SIRT1、FoxO3a在DHEA誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢組織中的表達(dá)及意義

何軼然　張治芬　王芳　吳紅艷　賈涔琳　魏雙雙　黃堅(jiān)　卓廣超

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS），是青春期和育齡期婦女常見的生殖內(nèi)分泌疾病，以卵巢分泌的雄激素過多、排卵障礙、糖脂代謝紊亂、月經(jīng)失調(diào)為主要特征，其臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，在育齡期婦女中發(fā)病率高達(dá)5%～10%[1]。近年來大量研究顯示，PCOS患者普遍處于一種慢性輕度炎癥狀態(tài)[2]，其通過炎癥信號傳導(dǎo)通路與胰島素信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行交叉對話，誘發(fā)胰島素抵抗，是PCOS患者胰島素抵抗的始動(dòng)因素和核心環(huán)節(jié)[3]。且PCOS患者體內(nèi)炎癥因子水平與其循環(huán)中雄激素水平呈正相關(guān)[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的脫乙酰酶，SIRT1可通過對組蛋白和非組蛋白以及多種轉(zhuǎn)錄因子的去乙?；饔?，影響多條信號通路，從而參與細(xì)胞衰老凋亡、胰島素分泌、糖脂類代謝、血管生成、炎癥反應(yīng)等過程[5-7]。SIRT1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出卵泡發(fā)育成熟受抑制以及性成熟推遲[8]；而SIRT1基因缺失的小鼠，無論雄雌，均無生育功能[9-10]，提示SIRT1在調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)功能方面有著重要作用。目前關(guān)于SIRT1與PCOS的關(guān)系尚存在爭議，我們找到了SIRT1下游的重要調(diào)控因子——叉頭蛋白盒轉(zhuǎn)錄因子3a（forkhead-box transcription factor 3a，F(xiàn)ox-O3a），該因子在細(xì)胞自噬調(diào)控中具有重要作用。本研究擬通過定位與定量檢測其在大鼠卵巢中的表達(dá)，探討SIRT1/FoxO3a信號通路在PCOS大鼠卵巢發(fā)育中的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑選取21日齡清潔級雌性SD大鼠20只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于（22±2）℃條件下，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。主要試劑：脫氫表雄酮（DHEA）試劑（中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，XW00534303，規(guī)格：98%）、ELISA試劑盒（美國CUSABIO公司）、一抗SIRT1、FoxO3a（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、HRP標(biāo)記山羊抗兔鼠二抗（武漢塞維爾生物科技有限公司）、總RNA提取試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司）、引物：SIRT1、FoxO3a（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組和模型制備大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4d后（25日齡），將體質(zhì)量相當(dāng)（60±10）g的大鼠采用簡單隨機(jī)化分組法分為兩組：PCOS模型組（DHEA組）及正常對照組（NC組），每組10只。DHEA組頸部皮下注射DHEA 6mg/（100g·d）（DHEA溶于0.2ml芝麻油），NC組頸部皮下注射芝麻油0.2ml/d。兩組均持續(xù)給藥20d。1.2.2標(biāo)本采集20d后，給予大鼠10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，2 000r/min離心20min取血清，-80℃凍存待用。摘取大鼠雙側(cè)卵巢組織，剔除周圍的脂肪及結(jié)締組織后，稱重，一側(cè)卵巢經(jīng)液氮浸沒后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，另一?cè)卵巢采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度為5μm。觀察光鏡下（HE染色）形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1動(dòng)情周期監(jiān)測藥物干預(yù)后10d，連續(xù)陰道涂片10d以監(jiān)測大鼠動(dòng)情周期的變化，顯微鏡下大鼠動(dòng)情周期判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）動(dòng)情前期：以大而圓、形狀規(guī)則的有核上皮細(xì)胞為主；（2）動(dòng)情期：以無核的角質(zhì)化細(xì)胞為主；（3）動(dòng)情后期：可見有核上皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞及白細(xì)胞，且3者構(gòu)成比例相當(dāng)；（4）動(dòng)情間期：以大量白細(xì)胞為主。根據(jù)大鼠陰道上皮細(xì)胞是否存在周期性變化來判定造模是否成功。

1.2.3.2相關(guān)激素及生化指標(biāo)測定采用ELISA法測定各組大鼠血清黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）、空腹血糖值（FPG）及胰島素（FINS）水平。采用終點(diǎn)法測定血清HDL、LDL、TC和TG水平。根據(jù)HOMA-IR的計(jì)算公式（HOMA-IR=FPG×FINS/22.5）計(jì)算HOMA-IR指數(shù)值。

