Aurora A調(diào)控活性氧對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的影響

楊麗娜，楊宇琦，楊　恭，陳亞萍

1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200240；2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

化療耐藥是卵巢癌臨床治療的一大難題，研究細(xì)胞耐藥機(jī)制并開發(fā)靶向藥物可明顯提升腫瘤的治療效果。極光激酶A（Aurora A kinase，Aurora A）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過程。Aurora A擴(kuò)增導(dǎo)致多極紡錘體和非整倍體細(xì)胞的形成，誘導(dǎo)基因不穩(wěn)定性從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生［1］。有研究表明，Aurora A可通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)、抑制細(xì)胞凋亡及抑制自噬等多種途徑促進(jìn)細(xì)胞對(duì)化療藥物（如順鉑、紫杉醇及依托泊苷）的耐藥［2-4］。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要由含氧自由基和易于形成自由基的過氧化物組成。ROS作為信號(hào)分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及免疫反應(yīng)等［5］。腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于正常細(xì)胞，因此，誘導(dǎo)ROS升高的分子可用于腫瘤的靶向治療［6］。在順鉑、紫杉醇和多柔比星耐藥的卵巢癌細(xì)胞株中，ROS清除酶谷胱甘肽過氧化物酶3（glutathione peroxidase 3，GPX3）上調(diào)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)基因UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族1成員A6（UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6，UGT1A6）下調(diào)［7］，提示耐藥細(xì)胞株中ROS水平低于敏感細(xì)胞株。

在骨肉瘤中，Aurora A抑制劑MLN8237促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬，同時(shí)MLN8237誘導(dǎo)ROS生成［8］；在慢性粒細(xì)胞性白血病中，Aurora A抑制劑AKI603通過誘導(dǎo)衰老從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性，此過程伴隨ROS的升高［9］，表明Aurora A抑制劑可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。但Aurora A蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的調(diào)控及ROS在Aurora A介導(dǎo)的化療耐藥中的作用仍不明確。

本研究利用慢病毒感染的方式在人卵巢癌細(xì)胞中分別導(dǎo)入Aurora A cDNA和shRNA，構(gòu)建Aurora A過表達(dá)和沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，利用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2’, 7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）等探討ROS在Aurora A介導(dǎo)的化療耐藥中的作用，為卵巢癌的臨床用藥提供參考。

1　材料和方法

1.1　材料和主要試劑

人卵巢癌細(xì)胞株HEY、OVCA429、A2780和OVCA420購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC），A2780順鉑耐藥株A2780/CDDP為課題組自備。病毒包裝細(xì)胞HEK293T購自ATCC。RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，Aurora A抗體、CDK6抗體、p-AMPKα（Thr172）抗體和AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）抗體購自美國CST公司，GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體購自美國Sigma公司，二抗購自美國Sigma公司，DCFH-DA染液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，MTT和順鉑購自美國Sigma公司，N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）購自生工生物工程（（上海）股份有限公司，ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng)選用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，HEK293T的培養(yǎng)選用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的方法參照參考文獻(xiàn)［2］。shAurora A靶向序列為：5’-GUCUUGUGUCCUUCAAAUU-3’。分別構(gòu)建Aurora A過表達(dá)細(xì)胞株OVCA420 Aurora A及對(duì)照細(xì)胞株OVCA420 Vector，Aurora A沉默細(xì)胞株OVCA429 shAurora A及對(duì)照細(xì)胞株OVCA429 shGFP。

1.2.3采用Western blot檢測(cè)蛋白水平

接種等量細(xì)胞于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑）裂解得到全細(xì)胞蛋白，經(jīng)蛋白定量后加入上樣緩沖液配成相同濃度的蛋白樣品，100 ℃，煮樣5 min。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗溫育過夜。洗滌后，加入二抗，室溫溫育1 h，洗滌去除非特異結(jié)合后，利用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。顯影儀器為FlourChem E。

1.2.4采用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量

接種等量細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后，加入10 μmol/L DCFH-DA染液，37 ℃避光溫育30 min。用1×PBS清洗細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下拍照記錄。

接種等量細(xì)胞于酶標(biāo)板中，培養(yǎng)過夜后，加入10 μmol/L DCFH-DA染液，37 ℃避光溫育30 min。用1×PBS清洗細(xì)胞，并在多功能酶標(biāo)儀中讀取熒光值，激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.5采用MTT法檢測(cè)順鉑的IC50

