SMAP-29抗菌肽的原核表達(dá)、純化及活性檢測(cè)

鄭秋實(shí) 段晨曦 陶鳳云

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

由于耐藥菌感染問(wèn)題日益嚴(yán)重，開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物迫在眉睫?？咕腟MAP-29是來(lái)源于綿羊骨髓的含29 個(gè)氨基酸殘基的Cathelicidin 類抗菌肽［1］，具有高效、廣譜的抗細(xì)菌［2-5］、抗真菌活性［6］，尤其對(duì)于一些耐藥菌具有很強(qiáng)的殺滅活性［7］，是一種較具開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力的抗感染肽。

直接從綿羊骨髓組織中提取并純化天然抗菌肽產(chǎn)量有限，而化學(xué)合成抗菌肽成本高，因此通過(guò)基因工程表達(dá)重組抗菌肽成為主要的手段。Morassuttia等［8］以內(nèi)含子介導(dǎo)的方式在大腸桿菌中融合表達(dá)了SMAP-29，結(jié)果顯示重組肽較化學(xué)合成分子的抗菌活性弱。任耀軍等［9］采用畢赤酵母偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成了SMAP-29基因序列，構(gòu)建了真核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)后在酵母裂解液中檢測(cè)到抗菌肽表達(dá)。肇曉光等［10］利用pTYB11表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)了融合蛋白，幾丁質(zhì)親和層析后獲得可溶性SMAP-29衍生物。但是由于抗菌肽分子小、易被蛋白酶降解、表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主有害，從而影響了基因的高水平表達(dá)。如何高效低成本地利用基因工程技術(shù)制備抗菌肽，成為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用急需解決的問(wèn)題。

pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率高，應(yīng)用廣泛，目前尚無(wú)利用該系統(tǒng)表達(dá)SMAP-29的詳細(xì)研究報(bào)道，本研究以pET-28a（+）質(zhì)粒為基礎(chǔ)，在大腸桿菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式表達(dá)重組抗菌肽SMAP-29，旨在獲得具有天然末端的有生物活性的重組抗菌肽，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pET-28a（+）、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）、藥敏測(cè)試大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均由北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏；PfuDNA 聚合酶、DNA 片段純化試劑盒均購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；LB 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；Ni-NTA Agarose購(gòu)自Qiagen公司；重組腸激酶購(gòu)自Novagen公司。

1.2 方法

1.2.1 基因優(yōu)化與合成 為獲得具有天然氨基端的抗菌肽，對(duì)N端添加了腸激酶切割位點(diǎn)（DDDK）的SMAP29的氨基酸序列腸激酶可在此識(shí)別序列K的羧基端裂解蛋白，用于完全去除SMAP-29天然氨基端之前的額外序列。反推其DNA序列，并根據(jù)大腸桿菌偏好的密碼子進(jìn)行基因序列優(yōu)化，由生工生物工程（上海）有限公司人工合成基因序列并克隆在pUC57質(zhì)粒的EcoR I和Hind III位點(diǎn)之間，命名為pUC57-smap29。

1.2.2 構(gòu)建重組表達(dá)載體 以pUC57-smap29為模板，設(shè)計(jì)正向引物5'-CCCGAATTCGATGACGATGACAAACGC-3'，反向引物5'-GGGCAAGCTTGTCATTAACCGGCAATACG-3'，下劃線依次為EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。利用PfuDNA聚合酶高保真擴(kuò)增smap-29基因片段，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，于4℃保存?zhèn)溆?。獲得的PCR產(chǎn)物回收后，將目標(biāo)基因片段和表達(dá)載體pET-28a（+）同時(shí)分別用EcoR I和Hind III雙酶切，膠回收目標(biāo)基因片段和載體線性片段，將二者按摩爾比（5∶1）用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，篩選重組質(zhì)粒pET28a-smap29，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.3 表達(dá)與純化重組蛋白 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒 pET28a-smap29轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落于含有卡那霉素（終濃度50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)（OD600=0.6），加入0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h。通過(guò)15% SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)情況。

對(duì)于成功表達(dá)出重組蛋白的BL21（DE3）按1%比例接種后擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，4℃離心收集細(xì)胞并洗滌后，冰浴超聲裂解細(xì)胞，高速離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)重組蛋白表達(dá)形式。收集包涵體并用1% Triton X-100洗滌后，用8 mol/L尿素溶解，離心收集上清液，透析過(guò)夜后，進(jìn)行Ni-NTA親和層析，用60 mmol/L咪唑充分洗去雜蛋白后，用300 mmol/L咪唑洗脫目標(biāo)融合蛋白。將融合蛋白透析后調(diào)整濃度至約100 μg/mL蛋白濃度，利用腸激酶37℃水浴12 h切除擔(dān)體序列，將酶切產(chǎn)物上樣進(jìn)行Ni-NTA親和層析，擔(dān)體序列吸附到層析介質(zhì)上，而目標(biāo)肽不被吸附。收集穿柱液，用RP-HPLC進(jìn)一步純化制備目標(biāo)肽。肽濃度和純度經(jīng)Tricine-SDS-PAGE 電泳進(jìn)行分析。

