動物源沙門菌的耐藥表型、基因型及流行特征研究

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非傷寒沙門菌(Non-typhoidalSalmonella, NTS)是重要的食源性致病菌之一。人類感染非傷寒沙門菌多與食品相關(guān)產(chǎn)品尤其是肉、蛋、奶等動物性食品產(chǎn)品有關(guān)，動物性食物鏈?zhǔn)侵匾纳抽T氏菌的傳播載體[1]。耐藥性細(xì)菌特別是超級耐藥菌的出現(xiàn)已成為全球人與動物臨床治療的重要挑戰(zhàn)并成為公共衛(wèi)生的嚴(yán)重威脅。在畜牧業(yè)，抗生素常常用作疾病治療及生長刺激劑使用導(dǎo)致動物成為耐藥菌的重要貯存庫[2]。

沙門菌分型方法包括血清學(xué)分型、藥物敏感試驗(Antimicrobial Susceptibility Testing, AST)、脈沖場凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE)及多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)，這類分型方法在確定與追蹤沙門菌的感染及溯源方面起著重要的作用[3-4]。血清分型是監(jiān)測在環(huán)境及動物中沙門氏菌存在與流行的有效工具；細(xì)菌的耐藥特征在流行病學(xué)研究同樣有重要意義，多重耐藥沙門氏菌(Multidrug-Resistant, MDR)如鼠傷寒沙門菌DT104、紐波特沙門菌、德爾卑沙門菌、阿貢納沙門菌引起全球關(guān)注[2-4]。此類沙門菌重要的特征是對9種藥物氨芐青霉素(ampicillin, AMP)、阿莫西林(amoxicillin-clavulanic acid，AMC)、頭孢西丁(cefoxitin，F(xiàn)OX)、先鋒霉素(cephalothin)、頭孢噻呋(ceftiofur)、 氯毒素(chloramphenicol，C)、鏈霉素(streptomycin)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole)、及四環(huán)素(tetracycline，TE) 藥物超級耐藥(super-MDR)。主要原因是此類沙門菌獲得一重要的基因島SGI1(Salmonellagenomic island-1)或此基因島的變體，此類基因島含有多個編碼與耐此類藥物相關(guān)基因，主要是指blaPSE-1 (氨芐青霉素及頭孢類)、floR(氯霉素類/氟苯尼考)、aadA2 (鏈霉素/壯觀霉素)、sul1 (磺胺甲惡唑)、及tet(G) (四環(huán)素)以及后續(xù)發(fā)現(xiàn)的其它相關(guān)變體基因島[4-6]。MLST是一種基于細(xì)菌保守基因序列分型方法，在對病原體流行病學(xué)溯源與監(jiān)控以及傳播者機(jī)制的研究起重要作用[7-8]。

本文通過對動物產(chǎn)業(yè)鏈中沙門菌，主要是雞、豬兩個最重要的食源性動物中的沙門菌進(jìn)行血清分型、MLST分子分型、耐藥表型及耐藥基因型的分析研究，分析動物源性沙門菌耐藥及傳播流行特征，為控制沙門菌通過食物鏈的傳播以減少人與動物相關(guān)疾病提供信息。

1　材料與方法

1.1菌株共收集沙門菌116株。其中56株雞源沙門菌來源于江蘇省雞產(chǎn)業(yè)鏈沙門菌基線調(diào)查所采集的樣本，38株雞源沙門菌來源于揚州大學(xué)動物疫病檢測實驗室對散養(yǎng)及養(yǎng)殖場的的病原分離株；豬源沙門菌22株，主要來源于江蘇省基線調(diào)查的豬活體內(nèi)臟及豬糞。以上這116個菌株均于2012-2013年間收集。所有菌株均參考GB4789.4-2010方法進(jìn)行生化試驗確認(rèn)。