1.2.4免疫組化取各組大鼠卵巢組織標(biāo)本，石蠟切片脫蠟至水后置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（PH6.0）的修復(fù)盒中修復(fù)抗原20min，滴加一抗（SIRT1、FoxO3a稀釋濃度為1∶100），4℃孵育切片，過夜。然后滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔鼠二抗覆蓋，室溫孵育50min。DAB顯色，常規(guī)脫水封片，顯微鏡鏡檢，觀察并比較各組棕黃色顆粒的陽性細(xì)胞表達(dá)情況。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA）軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值IOD/AREA（Mean Density）用以定量分析。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）采用總RNA抽提試劑盒提取卵巢組織總RNA。取2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SIRT1引物序列上游：5′-TGACCTCCTCATTGTTATTGGG-3′，下游：5′-GGCATACTCGCCACCTAAC-CT-3′；FoxO3a引物序列上游：5′-AACAGTACCGTGTTCGGACC-3′，下游：5′-AGTGTCTGGTTGCCGTAGTG-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列上游：5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游：5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′。PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃復(fù)性1min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，收集數(shù)據(jù)，采取2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，先采用正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊則采用t′檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1大鼠動(dòng)情周期觀測結(jié)果NC組10只大鼠均保持規(guī)律的4d動(dòng)情周期的陰道涂片變化，排卵率100%。DHEA組動(dòng)情周期均出現(xiàn)紊亂，見大量角化上皮細(xì)胞，排卵率0%。

2.2大體解剖學(xué)及鏡下改變NC組卵巢色澤紅潤，DHEA組卵巢表面偏白，體積增大，隱約見多個(gè)囊狀擴(kuò)張的卵泡。DHEA組HE染色后光鏡下見多個(gè)囊性擴(kuò)張的卵泡，卵泡體積異常增大，見閉鎖卵泡，卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞層局部凹凸不平，顆粒細(xì)胞層幾乎消失不見，卵泡內(nèi)充滿大量的卵泡液；黃體中多見粒黃體細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)大量圓形空泡，間質(zhì)中少量淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1（插頁）。

2.3兩組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較見表1。

由表1可見，DHEA組血清T、TG、LDL水平高于NC組（均P＜0.05）。兩組血清FSH、LH、TC、HDL、FPG、FINS、HOMA-IR水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1　兩組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

2.4兩組大鼠卵巢組織免疫組化染色結(jié)果SIRT1、FoxO3a陽性染色細(xì)胞在兩組卵巢組織中均可見，染色呈淺黃色至深棕色，見圖2（插頁）。平均光密度值定量分析結(jié)果可見DHEA組卵巢SIRT1表達(dá)明顯增加（P＜0.01），F(xiàn)oxO3a表達(dá)水平呈升高趨勢，但與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2　兩組大鼠卵巢組織SIRT1、FoxO3a蛋白平均光密度值比較

2.5兩組大鼠卵巢組織RT-PCR結(jié)果DHEA組大鼠卵巢SIRT1 mRNA 38.75±34.31、FoxO3a mRNA 1.45±0.31，顯著高于NC組（3.46±2.93、0.82±0.15），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見圖3。

圖3　兩組大鼠卵巢組織SIRT1mRNA及FoxO3amRNA表達(dá)比較

3　討論

3.1DHEA誘導(dǎo)PCOS大鼠模型的評價(jià)運(yùn)用DHEA對SD大鼠進(jìn)行PCOS造模是研究PCOS的經(jīng)典造模方法[10]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)DHEA皮下注射20d后，DHEA組大鼠動(dòng)情周期全部失去規(guī)律性變化，提示大鼠無排卵。肉眼可見卵巢體積異常增大，隱約見多個(gè)囊狀擴(kuò)張的卵泡。鏡下顯示卵巢內(nèi)多個(gè)囊性擴(kuò)張的卵泡，卵泡體積異常增大，見閉鎖卵泡，卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞層局部凹凸不平，顆粒細(xì)胞層幾乎消失不見，卵泡內(nèi)充滿大量的卵泡液；黃體中多見顆粒黃體細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)大量圓形空泡，間質(zhì)中少量淋巴細(xì)胞浸潤。DHEA組大鼠血清T、TG、LDL水平明顯增加。以上數(shù)據(jù)表明，本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的動(dòng)物模型無論是從病理形態(tài)學(xué)變化，還是血清激素水平均與PCOS患者相似。說明PCOS大鼠模型制備成功。

3.2SIRT1與PCOS的關(guān)系SIRT1為Sirtuins家族成員之一，在感知細(xì)胞的能量狀態(tài)中可能起著關(guān)鍵作用[11-13]。SIRT1通過去乙?；喾N蛋白（如組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等）修飾的賴氨酸殘基，發(fā)揮對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。在這個(gè)過程中，來自乙酰化底物的乙?；晦D(zhuǎn)移到NAD的ADP-核糖部分，釋放出2-O-乙酰-ADP-核糖[14]，并由NAD+/NADH的比率變化控制SIRT1的活性。（1）SIRT1信號通路通過感知和調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，降低轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1的表達(dá)，降低組蛋白的乙?；揎椝絹戆l(fā)揮抗炎作用[15-16]，從而在體內(nèi)外為暴露于氧化應(yīng)激物的細(xì)胞和組織提供保護(hù)性作用。（2）雷帕霉素及其靶向因子mTOR可通過調(diào)節(jié)SIRT1信號抑制原始卵泡的發(fā)育，從而保留卵泡儲備功能[17-18]。SIRT1被認(rèn)為在與黃體相關(guān)的激素生成（大鼠顆粒細(xì)胞終末分化）的激活中起到了關(guān)鍵作用[19]。