1.2.4 重組肽的抗菌活性檢測(cè) 將測(cè)試菌平板劃線活化后，接種單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；次日按照10%比例接種于新鮮的液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。離心收集測(cè)試菌，用pH7.4 的10 mmol/L PBS洗菌3次，稀釋細(xì)菌至2×106CFU/mL，分別吸取每株細(xì)菌培養(yǎng)物10 μL至無(wú)菌EP 管中，將重組肽梯度稀釋后，各取250 μL分別加入對(duì)應(yīng)的已加入250 μL PBS無(wú)菌EP管中，再?gòu)母髯怨苤腥〕?50 μL加入到對(duì)應(yīng)的已加入菌的EP管中，每組重復(fù)3個(gè)管。37℃條件下振蕩培育8 h，將各管樣品分別作不同倍數(shù)的稀釋，每個(gè)稀釋度分別取100 μL滴種在3個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃溫箱培育18 h，觀察并記錄每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落數(shù)量，取相同稀釋度的3個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板菌落的平均值作為該稀釋度樣品的菌落數(shù)量。計(jì)算抗菌肽濃度與細(xì)菌存活率關(guān)系的曲線。細(xì)菌的存活率（%）=存活細(xì)菌數(shù)/陰性對(duì)照細(xì)菌數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 SMAP-29抗菌肽的序列分析

SMAP-29的氨基酸序列為：RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG，是由29個(gè)氨基酸組成的堿性α-螺旋抗菌肽（抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)http：//aps.unmc.edu/登記號(hào)：AP00155），疏水殘基占37%。ProtParam 軟件的分析結(jié)果表明，其分子量為 3 256.0，理論pI值為12.31，含9個(gè)正電荷氨基酸（Lys+Arg），不含負(fù)電荷氨基酸，總平均親水值（GRAVY）為-0.210，脂肪系數(shù)為121.03，不穩(wěn)定系數(shù)為26.41，屬于穩(wěn)定型肽，其空間結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 SMAP-29結(jié)構(gòu)圖

2.2 構(gòu)建重組表達(dá)載體

選擇pET-28a（+）和大腸桿菌BL21（DE3）系統(tǒng)融合表達(dá)重組蛋白，基因表達(dá)策略如圖2所示。

以重組克隆載體pUC57-smap29為模板，PCR擴(kuò)增出兩端分別帶有EcoR I和Hind III限制酶識(shí)別位點(diǎn)的目標(biāo)基因片段（圖3），大小約為120 bp，與預(yù)期值相符，表明目標(biāo)基因片段擴(kuò)增成功。

圖2 smap-29基因表達(dá)構(gòu)建策略

圖3 smap-29基因的PCR擴(kuò)增

對(duì)因片段smap29與pET-28a（+）連接，構(gòu)成重組表達(dá)載體pET28a-smap29。重組質(zhì)粒pET28asmap29經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后產(chǎn)生兩條帶，圖4中箭頭所指處分別為酶切后的表達(dá)載體和目標(biāo)基因片段。理論計(jì)算可知重組表達(dá)載體大小應(yīng)為5 465 bp，雙酶切大片段應(yīng)為5 350 bp，目標(biāo)基因片段應(yīng)為115 bp，實(shí)際條帶大小均與計(jì)算值相符，初步表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。進(jìn)一步的DNA測(cè)序結(jié)果證明smap-29基因序列與設(shè)計(jì)序列一致，與pET-28a（+）表達(dá)載體連接后讀碼框正確。

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-smap29雙酶切

2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

分別將pET28a-smap29和空白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)到OD600=0.6，加入終濃度0.4 mmol/L的IPTG后降低培養(yǎng)溫度至30℃誘導(dǎo)表達(dá)，分別取空載體和重組載體誘導(dǎo)6 h后的細(xì)胞，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況。如圖5中箭頭所指，誘導(dǎo)后的細(xì)胞總蛋白中新增一蛋白條帶，其分子量低于8 kD，與預(yù)期融合蛋白的分子量相符，表明融合蛋白得到表達(dá)。

圖5 SDS-PAGE 檢測(cè)重組肽誘導(dǎo)表達(dá)