1.2方法

1.2.1血清學(xué)分型參照GB4789.4-2010方法，對所有沙門菌進(jìn)行血清學(xué)分型。

1.2.2藥物敏感試驗藥物敏感試驗使用瓊脂平板擴(kuò)散法參照CLSI(2013)進(jìn)行[9]。主要檢測沙門菌對14類藥物的敏感性：10 μg氨芐青霉素(AMP)、30 μg 阿莫西林(AMC)、30 μg 頭孢噻圬 (CTX)、30 μg 頭孢吡肟 (cefepime, FEP)、75 μg 頭孢哌酮 (cefoperazone, CFP)、30 μg 頭孢曲松 (ceftriaxone, CRO)、10 μg 慶大霉素 (gentamicin, GN)、30 μg 卡那霉素 (kanamycin, K)、 30 μg 阿米卡星(amikacin, AK)、30 μg萘啶酸 (nalidixic acid, NA)、5 μg 環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、25 μg磺胺甲嗯唑 (trimethoprim/sulfamethoxazole, SXT)、30 μg 氯霉素(C)、30 μg 四環(huán)素(TE) (Oxoid Ltd., Basingstoke, England)。使用大腸桿菌ATCC 25922作為試驗參考株。耐藥結(jié)果按照CLSI (2013)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷[9]。

1.2.3MLST分子分型所有的沙門菌均進(jìn)行MLST分子分型[3-4,7-8]。7個沙門菌管家基因(housekeeping genes)aroC,dnaN,hemD,hisD,purE,sucA, 及thrA通過PCR方法擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測序?；蛞锛皵U(kuò)增方法參照MLST官方網(wǎng)站提供的方法進(jìn)行 (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica)，測序的結(jié)果上傳官網(wǎng)可得到相應(yīng)的序列型別(sequence type，ST)，即ST型。

1.2.4耐藥基因的測定本研究中的耐藥基因主要是近年報道的位于SG1基因島及其變體上主要11個耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺酶基因[4,10-12]。主要包括：β-內(nèi)酰胺酶基因：blaTEM-1-like、blaCTX-M、blaOXA-1-like、blaCMY-2、blaPSE及blaSHV；磺胺甲嗯唑：sul1；慶大霉素：aacC4；卡那霉素：aac(6′)-1b；氯霉素：floR；四環(huán)素：tet(G)。PCR擴(kuò)增方法按文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行，見表1[4,10-12]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序并通過BLAST 確認(rèn)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2　結(jié)　果

2.1血清學(xué)分型116株沙門菌共有4個血清型。其中腸炎沙門菌64株，印第安那沙門菌32株，德爾卑沙門菌19株，魯齊齊沙門菌1株。在雞產(chǎn)業(yè)鏈中的56株沙門菌中，31株為腸炎沙門菌，25株為印第安那沙門菌；從病禽獲得的38株沙門菌中，33株為腸炎沙門菌，5株為印第安那沙門菌。而在豬源性22株沙門菌中，19株為德爾卑沙門菌，1株為魯齊齊沙門菌，2株為印第安那沙門菌，見表3。

表1PCR 引物及來源
Tab.1PCR primers

PrimerOligonucleotidesequences(5′→3′)PCRproductsize(bp)ReferenceorsourceblaTEM?1F：TTGGGTGCACGAGTGGGTR：TAATTGTTGCCGGGAAGC503[4]blaCTX?MF：CGATGTGCAGTACCAGTAAR：AGTGACCAGAATCAGCGG585[10]blaOXA?1F：AGCAGCGCCAGTGCATCAR：ATTCGACCCCAAGTTTCC708[4]blaCMY?2F：ACAGAACAACAGATTGCCGATAR：TGTCGCTGCCGTTGATGA856[11]blaPSEF：GCTCGTATAGGTGTTTCCGTTTR：CGATCCGCAATGTTCCATCC575[11]blaSHVF：TTCGCCTGTGTATTATCTCCR：TTTGCTGATTTCGCTCGG807[11]sul1F：CTTCGATGAGAGCCGGCGGCR：GCAAGGCGGAAACCCGCGCC436[4]aacC4F：GTTACACCGGACCTTGGAR：AACGGCATTGAGCGTCAG674[4]aac(6)?1bF：TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTAR：CTCGAATGCCTGGCGTGTTT482[4]floRF：CACGTTGAGCCTCTATATR：ATGCAGAAGTAGAACGCG868[4]tet(G)F：GCTCGGTGGTATCTCTGCR：AGCAACAGAATCGGGAAC500[4]