對于PCOS患者，卵泡發(fā)育異常、脂肪代謝紊亂、機(jī)體的慢性輕度炎癥狀態(tài)，均提示SIRT1在PCOS的病理過程可能起到重要調(diào)控作用。Caglayan等[20]發(fā)現(xiàn)PCOS人群的血清SIRT1含量高于健康對照組，猜測這與PCOS人群普遍處于慢性輕度炎癥狀態(tài)相關(guān)。然而Tao等[21]在大鼠上卻得到了相反的結(jié)論，他們認(rèn)為PCOS大鼠卵巢組織SIRT1表達(dá)低于健康對照大鼠，且在二甲雙胍治療后SIRT1的表達(dá)上調(diào)。本研究顯示，PCOS大鼠卵巢中SIRT1蛋白和mRNA水平與正常對照組大鼠相比明顯增加。免疫組化顯示，SIRT1在顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞中均有表達(dá)。在PCOS卵巢的形態(tài)學(xué)觀察可見卵泡中卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞層局部凹凸不平，顆粒細(xì)胞的層數(shù)及細(xì)胞數(shù)明顯減少。因此，我們推測PCOS卵巢因暴露于氧化應(yīng)激狀態(tài)使得SIRT1信號通路反應(yīng)性的增高，從而降低組蛋白的乙酰化修飾水平來發(fā)揮抗炎作用。SIRT1的過表達(dá)又通過對顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞的調(diào)控從而抑制卵泡正常發(fā)育。

本研究經(jīng)ELISA測定DHEA組血清TG、LDL水平顯著高于NC組，PCOS大鼠存在明顯的脂代謝紊亂，提示卵巢SIRT1水平的增高可能與其循環(huán)脂質(zhì)過氧化物的含量增加有關(guān)。目前研究普遍認(rèn)為，PCOS患者脂代謝紊亂與慢性炎癥是互為啟動(dòng)、互為因果的關(guān)系。白細(xì)胞和脂肪組織分泌的細(xì)胞因子作用于細(xì)胞,刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，脂肪組織中分泌一些炎癥因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤到脂肪組織，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)[22]。SIRT1保護(hù)性的升高，這也與Azza等[23]研究結(jié)果一致。

3.3FoxO3a與PCOS的關(guān)系FoxO（forkhead box O）轉(zhuǎn)錄因子是一類關(guān)鍵的自噬調(diào)控因子，以FoxO1、FoxO3的作用最為廣泛。其活性主要受SIRT1的去乙?；{(diào)節(jié)，在細(xì)胞自噬調(diào)控中具有重要作用[24]。目前未見FoxO3a對PCOS影響的相關(guān)報(bào)道。

雖然FoxO3a在大多數(shù)哺乳動(dòng)物組織中高度表達(dá)，但在FoxO3a基因敲除后卵巢中觀察到明顯的紊亂，提示FoxO3a在卵巢功能中具有重要作用。豬卵巢的免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，顆粒層中的FoxO3a染色比卵母細(xì)胞多，表明FoxO3a在顆粒細(xì)胞中具有更重要的作用[25]。這也與本研究的免疫組化結(jié)果一致。近年研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡閉鎖期間，豬顆粒細(xì)胞中FoxO3a的mRNA表達(dá)較高。采用TUNEL法和總FoxO3蛋白染色，發(fā)現(xiàn)FoxO3蛋白在閉鎖卵泡顆粒層高表達(dá)。表明FoxO3a在顆粒細(xì)胞的凋亡中起到調(diào)控作用[25]。本研究顯示，PCOS大鼠卵巢中FoxO3a蛋白和mRNA水平與正常對照組大鼠相比明顯增加。我們推測FoxO3a的激活誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步導(dǎo)致卵泡閉鎖。這是PCOS重要的病理過程，提示其在PCOS的病理發(fā)展中起到重要調(diào)控作用。而這一作用又受到SIRT1的調(diào)節(jié)。

綜上所述，SIRT1/FoxO3a信號通路在PCOS模型大鼠的病理過程中可能通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞發(fā)揮作用，這可能與患者體內(nèi)慢性輕度炎癥相關(guān)。本研究將為進(jìn)一步探討PCOS的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，最終機(jī)制有待細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確定。

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