Q熱疫苗研究

，　，

Q熱(Q fever)為世界性分布的一種重要人獸共患病，分為急性和慢性兩種類型。急性Q熱主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸疼，常并發(fā)肺炎、肝炎、心肌炎、甚至腦膜腦炎。急性Q熱未完全治愈可發(fā)展為慢性Q熱[1]。貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)為Q熱病原體，一種專性吞噬細(xì)胞內(nèi)寄生的嗜酸性革蘭陰性小球桿菌。貝氏柯克斯體具有感染力強(qiáng)、氣溶膠傳播、理化因素抵抗強(qiáng)、易于儲(chǔ)存等特點(diǎn)，已被有關(guān)國(guó)際組織認(rèn)定為重要生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑[2]。

貝氏柯克斯體能夠引起家畜(特別是牛羊)感染，感染的家畜(特別是孕畜和產(chǎn)奶畜)為人類Q熱暴發(fā)流行的最主要的傳染源[3]。2007-2010年，荷蘭多家農(nóng)場(chǎng)暴發(fā)羊群貝氏柯克斯體感染，并引發(fā)人群Q熱大暴發(fā)。荷蘭Q熱大暴發(fā)更加使人們認(rèn)識(shí)到Q熱暴發(fā)流行對(duì)現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重危害以及加強(qiáng)Q熱預(yù)防重要性。

預(yù)防Q熱最有效手段是疫苗接種。為了對(duì)付外來(lái)貝氏柯克斯體生物武器/生物恐怖劑的攻擊，以及為預(yù)防貝氏柯克斯體對(duì)人和家畜的自然感染，美國(guó)、澳大利亞、俄羅斯、捷克、荷蘭等國(guó)家進(jìn)行了Q熱疫苗研究[2-4]。我國(guó)為畜牧業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，很多地區(qū)存在牛、羊的貝氏柯克斯體感染，人的貝氏柯克斯體感染在我國(guó)也普遍存在。因此，我國(guó)有必要研發(fā)Q熱疫苗以應(yīng)對(duì)可能發(fā)生的Q熱暴發(fā)。

1　滅活貝氏柯克斯體

1965年，前蘇聯(lián)研制了口服減毒Q熱疫苗(M-44)，由于它能夠在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，毒性恢復(fù)可能性使得它不能用于對(duì)人免疫[4]。1989年，澳大利亞學(xué)者采用甲醛滅活I(lǐng)相貝氏柯克斯體(Henzerling株)生產(chǎn)滅活Q熱疫苗(Q-Vax)，Q-Vax是目前世界上唯一獲得藥監(jiān)部門批準(zhǔn)文號(hào)的人用Q熱疫苗，在澳大利亞已經(jīng)用于畜牧業(yè)和屠宰業(yè)的Q熱易感人群的預(yù)防接種10多年，免疫保護(hù)效能幾乎為100%[5]。但是，由于Q-Vax接種動(dòng)物引起發(fā)熱、肝、脾損傷，接種人引起局部紅腫和形成硬結(jié)等，特別是它可引起Q熱抗體陽(yáng)性者嚴(yán)重全身反應(yīng)，因此需要篩選接種人群[5-7]。

滅活I(lǐng)I相貝氏柯克斯體免疫也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫，但是不能有效抵抗I相貝氏柯克斯體感染。I相貝氏柯克斯體為強(qiáng)毒株，II相貝氏柯克斯體為弱毒株，I相菌株具有完整的I相脂多糖并能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生I相和II相特異性抗體，II相菌缺乏完整的脂多糖，僅能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生II相特異性抗體[8]。Peng等[9]研究證明I相脂多糖特異抗體或單克隆抗體能夠有效地中和I相貝氏柯克斯體，阻止其對(duì)巨噬細(xì)胞的入侵。