2.2藥物敏感試驗: 116株2012-2013年收集的菌株中，對萘啶酸、氨芐青霉素、四環(huán)素、頭孢哌酮耐藥率較高，分別達(dá)93.10%、80.17%、73.28%、62.93%；腸炎沙門菌中，對萘啶酸、氨芐青霉素、四環(huán)素、頭孢哌酮耐藥率較高，分別達(dá)94.83%、 89.66%、62.07%、56.90%；豬源德爾卑等沙門菌四環(huán)素、萘啶酸、磺胺甲嗯唑、氯霉素耐藥率較高，分別達(dá)100%、90%、70%、55%；印第安那沙門菌中，對大多數(shù)藥物耐藥達(dá)80%以上，耐藥率最低的阿莫西林達(dá)52.63%。116株菌株對14種藥物耐藥結(jié)果形成49個耐藥譜型。38株印第安那沙門菌共產(chǎn)生21種耐藥譜，其中33株菌株形成對9個以上藥物耐藥譜，有6株對所有藥物耐藥。59株腸炎沙門菌產(chǎn)生14種耐藥譜；3株對9種以上的藥物耐藥；部分菌株形成固定的耐藥譜：AMP-CFP-NA-TE、AMP-CTX-FEP-CFP-CRO-K-NA-C。20株主要為德爾卑豬源沙門菌產(chǎn)生14種耐藥譜，主要對四環(huán)素、萘啶酸、磺胺甲嗯唑、氯霉素耐藥，有2株對9種以上耐藥，見表2、3。

表2116株沙門菌的耐藥情況Tab.2Antibioticresistanceof116strainsofSalmonella

血清型(No．)耐藥率1(%)AMPAMCCTXFEPCFPCROGNKAKNACIPSXTCTE印第安那(38)84．2152．6376．3260．5389．4784．2184．2194．7465．7992．1194．7476．3292．1176．32腸炎(58)89．6612．0713．7915．5256．9017．245．1718．973．4594．831．726．9012．0762．07德爾卑(20)245．0010．005．005．0030．005．0015．0015．0090．0010．0070．0055．00100．00合計(116)80．1725．0032．7628．4562．9337．0731．9043．1023．2893．1033．6240．5245．6973．28

1AMP: 氨芐青霉素AMC:阿莫西林CTX: 頭孢噻圬FEP: 頭孢吡肟CFP:頭孢哌酮CRO:頭孢曲松GN:慶大霉素K:卡那霉素AK:阿米卡星NA:萘啶酸CIP: 環(huán)丙沙星SXT:磺胺甲嗯唑C: 氯霉素TE:四環(huán)素

2包括一株魯齊齊沙門菌

表3動物源沙門菌血清型、分子型、耐藥表型及基因型Tab.3Serotype,ST,antibioticresistancephenotypesandgenotypes

血清型SerotypeST型STtype耐藥譜1Resistanceprofiles耐藥基因(島)Resistantgene(Island)blaTEM?1?likeblaCTX?MblaOXA?1?likesul1aacC4Aac(6′)?1bfloRtet(G)菌株數(shù)No．一、雞源沙門菌(94株)腸炎沙門菌113NA+1NA++1NA1AMP，CFP，NA++6AMP，NA，TE++8AMP，NA，TE+6AMP，AMC，CFP，NA++2AMP，CFP，NA，TE1AMP，CFP，NA，TE+++1AMP，CFP，NA，TE+9AMP，CFP，NA，TE++5AMP，GN，K，NA++1AMP，NA，SXT，TE+1AMP，AMC，CRO，NA，TE++++1AMP，CFP，NA，SXT，TE+1AMP，AMC，K，NA，SXT，TE++++1AMP，CTX，F(xiàn)EP，CFP，CRO，K，NA，C+++++1AMP，CTX，F(xiàn)EP，CFP，CRO，K，NA，C++5AMP，AMC，F(xiàn)EP，CFP，CRO，K，AK，NA，TE+1AMP，AMC，CTX，F(xiàn)EP，CFP，CRO，GN，K，AK，NA+++1AMP，AMC，CTX，F(xiàn)EP，CFP，CRO，GN，K，NA，CIP，SXT，C，TE+++1小計471021443458印第安納沙門菌17++++++1AMP，AMC，CFP，CRO+++++++1K，NA，CIP，TE1GN，K，AK，NA，CIP，SXT，C，TE++++1表3(續(xù))

