志物的meta分析

王秀月，趙　川，陳　徹，王　晶，胡立冬

甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第5位，死亡率居第3位。HCC是一種高侵襲性和高致命性腫瘤，容易復發(fā)和轉移，且預后較差［1］。HCC的發(fā)生、發(fā)展過程非常復雜，涉及很多基因和通路。因此，治療HCC是全球性問題。根治性手術通常被用于HCC患者的治療，但是對于失去手術機會的患者這是一個難題［2］。近年來，隨著對基因的不斷認識和對長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的研究，越來越多的證據表明，HCC患者中l(wèi)ncRNA的表達水平發(fā)生了重大變化［3］。

LncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，在調控基因表達方面具有重要的生物學功能［4］。近年來有研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進腫瘤或腫瘤抑制因子的作用，參與細胞凋亡、腫瘤浸潤和轉移過程［5］。正常組織和腫瘤組織中l(wèi)ncRNA的差異性表達可被用作腫瘤預防、治療和預后的指標。有文獻已經通過meta分析的方法報告了lncRNA與腫瘤預后的關系［6］。

目前，僅有極少數的研究通過meta分析的方法評價腫瘤診斷中l(wèi)ncRNA的整體價值［6］。肝癌患者血清中能夠檢測到lncRNA，這為肝癌診斷提供了新的途徑。該研究在全面文獻檢索的基礎上，運用meta分析的方法評價肝癌患者中l(wèi)ncRNA的整體診斷價值。

1　資料和方法

1.1　文獻檢索

使用計算機檢索PubMed、EMbase、Cochrane Library、CBM、CNKI及萬方數據庫相關的中英文文獻，同時通過其他資源（谷歌學術和百度學術）補充獲得相關文獻，檢索時限均從建庫至2017年2月。檢索詞包括lncRNA、肝癌、血清、診斷靈敏度、特異度、受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積（area under curve，AUC）。

1.2　納入和排除標準

所有研究均由2名研究員通過題目和摘要獨立進行初步篩選，然后通過閱讀全文篩選滿足納入和排除標準的研究。通過討論或咨詢第3名研究員來解決有分歧的地方。此外，如果有必要可聯系原作者來獲取缺失的數據。文獻納入標準如下：HCC是基于組織學檢查，與之匹配的對照組檢查結果陰性且無其他腫瘤史，所有的血樣均在病理檢查和治療前收集，研究人員單獨評估血樣中的lncRNA，研究應包含靈敏度、特異度或從數據中能夠獲得這些數值。排除標準如下：重復發(fā)表的研究，系統評價、會議摘要、案例報告和評論，不合格的患者、對照及其血樣，數據不充分，樣本量小于20。

1.3　數據提取和質量評價

從每項研究中提取的數據包括第一作者、發(fā)表時間、國家、對照來源、年齡、樣本量、檢測方法、lncRNA表達模式和診斷結果。任何分歧通過討論或咨詢第3名研究員來解決。2名研究員采用Cochrane協作網推薦的診斷準確性研究質量評價工具（Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies 2，QUADAS-2）獨立評價每個研究的偏倚風險［7］。QUADAS-2主要由病例的選擇、待評價試驗、金標準、病例流程和進展情況組成。根據每部分納入的相關標志性問題的回答為“是”、“否”或“不確定”，可對應將偏倚風險等級判斷為“低”、“高”或“不確定”。

1.4　統計學處理

該研究采用Stata 12和Meta-Disc 1.4對納入文獻進行統計學分析。選取靈敏度、特異度、陽性似然率、陰性似然率和ROC效應指標進行該診斷試驗的meta分析。采用Q統計量和I2檢驗評估異質性，如果P<0.05（Q統計）或I2>50%，則采用隨機效應模型計算合并效應量，否則采用固定效應模型。對于發(fā)表偏倚，采用Deeks檢驗來評估納入的研究，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1　文獻檢索和研究的基本特征