2.4 融合蛋白的純化、腸激酶切割與純化重組肽SMAP-29

按照2.3條件擴(kuò)大培養(yǎng)含pET28a-smap29重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)后，冰浴超聲裂解細(xì)胞，高速離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要以包涵體形式存在于破碎沉淀中。提取的包涵體經(jīng)過(guò)復(fù)性并透析后，進(jìn)行Ni-NTA親和層析，由于融合蛋白帶有His-Tag標(biāo)簽，可吸附到層析介質(zhì)上。經(jīng)咪唑洗脫融合蛋白，結(jié)果（圖6）顯示，得到分子量約為8 kD的融合蛋白，經(jīng)腸激酶裂解后，釋放出分子量約4.4 kD和3 kD的兩個(gè)肽段，與理論計(jì)算的擔(dān)體蛋白和目標(biāo)肽大小相符。在切除擔(dān)體序列后，進(jìn)一步進(jìn)行RP-HPLC獲得了SMAP-29重組肽。

2.5 SMAP-29重組肽抗菌性

圖6 Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白及其裂解產(chǎn)物

SMAP-29重組肽對(duì)測(cè)試菌均具有顯著抗菌活性（圖7），在肽濃度5 μmol/L時(shí)，3種菌的存活率均下降到50%以下。其中對(duì)大腸桿菌（E. coli）抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌濃度MIC為10 μmol/L，對(duì)金黃色葡萄球菌（S. aureus）抑制作用其次，MIC為20 μmol/L，對(duì)白念珠菌（C. albicans）的MIC為40 μmol/L。

圖7 重組SMAP-29在不同濃度下的抗菌性

3 討論

SMAP-29具有廣譜、高效的抗菌作用，是一種較具潛力的抗感染藥物候選分子，今后有可能替代傳統(tǒng)抗生素解決部分細(xì)菌耐藥問(wèn)題。目前關(guān)于SMAP-29抗菌功能及作用機(jī)制的研究大多采用合成肽［11，12］，由于化學(xué)合成成本昂貴，不利于其進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用，而對(duì)基因工程表達(dá)研究還很不充分，為此，我們對(duì)SMAP-29的基因工程表達(dá)制備進(jìn)行了研究。

為了使外源基因能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)，避免由于表達(dá)序列中存在大腸桿菌稀有密碼子而導(dǎo)致的翻譯效率低下，根據(jù)大腸桿菌偏好的密碼子對(duì)基因序列進(jìn)行了優(yōu)化。為了最終獲得不帶有載體序列殘留的天然SMAP-29抗菌肽序列，我們?cè)谀繕?biāo)肽序列N端上游添加了腸激酶切割位點(diǎn)，在目標(biāo)肽序列C端添加了連續(xù)兩個(gè)終止密碼子。選取pET-28a（+）作為表達(dá)載體，通過(guò)EcoR I和Hind III限制酶位點(diǎn)將目標(biāo)肽序列連接到載體中，在Escherichia coliBL21（DE3）中以包涵體形式表達(dá)出重組融合蛋白，避免了對(duì)宿主菌的毒性。由于擔(dān)體蛋白中含有His標(biāo)簽，將包涵體溶解后可以很方便地利用Ni-NTA親和層析獲得純化的融合蛋白，經(jīng)過(guò)腸激酶切割后釋放出兩端均無(wú)任何額外氨基酸引入的SMAP-29抗菌肽序列。許多基因工程制備的重組蛋白含有額外的氨基酸殘留，有些情況下可能對(duì)于其功能影響不大，但是SMAP-29抗菌肽N端或C端額外氨基酸的引入，都會(huì)對(duì)其功能產(chǎn)生影響，因此本研究制備的SMAP-29重組抗菌肽為研究其功能提供了適宜的原材料。

SMAP-29重組抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白念珠菌均具有顯著的抗菌活性，但是其最小抑菌濃度值（MIC）均高于文獻(xiàn)報(bào)道值［13］。這可能與文獻(xiàn)中使用的化學(xué)合成肽C端進(jìn)行了酰胺化修飾有關(guān)，酰胺化修飾可增加正電荷，增強(qiáng)殺菌活性。今后可通過(guò)在目標(biāo)肽C-末端引入天冬酰胺，表達(dá)出相應(yīng)的重組抗菌肽，增強(qiáng)其殺菌活性。

4 結(jié)論

按照大腸桿菌偏好的密碼子合成smap-29抗菌肽基因，并在目的基因的N端添加腸激酶切割位點(diǎn)，同時(shí)在C端添加終止密碼子，通過(guò)EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將目的基因連接到pET-28a（+）表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)出帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白，利用Ni-NTA親和層析純化融合蛋白后，經(jīng)過(guò)腸激酶切割，獲得具有抗菌活性的不帶有額外氨基酸序列殘留的天然SMAP-29抗菌肽序列。

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