1.AMP: 氨芐青霉素AMC:阿莫西林CTX: 頭孢噻圬FEP: 頭孢吡肟CFP:頭孢哌酮CRO:頭孢曲松GN:慶大霉素K:卡那霉素AK:阿米卡星NA:萘啶酸CIP: 環(huán)丙沙星SXT:磺胺甲嗯唑C: 氯霉素TE:四環(huán)素

2.3MLST分子分型按Feil等MLST的分型規(guī)則[7]，所有沙門菌可以分為10個ST型 (sequencetype)，即10個ST克隆(clone)：ST11，ST17，ST19，ST40，ST64,ST155，ST68,ST139,ST145，ST2939；其中ST139及ST145是ST68同源復(fù)合體(ClonalComplex,CC)。雞源性沙門菌含有兩克隆即：ST11克隆，全部為腸炎沙門菌；ST17克隆全部為印第安那沙門菌；豬源性沙門菌中主要為ST40克隆，為德爾卑沙門菌。

2.4耐藥基因檢測對11個耐藥基因的檢測，116株2012-2013年收集的菌株中，blaTEM-1-like、bla-CTX-M、blaOXA-1-like、sul1、aacC4、aac6-1b、floR、tet(G) 檢出率分別達(dá)68.97%、37.93%、28.45%、35.34%、30.17%、31.90%、32.21%、20.69%； blaCMY-2、 blaPSE、及blaSHV均未檢出。在ST11克隆(腸炎沙門菌)中，blaTEM-1-like、tet(G)檢出率最高，分別占81.03%和41.38%；在ST17克隆(印第安那沙門菌)中，除tet(G)未檢出外，其余耐藥基因攜帶率都大于65.79%以上，bla-CTX-M、blaOXA-1-like、blaTEM-1-like攜帶率達(dá)89.47%、73.68%及65.79%。在豬源沙門菌(主要為ST40克隆)，耐藥基因較高攜帶者為sul1及blaTEM-1-like，分別為50%及40%。

3　討　論

本調(diào)查從雞場外環(huán)境、肉雞、飼料、屠宰用具、冷水池、分割雞、貯存及配送等環(huán)節(jié)均檢出沙門菌。表明在國內(nèi)動物產(chǎn)業(yè)鏈中，沙門菌污染的公共衛(wèi)生狀況普遍。另一重要的危害因素是國內(nèi)農(nóng)村地區(qū)有大量個體散養(yǎng)、半散養(yǎng)雞群，對防控沙門菌傳播帶來重大挑戰(zhàn)，這一點從散養(yǎng)及小規(guī)模養(yǎng)殖場病禽中檢測出沙門菌所說明。

結(jié)果表明在江蘇及周圍地區(qū)雞是腸炎沙門菌及印第安那沙門菌的宿主，而豬是德爾卑沙門菌的宿主，這一結(jié)果與國內(nèi)外一些報告相似[11, 13-14]。MLST分子分型結(jié)果表明，在整個雞產(chǎn)業(yè)鏈中的檢出的沙門菌，其分子型都是相同的，即腸炎沙門菌屬于ST11克隆，而印第安那沙門菌屬于ST17克隆。動物帶菌傳播到人并對人類健康帶來危害早已被其它研究證明[12, 15-17]。腸炎沙門菌對人體的危害已廣為人知，而印第安那沙門菌在國內(nèi)主要引起動物致病，但其導(dǎo)致人體感染甚至暴發(fā)感染報告近年來有所增加[18-20]。