共檢索到385篇相關的研究，通過認真閱讀題目和摘要，228篇研究由于是系統評價、病例報告或基礎研究等被進一步排除。全文閱讀剩下的39篇研究，26篇研究由于數據不完整、對照標準不明確或信件被排除。因此，在剩余的13篇研究中很多l(xiāng)ncRNA被納入該meta分析［8-20］，如UCA1、MALAT1、HULC、Linc00152、uc003wbd、AF085935、RP11-160H22.5、XLOC_014172、LOC149086、uc001ncr、AX800134、WRAP53、SPRY4-IT1、GAS5、H19、HEIH和JPX。篩選流程圖見圖1。納入研究的基本信息見表1。所有符合納入標準的研究均發(fā)表在2013—2017年，其中HCC患者1 296例，健康對照者1 304人。病理檢查被視為診斷HCC的金標準。納入研究的基本特征包括第一作者、發(fā)表年份、國家、患者和對照者的數量、年齡、分析類型、內參、臨界值、lncRNA名稱、靈敏度、特異度及ROC曲線的AUC。

2.2　質量評估

使用QUADAS-2評估納入研究的質量，發(fā)現納入的所有研究的質量較高（圖2）。然而，在這些納入的研究中存在一個明顯的偏倚，即在“index text”中存在明顯的缺陷，占46%（6/13）。

2.3　異質性分析和閾值效應

為評估納入研究的lncRNA是否存在異質性，用Spearman檢驗計算真陽性率的對數值與假陽性率的對數值之間的相關系數和P值來排除閾值效應。Spearman相關系數為0.191（P=0.478），表明不存在閾值效應。診斷比值比的Cochran-Q值為64.21，I2值為81.3%，P<0.1，表明不存在閾值效應。上述結果表明，研究間存在異質性，可能與人群、年齡等有關；因此，在該meta分析中應用DerSimonian-Laird法。

圖1　文獻篩選流程及結果Fig. 1　Flow diagram of study selection process

表1　納入研究的基本特征Tab. 1　General characteristics of included studies

圖2　采用QUADAS-2對納入研究進行質量評價Fig.2 Quality assessment of the included studies by QUADAS-2

2.4　診斷價值評價

隨機效應模型用于評價lncRNA在診斷HCC中的整體效果（圖3）。整體lncRNA診斷HCC的靈敏度為83%（95%CI：81%~85%），特異性為82%（95%CI：80%~84%），陽性似然比為5.32（95%CI：3.37~8.42），陰性似然比是0.21（95%CI：0.15~50.28），診斷比值比為30.38（95%CI：16.76~55.05）。ROC曲線的AUC為0.91（95%CI：0.88~0.93），具體見圖4。上述結果表明，lncRNA對HCC具有較好的診斷價值。然而，因為由非閾值引起的異質性能夠在診斷指標的森林圖中清晰地觀察到，我們試圖利用meta回歸（如國家、年齡、內參和臨界值）來探索研究的特點。因為在納入的研究中，lncRNA均取自HCC患者和健康人群的血液，標本類型和對照不是異質性的來源。如果協變量有缺失值，在meta回歸中用0代替。根據國家、年齡和內參做meta回歸顯示，P＞0.05，表明未找到異質性的來源（表2）。研究的總體分布總結見圖5，Fagan列線圖描述了lncRNA檢測確定或排除腫瘤患者的可能性。對于任何檢測前有20%患HCC可能性的人來說，如果在腫瘤檢測中l(wèi)ncRNA是陽性，則患HCC的檢測后概率將達到56%；然而，lncRNA檢測結果陰性則意味著檢測后概率將降至4%。因此，lncRNA檢測在初始篩查HCC中發(fā)揮著重要作用。

2.5　發(fā)表偏倚

發(fā)表偏倚被認為是影響診斷準確性的又一因素。Deeks檢驗用于評估納入文獻是否存在發(fā)表偏倚。Deeks檢驗的P=0.53，表明lncRNA在研究中沒有發(fā)表偏倚（圖6）。

圖3　森林圖展示lncRNA診斷HCC的合并診斷指標Fig. 3　Results of pooled diagnostic performance for lncRNAA: Sensitivity; B: Specificity; C: Positive LR; D: Negative LR. LR: Likelihood ratio

圖4　LncRNA診斷HCC的ROC曲線Fig. 4　The ROC curve for lncRNA expression in the diagnosis of HCC

圖5　lncRNA診斷HCC的Fagan列線圖Fig. 5　Fagan’s nomogram describes the ability of lncRNA assay to confirm or exclude HCC patients