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。按指定濃度加入順鉑和NAC，溫育48 h后小心棄上清，每孔加入180 μL培養(yǎng)基和20 μL MTT（5 mg/mL），溫育4 h后，棄上清，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），溫育10 min，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長下各孔的吸光度（D）值，并利用Graphpad Prism計(jì)算半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）。

1.2.6培養(yǎng)基pH值測(cè)定

接種等量細(xì)胞于6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別在培養(yǎng)24和48 h時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)基于15 mL離心管中，利用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基的pH值［10］。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，結(jié)果以x±s的形式表示，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　細(xì)胞內(nèi)ROS與順鉑耐藥

利用細(xì)胞內(nèi)ROS特異性染液DCFH-DA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與卵巢癌細(xì)胞株A2780相比，順鉑耐藥株（A2780/CDDP）的細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低（圖1A、B），提示在卵巢癌中順鉑耐藥與ROS的降低有關(guān)。在A2780和A2780/CDDP中加入ROS清除劑NAC（5 mmol/L），降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量后，利用MTT法檢測(cè)順鉑的IC50，發(fā)現(xiàn)NAC促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥（圖1C、D），說明降低細(xì)胞內(nèi)ROS促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥。

2.2　Aurora A在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定

Western blot檢測(cè)Aurora A在4種常見卵巢癌細(xì)胞株HEY、OVCA420、A2780和OVCA429中的水平，發(fā)現(xiàn)Aurora A在HEY和OVCA429中高表達(dá)，而在OVCA420和A2780中低表達(dá)（圖2A）。因此，在OVCA420中導(dǎo)入Aurora A cDNA，構(gòu)建Aurora A過表達(dá)細(xì)胞株，即OVCA420 Aurora A，對(duì)照組細(xì)胞導(dǎo)入空載體，即OVCA420 Vector；在OVCA429中導(dǎo)入Aurora A shRNA，構(gòu)建Aurora A沉默細(xì)胞株，即OVCA429 shAurora A，對(duì)照細(xì)胞組導(dǎo)入靶向GFP的shRNA，即OVCA429 shGFP。Western blot檢測(cè)Aurora A及Aurora A下游蛋白細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入Aurora A cDNA后，Aurora A和CDK6的表達(dá)明顯升高，而導(dǎo)入Aurora A shRNA降低了Aurora A和CDK6的表達(dá)（圖2B），說明Aurora A過表達(dá)和沉默細(xì)胞株構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3　Aurora A調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS

DCFH-DA法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ROS，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Aurora A 過表達(dá)，ROS降低；而Aurora A沉默后，ROS升高（圖3A、B），說明Aurora A可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。

圖1　A2780和順鉑耐藥株A2780/CDDP的ROS含量和順鉑的IC50Fig. 1　ROS and IC50 of cisplatin in A2780 and A2780/CDDPA: ROS levels were observed under a fluorescent microscope; B: ROS levels were examined by a multimode reader; C: IC50 values of cisplatin were detected by MTT; D: Statistical analysis of IC50; *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.000 1

圖2　Aurora A的表達(dá)及Aurora A過表達(dá)/沉默細(xì)胞系的鑒定Fig. 2　Expression of Aurora A in ovarian cancer cells and validation of Aurora A in established cell linesA: Detection of the basal level of Aurora A in ovarian cancer cell lines; B: Validation of Aurora A in established overexpresson or knockdown cell lines

2.4　抑制細(xì)胞內(nèi)ROS促進(jìn)Aurora A介導(dǎo)的順鉑耐藥

Aurora A過表達(dá)，ROS降低，細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥，加入NAC進(jìn)一步降低ROS后，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性（圖4A、B）；Aurora A沉默，ROS升高，細(xì)胞對(duì)順鉑敏感，加入NAC降低ROS后，促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥（圖4C、D）。表明ROS參與Aurora A調(diào)控的順鉑耐藥。