近年來，多重耐藥菌特別是對廣譜頭孢類抗生素及氟喹諾酮類抗生素的出現(xiàn)并在全世界擴(kuò)散引起了人們的關(guān)注[21-22]。本調(diào)查中，所有沙門菌對青霉素類包括頭孢類藥物氨芐青霉素、頭孢哌酮及喹諾酮類藥物柰啶酮酸、及四環(huán)素高度耐藥，83.05%菌株對于3種以上的藥物多重耐藥(MDR)。不同ST克隆、不同血清型細(xì)菌耐藥特征各不相同。在ST11克隆腸炎沙門菌，耐藥結(jié)果與沙門菌總體情況類似，但出現(xiàn)了幾個固定的耐藥譜型，表明腸炎沙門菌對特定藥物組合耐藥特性，多數(shù)只對4-6種耐藥，屬于中度多重耐藥，與國內(nèi)外其它研究的報道相似[23-26]。豬源沙門菌中，多數(shù)為ST40克隆德爾卑沙門菌，耐藥程度相對較輕，并顯示出了與ST11克隆明顯不同的耐藥譜型。最引人關(guān)注的是ST17克隆印第安那沙門菌對14種藥物顯示出多數(shù)至少對9種以上的藥物的超級耐藥(super-MDR)特征：除了幾乎所有的青霉素類藥物包括第三代、第四代頭孢菌素耐藥外，對氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、氨基糖苷類藥物卡那霉素等高耐藥，且這類藥物特別是頭孢類及氟喹諾酮類是沙門菌臨床治療過程中的首選藥物甚至是最終藥物?？股卦谛竽翗I(yè)及動物包括寵物中的濫用是造成高耐藥出現(xiàn)主要原因。長期以來，抗生素(包括近年來嚴(yán)格在動物的禁用的抗生素)作為生長刺激劑以及疾病的預(yù)防劑一直沒有真正的停止過，尤其是在廣大農(nóng)村地區(qū)的散養(yǎng)及小型養(yǎng)殖戶[2,12,27-29]?？股氐臑E用，導(dǎo)致動物中超級耐藥菌的出現(xiàn)。令人擔(dān)憂的是，這類耐藥菌通過耐藥基因正向同屬菌及其它類菌中擴(kuò)散[12]。減少并嚴(yán)格控制動物中抗生素的濫用及誤用是控制多重耐藥菌特別是超級耐藥菌出現(xiàn)的關(guān)鍵。

導(dǎo)致青霉素類包括頭孢類藥物耐藥的主要原因是由于細(xì)菌攜帶有β-內(nèi)酰胺酶基因。超級耐藥菌基因島如SG1及變體擁有不同的耐藥基因如β-內(nèi)酰胺酶基因、氨基糖苷類基因等，這類多變的基因簇可以在細(xì)菌相同種屬或不同種屬間傳播[4,6,12, 30-33]。在本文中，耐藥基因的攜帶狀況特別是β-內(nèi)酰胺酶基因與耐藥表型相關(guān)性較高。與已有的報道SG1及變體中攜帶有基因blaPSE、blaCMY-2、blaSHV不同[4,6, 27-28]，本研究結(jié)果總體上blaTEM-1-like有較高的攜帶率；而ST17克隆中印第安那沙門菌多數(shù)同時攜帶blaOXA-1-like、blaCTX-M、及blaTEM-1-like基因，blaCTX-M是近十年來發(fā)現(xiàn)的基因[6]；不僅如此在ST17克隆中，floR, aadA2, sul1及aac(6′)-1b有較高的攜帶率。ST11克隆腸炎沙門菌主要對blaTEM-1-like、tet(G)有較高的攜帶率。與耐藥表型結(jié)果類似，不同地區(qū)不同時間不同分子克隆及血清型攜帶的耐藥基因不一樣，可能是菌株所處的環(huán)境及耐藥壓力不同，而導(dǎo)致耐藥基因的產(chǎn)生及傳播出現(xiàn)差異。

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