2　化學(xué)提取組分疫苗

上世紀(jì)80年代末， Williams等采用氯仿—甲醇提取I相貝氏柯克斯體(Nine Mile株)，獲得提取后的組分(chloroform-methanol residual, CMR)做疫苗[7]。采用CMR接種的小鼠、豚鼠、猴、志愿者，攻毒試驗(yàn)證明CMR免疫效果與Q-Vax相當(dāng)，但局部和全身不良反應(yīng)顯著減輕[6-7]。王錫樂(lè)等[10-11]采用中國(guó)分離I相貝氏柯克斯體(新橋株)研制出CMR疫苗；免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其具有用新橋株制備的滅活疫苗一樣好的免疫保護(hù)效能，其免疫副作用則顯著低于滅活疫苗。孫長(zhǎng)儉等[12]采用高壓氣相色譜分析新橋株制備的CMR疫苗和滅活疫苗，發(fā)現(xiàn)滅活疫苗經(jīng)氯仿-甲醇提取后，能夠除去多種脂肪酸和顯著減少某些脂肪酸含量，這些脂肪酸的消除與減少可能是CMR疫苗誘導(dǎo)的局部和全身不良反應(yīng)消失或減輕的主要原因。

上世紀(jì)70年代初，前捷克斯洛伐克學(xué)者采用三氯醋酸提取I相貝氏柯克斯體，獲得可溶性三氯醋酸提取物(trichloroacetic acid extract)?；瘜W(xué)分析顯示三氯醋酸提取物含有蛋白和脂多糖，凝膠電泳和質(zhì)譜分析從中鑒定39個(gè)蛋白，其中15個(gè)為免疫原性蛋白[13]。用三氯醋酸提取物免疫小鼠和兔，免疫動(dòng)物產(chǎn)生貝氏柯克斯體I和II相抗體以及特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。采用三氯醋酸提取物對(duì)1 700多人進(jìn)行免疫，證明其有良好的免疫保護(hù)效能但沒(méi)有明顯副作用[13]。

3　貝氏柯克斯體重組蛋白抗原

Zhang等[14]采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆和表達(dá)了貝氏柯克斯體主要表面抗原，包括27 kD Com1、30 kD P1、34 kD SP34、60 kD熱休克蛋白B(HspB/GroEL)等。Deringer等[15]采用Q熱患者血清做貝氏柯克斯體(Nine Mile株)免疫蛋白質(zhì)組分析，總共鑒定14個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)蛋白抗原，其中8個(gè)為I相和II相菌共有蛋白(EF-Tu、GplK、Mdh、DnaK、EF-Ts、SucD、SucB、Com1)，2個(gè)I相菌特有蛋白(YbgF I和AhpC/Tsa I)和4個(gè)為II相菌特有蛋白(Peptidase M20A family、Rph RNase、Arabinose-5-phosphate isomerase、Hypothetical exported protein)。熊小路等[16]用貝氏柯克斯體感染小鼠血清和Q熱患者血清對(duì)貝氏柯克斯體(新橋株)做免疫蛋白質(zhì)組分析，鑒定7個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)蛋白抗原(GroEL、YbgF、RplL、Mip、OmpH、Com1、Dnak)。王錫樂(lè)等[17]依據(jù)貝氏柯克斯體全基因組序列，克隆和表達(dá)貝氏柯克斯體毒力和毒力相關(guān)基因，制備了104個(gè)貝氏柯克斯體毒力和毒力相關(guān)重組蛋白，并用這些重組蛋白構(gòu)建了貝氏柯克斯體蛋白芯片。用貝氏柯克斯體感染小鼠血清從蛋白芯片中篩選出16個(gè)血清學(xué)反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性蛋白抗原(HspB、Kate、GacA、ApaH、MgsA、SecA、BipA、Lo1A、Ihf-β、Ank4、SecB、Ank2、AhpC-Ts2、EnhA、IcmO、Com1)。焦俊等[18]采用生物素-鏈親和素親和層析以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離鑒定37個(gè)貝氏柯克斯體表面蛋白，并制備出一張含30個(gè)貝氏柯克斯體表面蛋白的蛋白芯片；用貝氏柯克斯體感染小鼠血清和Q熱患者血清分析該蛋白芯片，結(jié)果23個(gè)表面蛋白與半數(shù)以上的貝氏柯克斯體感染小鼠4周血清反應(yīng)陽(yáng)性，其中15個(gè)表面蛋白與半數(shù)以上的Q熱患者血清反應(yīng)陽(yáng)性。

