羊傳染性膿皰病毒ORF047基因表達(dá)及其蛋白在細(xì)胞中的定位分析

， ，，，，

羊傳染性膿皰(Contagious ecthyma，CE)俗稱羊口瘡(Orf)，是由痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)引起的一種高度嗜上皮性人獸共患病[1]。主要感染羔羊和幼羊，以口、唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰、痂皮為主要特征。ORFV 也能感染人[2-3]，是目前廣泛流行于我國，且危害較嚴(yán)重的人獸共患痘病毒病。由于ORFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜、編碼蛋白種類繁多，限制了人們對(duì)ORFV入侵相關(guān)機(jī)制的研究。

痘苗病毒(VACV)是痘病毒研究的模式病毒， VACV 的L1R蛋白含有250AA，N端包含有2個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)(GlyxxxSer/Thr)，而在ORFV基因組上ORF047命名為L1R，其編碼的蛋白含有245AA,含有3個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)。全長與VACV基因組中的L1R在核苷酸水平上相似性為56.9%，氨基酸水平的同源性為59.8%，在N端的前20個(gè)AA中的二者的同源性達(dá)70%，而且存在相似的結(jié)構(gòu)。我們推測(cè)ORFV ORF047基因編碼的蛋白可能是VACV L1R蛋白的同系物。因此，我們克隆了ORF047基因，并構(gòu)建到真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，了解其表達(dá)和定位情況，為今后后續(xù)篩選與其相互作用的蛋白及該基因在在入侵宿主細(xì)胞過程中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株與病毒株HEK-293T細(xì)胞、Vero-E6細(xì)胞和ORFV/QH02/2010分離株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2載體與試劑pEGFP-N1、pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito和pHcRed1-ER等載體均購自clontech公司；DNA Marker、Primer STARTM GXL DNA聚合酶、dNTPs及病毒DNA快速提取試劑盒等相關(guān)試劑，均購自寶生物工程 (大連) 有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒均購自天根生化科技有限公司；青霉素、鏈霉素、氨芐霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)等抗生素均購自北京索萊寶科技有限公司；EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶、預(yù)染蛋白Marker、胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、無血清OPTI-MEM培養(yǎng)基，脂質(zhì)體3000(LipofectamineTM 3000)轉(zhuǎn)染試劑等均購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；EGFP抗體購自Santa cruz生物技術(shù)公司；PVDF膜購自Millipore公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)在 GenBank 中OV-SA00毒株(NC-005336.1)ORF047基因序列，利用Primer 5.0生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物。克隆引物：ORF 047 F：5′-CGT GAACCA GAC CGT CGT C-3′， ORF 047 R：5′-CCAGTGCACCAC GGG CTT C-3′，用于克隆ORFV ORF047基因，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為735 bp；表達(dá)引物：pEGFP-ORF047 F (HindIII)：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGGGGGCCGCCG-3′，pEGFP-ORF047R (BamH I) 5′-CCGGATCCACGGACGGCGGAAATTC-3′，上述引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.4ORFV ORF 047基因的克隆按照病毒基因組DNA試劑盒說明書提取ORFV/QH02/2010株基因組DNA，并以此為模板， PCR擴(kuò)增ORF047基因。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s、62 ℃退火1 min、72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 4 ℃終止反應(yīng)后，用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并用 DNA 膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物， 在4 ℃與pGEM-Teasy載體鏈接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)EcoR I酶切鑒定為陽性的克隆，送上海生物公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pGEM-ORF 047。

1.5pEGFP-ORF047重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用合成的表達(dá)引物，以pGEM-ORF 047質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，利用HindIII和BamH I限制性內(nèi)切酶雙酶切 PCR產(chǎn)物和pEGFP-N1質(zhì)粒，分別回收、純化目的基因片段和載體片段，再利用T4 DNA連接酶，將 ORF047基因定向插入pEGFP-N1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含KanLB培養(yǎng)基，37 ℃過夜搖菌，提取質(zhì)粒，經(jīng)HindIII和BamH I進(jìn)行酶切鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-ORF047。

1.6重組質(zhì)粒pEGFP-ORF047轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞用QIAGENE 公司的QIAprep spin Mininprepkit 質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒, 并用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度和純度。按照LipofectamineTM3000說明書，轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白、不含插入片段的空載體pEGFP-N1作對(duì)照，轉(zhuǎn)染 24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況。

1.7SDS-PAGE電泳檢測(cè)和Western-blot分析ORFV ORF047基因的表達(dá)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，14 000 r/min離心 10 min，收集沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)行Western bloting檢測(cè)，分析蛋白的表達(dá)情況，具體操作參見文獻(xiàn)[4]。用PBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶400稀釋的兔抗EGFP IgG(一抗)，室溫作用1 h，洗滌3次后，加入1∶8 000羊抗兔HRP IgG 二抗，室溫孵育1 h，再用上述方法洗滌后加加入DAB顯色液，均勻滴加到PVDF膜上，顯色。