2.5　Aurora A抑制ROS的分子機(jī)制

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Aurora A過表達(dá)促進(jìn)AMPK第172位蘇氨酸（Thr172）的磷酸化，而Aurora A沉默后，AMPK磷酸化水平降低（圖5A）。AMPK磷酸化可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入，促進(jìn)糖酵解，抑制ROS生成［11］，提示過表達(dá)Aurora A可能促進(jìn)糖酵解過程。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖酵解關(guān)鍵酶類甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）受Aurora A調(diào)控，Aurora A過表達(dá)，GAPDH表達(dá)升高（圖5A）。糖酵解過程中葡萄糖被代謝生成乳酸，而細(xì)胞培養(yǎng)基中酚紅可指示培養(yǎng)基的酸堿度變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中Aurora A過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（圖5B）。分別收集24和48 h的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，Aurora A過表達(dá)，培養(yǎng)液酸度增強(qiáng)（pH明顯降低），而Aurora A沉默，酸度減弱（圖5B、C）。上述結(jié)果表明，Aurora A促進(jìn)糖酵解過程，抑制ROS。

圖3　Aurora A過表達(dá)/沉默細(xì)胞中ROS水平Fig. 3　ROS levels in Aurora A overexpression or knockdown cell linesA: ROS levels were observed under a fluorescent microscope; B: ROS levels were examined by a multimode reader; **: P<0.01; ***: P<0.000 1

圖4　抑制ROS促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性Fig. 4　Inhibition of ROS promotes chemo-resistanceA: IC50 cisplatin values of cisplatin in OVCA420 cell lines detected by MTT; B: Statistical analysis of IC50 values in OVCA420 cell lines; C: IC50 values of cisplatin in OVCA429 cell lines detected by MTT; D: Statistical analysis of IC50 values in OVCA429 cell lines; *: P<0.05; **: P<0.01; ***:P<0.000 1

圖5　Aurora A促進(jìn)AMPK磷酸化及糖酵解Fig. 5　Aurora A promotes phosphorylation of AMPK and stimulates glycolysisA: Aurora A activates AMPK and upregulates GAPDH; B. pH changes of cell culture supernatants after incubation for 48 h; C: Statistical analysis of pH after incubation for 24 and 48 h

3　討　論

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，在治療過程中容易產(chǎn)生化療耐藥，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平高于正常細(xì)胞，因此，誘導(dǎo)ROS升高可作為腫瘤治療的候選策略［6］。有研究表明，耐藥細(xì)胞株中ROS水平較其對(duì)照細(xì)胞株明顯降低［12］。檢測(cè)卵巢癌順鉑耐藥株A2780/CDDP和對(duì)照組細(xì)胞A2780中的ROS，發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥株中ROS降低，提示ROS在卵巢癌的順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。

以往研究發(fā)現(xiàn)，Aurora A抑制劑可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高，但Aurora A蛋白對(duì)ROS的調(diào)控目前并不清楚。本研究利用病毒感染的方式外源性導(dǎo)入Aurora A cDNA和shRNA，構(gòu)建Aurora A過表達(dá)/沉默細(xì)胞株，檢測(cè)Aurora A對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。結(jié)果表明，Aurora A過表達(dá)，ROS降低；Aurora A沉默，ROS升高。加入ROS清除劑NAC后，細(xì)胞內(nèi)ROS下降，順鉑的IC50增大，表明抑制ROS可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。

AMPK受細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量調(diào)控，當(dāng)AMP與ATP的比值升高時(shí)，AMPK發(fā)生磷酸化活化，增強(qiáng)細(xì)胞的葡萄糖攝取及加速糖酵解代謝［13］。此外，AMPK還可通過調(diào)控FOXO轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)抗氧化酶類如SOD、CAT，從而降低ROS水平［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中導(dǎo)入Aurora A shRNA，細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低，糖酵解相關(guān)基因ALDOC、GLUT1、GLS、PDK1、PFK1、PFKM和RPL23 mRNA顯著降低［15］，提示Aurora A沉默后，糖酵解途徑也受到抑制。本研究結(jié)果表明，Aurora A激活A(yù)MPK，上調(diào)糖酵解酶類GAPDH，并導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液酸度增強(qiáng)，說明Aurora A促進(jìn)糖酵解過程。細(xì)胞代謝向糖酵解轉(zhuǎn)變可抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成［16］，提示Aurora A抑制ROS可能與AuroraA促進(jìn)糖酵解有關(guān)。此外，AMPK介導(dǎo)的抗氧化機(jī)制在Aurora A抑制ROS的過程中是否發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，在卵巢癌中過表達(dá)Aurora A降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平；Aurora A沉默，升高細(xì)胞內(nèi)ROS；并且ROS的降低促進(jìn)了卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性。而Aurora A抑制ROS與AMPK介導(dǎo)的能量代謝方式的轉(zhuǎn)變有關(guān)。

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