血清學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性抗體，因此采用這些陽(yáng)性蛋白免疫動(dòng)物，然后用I相貝氏柯克斯體毒株攻擊免疫小鼠，以便發(fā)現(xiàn)能夠給予機(jī)體特異性免疫保護(hù)的保護(hù)性抗原。張晶波等[19]建立了貝氏柯克斯體感染BALB/c小鼠動(dòng)物模型以及檢測(cè)貝氏柯克斯體的熒光定量PCR，使評(píng)價(jià)各種免疫原的抗貝氏柯克斯體免疫保護(hù)效能更簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確。熊小路等[20]將GroEL、Mip、Com1等重組蛋白體外刺激BALB/c小鼠骨髓源樹突細(xì)胞(murine bone marrow-derived dendritic cells， BMDC)，然后將不同抗原刺激的BMDC分別經(jīng)腹腔注入正常BALB/c小鼠，攻毒結(jié)果顯示Mip或Com1刺激BMDC受體小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于對(duì)照，首次證明外膜蛋白Mip和Com1能夠激活樹突狀細(xì)胞、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗貝氏柯克斯體免疫應(yīng)答。

尉雁等[21]研究證實(shí)滅活I(lǐng)I相貝氏柯克斯體比I相貝氏柯克斯體能更有效激活BMDC，接受II相激活BMDC小鼠的抗貝氏柯克斯體感染能力明顯強(qiáng)于I相菌激活BMDC受體小鼠，證明脂多糖缺陷II相菌暴露的表面蛋白能夠有效激活BMDC，激活BMDC再將T細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞激活。尉雁等[21]將貝氏柯克斯體3個(gè)重組蛋白抗原(Com1、SecB、EnhA)分別刺激BMDC，結(jié)果Com1或SecB刺激BMDC受體小鼠能有效抵抗貝氏柯克斯體感染，而EnhA刺激BMDC受體小鼠則不能。他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)保護(hù)性抗原Com1或SecB激活BMDC的能力顯著強(qiáng)于EnhA，能夠誘導(dǎo)BMDC產(chǎn)生高水平IL-6和IL-12p40和低水平的IL-10，從而驅(qū)使CD4+T細(xì)胞向Th1(IFN-γ)和Th17細(xì)胞而不向Th2(IL-4)和Treg細(xì)胞分化。王穎等[22]研究發(fā)現(xiàn)保護(hù)性抗原Com1能有效激活人樹突狀細(xì)胞，激活樹突狀細(xì)胞則能激活抗原特異T細(xì)胞，使其朝著Th1 和Tc1分化。

熱休克蛋白能增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的處理和遞呈，有效激活樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、特別是抗原特異T細(xì)胞，從而產(chǎn)生多種細(xì)胞因子去激活和調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫應(yīng)答[23]。李青鳳等[24]采用分子克隆技術(shù)制備出貝氏柯克斯體P1蛋白抗原與熱休克蛋白HspB的融合蛋白(P1-HspB)。用P1-HspB融合蛋白免疫BALB/c小鼠，攻毒后發(fā)現(xiàn)其免疫保護(hù)效能顯著好于單獨(dú)P1蛋白抗原免疫，提示熱休克蛋白HspB的融合能夠顯著提升P1蛋白抗原的免疫保護(hù)效能。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)P1-HspB融合蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的特異性抗體水平顯著高于P1蛋白，其免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖水平以及脾細(xì)胞分泌的IL-2和IFN-水平均顯著高于P1蛋白抗原單獨(dú)免疫[10]。

4　貝氏柯克斯體T細(xì)胞表位

對(duì)滅活I(lǐng)相貝氏柯克斯體疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，I相貝氏柯克斯體誘導(dǎo)的體液免疫在控制貝氏柯克斯體早期感染起重要作用，但是如果貝氏柯克斯體侵入宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)的貝氏柯克斯體清除則依賴T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答[8,25]。機(jī)體T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答依賴貝氏柯克斯體的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位誘導(dǎo)。

4.1CD4+T細(xì)胞表位 Chen等[26]從貝氏柯克斯體免疫優(yōu)勢(shì)蛋白抗原中篩選出CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。熊小路等[27]通過(guò)T細(xì)胞表位在線預(yù)測(cè)軟件分析貝氏柯克斯體7個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)蛋白抗原(Com1、GroEL、Mip、OmpA、OmpH、P1、YbgF)的H2-Ab限制型CD4+T細(xì)胞表位，預(yù)測(cè)出121條15個(gè)氨基酸長(zhǎng)的CD4+T細(xì)胞表位。將人工合成的121條CD4+T細(xì)胞表位肽分別與同源重組蛋白免疫小鼠的CD4+T細(xì)胞共孵育，然后用酶聯(lián)斑點(diǎn)(ELISPOT)法評(píng)價(jià)它們誘導(dǎo)致敏CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的能力。ELISPOT分析篩選出22條能夠誘導(dǎo)致敏CD4+T細(xì)胞分泌高水平IFN-γ的免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽。將這22條免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽再分別刺激貝氏柯克斯體全菌抗原免疫小鼠CD4+T細(xì)胞，經(jīng)ELISPOT評(píng)價(jià)從中篩選出7條源自不同蛋白抗原的免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽。