1.8ORF047基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位觀察及分析同1.5中確定pEGFP-ORF047能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，試驗(yàn)前在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入滅菌的細(xì)胞爬片，按照轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的方法，將pEGFP-ORF047質(zhì)粒與pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito、pHcRed1-ER質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞。轉(zhuǎn)染36h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗兩次，最后加入PBS維持，輕輕用鑷子夾出細(xì)胞爬片，置于激光共聚焦顯微鏡下對(duì)樣品進(jìn)行掃描觀察熒光蛋白表達(dá)狀況，結(jié)果用LSM Image Browser軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)　果

2.1ORF-047基因擴(kuò)增以提取的病毒基因組DNA作為模板，經(jīng)PCR成功地?cái)U(kuò)增包含有ORFV ORF047基因完整開放閱讀框的基因片段，見圖1，與預(yù)計(jì)大小相符。

M: DL2000 DNA marker; 1-2: PCR products圖1　 ORF-047 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2pEGFP-ORF047重組質(zhì)粒的鑒定以質(zhì)粒 pEGM-ORF047為模板， PCR 擴(kuò)增后得到約 750 bp左右的基因片段， 酶切后插入真核表達(dá)載體 pEGFP-N1，得到pEGFP-ORF047重組質(zhì)粒。pEGFP-N1質(zhì)粒及PCR片段經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶切后得到約為 4. 7 kb 的 pEGFP-N1 片段和約 735 bp的 ORF047 基因片段，測(cè)序證實(shí)目的基因ORF準(zhǔn)確插入到載體中，見圖2。

M: DL2000 DNA marker; 1: PCR products; 2: Product digested by BamHI+Hind III圖2　pEGFP-ORF-047重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2　Restriction enzyme analysis result of recombinant plasmid pEGFP-ORF-047

2.3Western bloting結(jié)果利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。 轉(zhuǎn)染48 h后收集的細(xì)胞SDS-PAGE電泳后，Western bloting檢測(cè)結(jié)果：pEGFP-N1空載體出現(xiàn)約27Kd的目的條帶，而細(xì)胞對(duì)照無條帶, 推測(cè)ORF047與EGFP 融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為 54Kd，結(jié)果在相應(yīng)的位置出現(xiàn) 1 條特異性的蛋白雜交帶，說明目的蛋白得到正確表達(dá)，見圖3A、B。

M: Protein mark; 1 pEGF-ORF-047-N1 plasmid transfected into 293T cells; 2:293T cells; 3: pEGFP-N1 plasmid transfected into 293T cells圖3A　pEGF-PORF-047重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞Fig.3A　pEGF-ORF-047 plasmid transfected into 293T cells圖3B　pEGF-PORF-047重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)的western blotting鑒定Fig.3B　Western blotting of pEGF-ORF-047-N1 plasmid transfected into 293T cells

2.4ORF047基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位pEGFP-ORF047質(zhì)粒與pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito、pHcRed1-ER分別共轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，36h后熒光共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染pEGFP-ORF047+pHcRed1-Nuc質(zhì)粒的細(xì)胞中，pEGFP--ORF047表達(dá)的帶有綠色熒光的蛋白，彌散性的分布于細(xì)胞的胞漿中，不能夠與靶向定位的pHcRed1-Nuc表達(dá)紅色熒光蛋白重疊；同樣pEGFP-ORF047表達(dá)的帶有綠色熒光蛋白也不能夠與pHcRed1-ER表達(dá)的發(fā)紅色熒光蛋白重合；但是部分與pHcRed1-Mito表達(dá)的紅色熒光蛋白有一定的重疊而顯示黃光，這說明ORF047基因編碼的蛋白主要定位在胞漿中，少量分布在線粒體中，見圖4。

紅色熒光為線粒體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光蛋白R(shí)FP發(fā)射熒光；綠色熒光代表綠色熒光蛋白GFP發(fā)射熒光；黃色代表共定位。a-c: pEGFP-ORF047+ pHcRed1-Nuclear plasmid transfected into vero-E6 cell; d-f: pEGFP-ORF047+pHcRed1-Endoplasmic reticulum transfected into vero-E6 cell; h-j: pEGFP-ORF047+pHcRed1-Mtochondria transfected into vero-E6 圖4　共聚焦顯微鏡下觀察 pEGFP-ORF047表達(dá)蛋白在Vero-E6細(xì)胞中的定位Fig.4　Results of pEGFP-ORF047 expressed protein subcellular localization in Vero-E6 cell by cofocal (Scale bar=10 μm)