表2　Meta回歸檢測異質性的潛在來源Tab. 2　Meta-regression for the potential source of heterogeneity

圖6　lncRNA診斷HCC來自Deeks檢驗的發(fā)表偏倚Fig. 6　Publication bias from Deek’s test for lncRNA expression in the diagnosis of HCC

3　討　論

隨著基因測序的完成，發(fā)現僅有1%~2%的基因具有編碼蛋白的功能，大多數非編碼序列被轉錄成非編碼RNA，80%~90%具有非蛋白編碼基因的轉錄活性，即lncRNA［21］。盡管有大量的lncRNA，但有關lncRNA的研究遠少于microRNA。與lncRNA相比，microRNA更早被發(fā)現。目前，lncRNA研究還處于起步階段。最近的研究表明，lncRNA能夠調節(jié)轉錄和表觀遺傳學水平的重要細胞信號通路［22］。很多l(xiāng)ncRNA具有調節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)和增殖的作用，一些lncRNA可能在細胞凋亡中發(fā)揮調節(jié)作用［23］。LncRNA調控基因表達，主要包括染色質修飾、轉錄和轉錄后處理。LncRNA與腫瘤的相關證據主要來源于表達差異。僅有少量lncRNA的機制是清楚的，可能是由于缺乏大量的臨床研究樣本。

近年來，盡管診斷方法和外科技術的發(fā)展顯著改善了HCC患者的預后，但晚期HCC患者的5年生存率仍然較差。診斷性生物標志物缺乏導致了HCC早期檢測的延遲。迄今為止，很多HCC檢測的非侵入性血液標志物都是可用的，如甲胎蛋白、γ-谷氨酸轉移酶、去羧基凝血酶原、肝細胞生長因子、熱休克蛋白70和白介素-6，目前被用于檢測HCC［24］。盡管如此，由于診斷準確性相對較低，這些生物標志物用于確診HCC并不是很理想。另一方面，病理診斷是HCC檢測最可靠的診斷方法，但是會造成不同程度的損傷，并且手術費用較高。因此，找出HCC篩查的新型診斷生物標志物是必需的。目前，lncRNA在很多腫瘤（包括HCC）中表現出診斷價值。此外，很多學者有興趣通過meta分析對腫瘤診斷和預后的生物標志物間的關系進行全面綜合研究。已有研究通過meta分析的方法比較堿性磷酸酶與骨肉瘤預后的關系［25］。

本研究發(fā)現血液中整體lncRNA的不一致表達水平在HCC患者和健康對照者之間差異有統計學意義。通過篩選有13篇文獻被納入。因為沒有詳細描述病理和血液中檢測lncRNA之間的時間間隔，可以忽略由于疾病過程而導致的檢測結果的偏差。異質性是meta分析中一個重要的參考因素，閾值效應是診斷性meta分析異質性中最重要的因素。該研究采用Spearman模型的相關系數來明確13個研究的不同閾值是否是由異質性引起的，森林圖和I2值表明存在異質性。因此，使用meta回歸分析來確定異質性的可能原因。Meta回歸分析顯示，在所有指定的協變量中，P>0.1，表明未找到異質性的來源。因此，采用隨機效應模型合并分析其診斷價值。納入lncRNA在HCC診斷價值中的聯合指標，如靈敏度、特異度、陽性似然率、陰性似然率和診斷比值比。ROC曲線的AUC顯示，lncRNA在HCC中具有良好的診斷價值。在分析HCC患者和健康對照者之后，lncRNA的ROC曲線的AUC為0.91，靈敏度為83%，特異度為82%，表明其具有潛在的HCC的非侵入性診斷價值。診斷比值比作為診斷效率與病例之間的緊密指標，具有極高的檢測價值。本研究中，診斷比值比為30.38，表明其診斷HCC具有更好的診斷準確性。

綜上所述，本研究表明，lncRNA表達譜顯示出區(qū)分HCC患者和無腫瘤人群更好的診斷準確性。LncRNA分析在HCC管理中顯示出很高的價值。如果在大規(guī)模研究中得到驗證，lncRNA有望成為一個HCC臨床實踐的非侵入性篩查工具。當然，需要更多的研究來明確lncRNA作為HCC發(fā)生、發(fā)展補充檢測標志物的價值。

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