熊小路等[27]將這7條免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽單獨(dú)或聯(lián)合刺激貝氏柯克斯體全菌免疫小鼠脾細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分析脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞的IFN-γ和TNF-α表達(dá)。結(jié)果顯示7條免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽均能誘導(dǎo)高比例CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ。此外，這7條免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽聯(lián)合誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的水平顯著高于單條表位肽，提示多條免疫優(yōu)勢(shì)表位肽聯(lián)合激活CD4+T細(xì)胞的效能顯著好于單個(gè)表位肽。將這7條免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽單獨(dú)或聯(lián)合免疫C57BL/6小鼠，攻毒結(jié)果顯示CD4+T細(xì)胞表位肽聯(lián)合免疫小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于單個(gè)表位肽，證明多條免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位肽聯(lián)合免疫效果顯著好于單條肽[27]。

4.2CD8+T細(xì)胞表位 熊小路等[28]通過(guò)T表位在線預(yù)測(cè)軟件分析貝氏柯克斯體的24個(gè)分泌蛋白和6個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)外膜蛋白的CD8+T細(xì)胞表位，預(yù)測(cè)出157條H2-Kb、Db限制型9氨基酸長(zhǎng)的CD8+T細(xì)胞表位。將人工合成的157條CD8+T細(xì)胞表位肽分別刺激貝氏柯克斯體感染小鼠CD8+T細(xì)胞，通過(guò)ELISPOT分析篩選出29條能誘導(dǎo)致敏CD8+T細(xì)胞分泌高水平IFN-γ的免疫優(yōu)勢(shì)表位肽；隨后將這29條免疫優(yōu)勢(shì)表位肽分別刺激貝氏柯克斯體感染小鼠CD8+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示這些免疫優(yōu)勢(shì)表位肽均能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ[28]。

4.3李斯特疫苗菌表達(dá)CD8+T細(xì)胞表位肽 將單核細(xì)胞增生性李斯特桿菌(Listeria monocytogenes，LM)2個(gè)與感染以及自身擴(kuò)散相關(guān)的天然毒力因子Internalin B和Act A敲除，構(gòu)建出不引發(fā)機(jī)體感染的LM疫苗菌。LM具有細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)生命周期和強(qiáng)靶向樹突狀細(xì)胞能力，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答[29]。熊小路等[28]將29條貝氏柯克斯體免疫優(yōu)勢(shì)CD8+T細(xì)胞表位基因串聯(lián)后與表達(dá)質(zhì)粒重組，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LM疫苗菌制備出表達(dá)貝氏柯克斯體CD8+T細(xì)胞表位的LM疫苗菌(LM-Cb)。用LM-Cb免疫C57BL/6小鼠，攻毒結(jié)果顯示LM-Cb免疫小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LM疫苗菌免疫小鼠或非免疫小鼠，證明LM-Cb能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效抗貝氏柯克斯體免疫應(yīng)答[29]。

5　結(jié)　語(yǔ)

由于貝氏柯克斯體是專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，不管是滅活還是化學(xué)提取Q熱疫苗，均需要用雞胚大量培養(yǎng)貝氏柯克斯體，然后在高等級(jí)生物防護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用復(fù)雜步驟從雞胚中提取、純化貝氏柯克斯體，這些使Q熱疫苗的生產(chǎn)成本高啟且難以工廠化生產(chǎn)。近十多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者著力研究分子Q熱疫苗，已經(jīng)從研究貝氏柯克斯體保護(hù)性抗原轉(zhuǎn)移到研究誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的T細(xì)胞表位上，期望貝氏柯克斯體CD4+和CD8+T細(xì)胞表位在體內(nèi)高效表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的抗Q熱免疫應(yīng)答。

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