3　討　論

ORFV是痘病毒科、副痘病毒屬的成員，可引起人、綿羊、山羊以及多種野生動(dòng)物接觸性感染，羊傳染性的暴發(fā)和流行不但嚴(yán)重危害養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展而且威脅人們的身體健康[5-6]。

在VACV中 L1R蛋白是參與入侵融合復(fù)合物的重要蛋白之一，其暴露于MV的表面。研究表明，針對(duì)L1R的特異性抗體、單克隆抗體可以減弱VACA誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，也可抑制病毒的入侵，強(qiáng)烈中和病毒的感染[7]。L1R蛋白在N端有一甘氨酸殘基發(fā)生豆蔻?；?個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，如果突變N 端的甘氨酸不僅阻止VACA的感染，也改變了L1R在胞內(nèi)的位置，減少了胞內(nèi)二硫鍵結(jié)合的構(gòu)象，這證明了L1R在形成復(fù)合物的重要性[8]。也有研究證實(shí)L1R蛋白是細(xì)胞入侵和膜融合的必需分子，且不依賴細(xì)胞表面的GAG[9]。此外，表達(dá)的可溶性的L1R蛋白可阻斷病毒的入侵，并且能與細(xì)胞表面結(jié)合，因此證明L1R蛋白是一種細(xì)胞表面受體結(jié)合蛋白[10-11]。

VACV的L1R研究的較多，但是對(duì)于羊口瘡ORF047編碼的L1R還未見有研究報(bào)道。本研究先克隆了ORFV ORF047基因，與參考的序列核苷酸/氨基酸序列一致性達(dá)到98%以上。將該基因片段插入pEGFP-N1，構(gòu)建了pEGFP-ORF047真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)過培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察到已經(jīng)表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞，通過 Western blotting 試驗(yàn)驗(yàn)證了融合蛋白的大小。本試驗(yàn)對(duì) pEGFP-ORF047表達(dá)蛋白的研究中也利用熒光共聚焦顯微鏡觀測(cè)不僅可以觀察到重組質(zhì)粒pEGFP-ORF047在Vero-E6細(xì)胞中成功表達(dá)而且明確其主要表達(dá)的位置在胞漿中，線粒體中也有少量的表達(dá)。

本研究的結(jié)果，對(duì)后續(xù)研究ORFV編碼的L1黏膜蛋白是否與VACV上編碼的L1在其入侵過程中發(fā)揮一樣作用機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Haig DM，Mercer AA. Ovine diseases orf [J]. Vet Res，1998, 29(3-4):311-326.

[2] Demiraslan H, Dinc G, Doganay M. An overview of Orf virus infection in humans and Animals[J], Recent Pat Antinfect Drug Discov. 2017, 12(1):21-30.

[3] Bergqvist C, Kurban M, Abbas O. Orf virus infection[J]. Rev Med Virol, 2017, DOI: 10.1002/rmv.1932

[4] Sambrook J,Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual[M], 2rd ed.Beijing:Science Press, 1992,336.(in Chinese)

薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社,1992,336.

[5] Rziha HJ, Bauer B, Adam KH, et al. Relatedness and heterogeneity at the near terminal end of the genome of a parapoxvirus bovis 1 strain (B177) compared with parapoxvirus ovis (Orf virus) [J]. J Gen Virol, 2003, 84(5): 1111-1116.

[6] Liu A, Feng J, Xian SM, et al. Construction and expression of recombinant plasmids of OrfV F1L and B2L genes in MDBK cells[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(12): 1124-1128. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.008

劉嬡，馮將，鮮思美，等.羊口瘡病毒F1L和B2L基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2015，31(12):1124-1128.

[7] Foo CH, Lou H, Whitbeck JC, et al. Vaccinia virus L1 binds to cell surfaces and blocks virus entry independently of glycosaminoglycans[J]. Virology, 2009, 385(2): 368-382.

[8] Foo CH, Whitbeck JC, Ponce-de-León M, et al. The myristate moiety and amino terminus of vaccinia virus l1 constitute a bipartite functional region needed for entry[J]. J Virol, 2012, 86(10): 5437-5451.

[9] Bisht H, Weisberg AS, Moss B. Vaccinia virus L1 protein is required for cell entry and membrane fusion[J]. J Virol, 2008, 82(17): 8687-8694.

[10] Foo CH, Lou H, Whitbeck JC, et al. Vaccinia virus L1 binds to cell surfaces and blocks virus entry independently of glycosaminoglycans[J]. Virology, 2009, 385(2): 368-382.

[11] Bengali Z, Satheshkumar PS, Moss B. Orthopoxvirus species and strain differences in cell entry[J]. Virology, 2012, 433(2): 506-512.