重組偽狂犬病毒疫苗研制現(xiàn)狀

李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）可感染豬、牛、羊、狗、貓、嚙齒動(dòng)物和禽類等，引起偽狂犬病，常伴發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、生殖障礙和呼吸道癥狀等。PRV基因組大小約為150 kb，含有TK、PK、gE、gI、gE和RR等非必需基因，大量研究表明刪除這些基因并不影響PRV的復(fù)制，這些位點(diǎn)插入外源基因可以降低PRV的毒力，外源基因插入這些位點(diǎn)后可以得到穩(wěn)定表達(dá)[1-6]。

人們先后構(gòu)建了多種PRV減毒株[7-12]，如Bar?tha-K61株（gE-/gI-）、SA215株（TK-/gE-/gI-）、HB98株（TK-/gG-/gE-）、TK-/gE-/lacZ+株、TK-/gG-/lacZ+株、gE-株和gE-/gI-株等，均是理想的疫苗載體。方六榮等[13-15]先后報(bào)道了pIECMV、pgG-uni和pLR001通用載體，這些載體可以將外源基因插入偽狂犬病毒減毒株的基因組中，為構(gòu)建重組偽狂犬病毒提供了有利工具。已構(gòu)建了多種rPRV-EGFP載體[16-19]，為篩選重組偽狂犬病毒提供了方便。國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了大量重組偽狂犬病毒疫苗，這些病原體包括剛地弓形蟲、日本血吸蟲、馬爾他布魯菌、豬園環(huán)病毒Ⅱ型、豬細(xì)小病毒、日本腦炎病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒、豬流感病毒、狂犬病毒和犬瘟熱病毒等。

1 重組偽狂犬病毒抗寄生蟲

1.1 剛地弓形蟲

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，Tg）是弓形蟲病的病原體,其表面抗原1（surface antigen 1，SAG1，又稱P30）具有較強(qiáng)的免疫原性。將20 μg重組SAG1抗原加氫氧化鋁佐劑皮下注射NMR1鼠，可有效對(duì)抗弓形蟲RH株包囊的攻擊[20]。Liu等[21]將SAG1基因插入p8KD得p8KD-SAG1，加入Bartha K61減毒株共同轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞株，篩選重組病毒；用免疫印跡檢測(cè)顯示重組病毒表達(dá)的SAG1蛋白可被陽性血清特異識(shí)別；將6×105PFU重組病毒疫苗肌肉注射免疫BALB/c鼠，ELISA檢測(cè)表明血清IgG在免疫后1～5周升高，免疫后3周達(dá)較高水平；細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)顯示在免疫后4周脾細(xì)胞增殖，脾CTL反應(yīng)升高；此時(shí)用50個(gè)RH株速殖子進(jìn)行腹腔注射攻擊，攻擊后4周免疫組的保護(hù)力為100% （5/5），而對(duì)照組為0（0/5）。

微線體蛋白 3（microneme proteins 3，MIC3）主要存在于弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子等期，研究表明它含有5個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)幾丁質(zhì)連接樣結(jié)構(gòu)域，在弓形蟲識(shí)別、黏附和侵入細(xì)胞過程中起主要作用。將pCD-MIC3免疫CBA/J鼠可有效對(duì)抗弓形蟲76K株包囊的口服攻擊[22]。Nie等[23]將MIC3基因插入pgG-Uni得pgG-MIC3，加TK-gG-EGFP+減毒株共同轉(zhuǎn)染PK15豬腎細(xì)胞株，篩選重組病毒；免疫印跡表明重組病毒表達(dá)的MIC3蛋白可被陽性血清所識(shí)別；將106TCID50重組病毒采用肌肉注射途徑接種BALB/c鼠，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，ELISA表明血清IgG在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后8周達(dá)較高水平，血清中和抗體在初次免疫后6～8周的滴度為1∶64；脾細(xì)胞檢測(cè)顯示初次免疫后8周脾細(xì)胞增殖，并分泌高水平的IFN-γ、IL-2和IL-10等細(xì)胞因子；此時(shí)用100個(gè)Tg速殖子進(jìn)行腹腔注射攻擊，攻擊后4周免疫組的存活率為50% （3/6），而對(duì)照組為0。

1.2 日本血吸蟲

日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，Sj）可引起血吸蟲病，Sj谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（Sj glutathi?one-S-transferase，Sj26GST）和Sj脂肪酸結(jié)合蛋白（Sj fatty acid bingding protein，SjFABP）是2種有希望的疫苗分子。李建國等[24]將重組質(zhì)粒pCDSj26GST-SjFABP肌肉注射免疫BALB/c鼠，可對(duì)抗日本血吸蟲尾蚴的攻擊。Wei等[25]以pVAX-Sj26-Sj14為模板擴(kuò)增Sj26-Sj14基因，插入p8KD得p8KD-Sj26-Sj14，加Bartha K61減毒株轉(zhuǎn)染Vero株，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)患者血清識(shí)別40 000的融合蛋白；將1.2×106PFU重組病毒采用肌肉注射途徑接種綿羊，初次免疫后3周加強(qiáng)1次，ELISA顯示血清IgG在初次免疫后3～6周升高，初次免疫后6周達(dá)較高水平；脾細(xì)胞檢測(cè)表明在初次免疫后6周增殖，分泌高水平的IFN-γ，但不分泌IL-2、IL-4和IL-10，初次免疫后7周腹部貼皮感染40條Sj尾蚴，在攻擊后6周免疫組的減蟲率和減卵率分別為48.5% 和62.0% 。

2 重組偽狂犬病毒抗馬爾他布魯菌

馬爾他布魯菌（Brucella melitensis）可引起布氏桿菌病，又稱波浪熱。BP26是一種高度保守的蛋白質(zhì)，將其免疫小鼠可減少細(xì)菌的攻擊[26-27]。Yao等[28]以馬爾他布魯菌的M5株基因組DNA為模板擴(kuò)增753 bp的BP26基因，插入pIECMV得pIE-bp26，加PRVΔgEΔTK減毒株轉(zhuǎn)染PK-15株，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)患者血清識(shí)別54 000的BP26蛋白；將1×105TCID50重組病毒采用肌肉注射方法免疫BALB/c鼠，初次免疫后2周加強(qiáng)1次，ELISA表明血清IgG在初次免疫后4～6周升高，初次免疫后6周達(dá)較高水平；血清中的中和抗體在初次免疫后6周升高6倍；脾細(xì)胞在初次免疫后6周增殖，脾IFN-γ+SFCs的數(shù)目增加。

3 重組偽狂犬病毒抗病毒

3.1 豬園環(huán)病毒Ⅱ型

豬園環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type2，PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的病原體。PCV2基因組存在2個(gè)開放讀框（ORF），其中ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（replication-related protein，Rep），ORF2編碼衣殼蛋白（capsid pro?tein，Cap），可自身聚合為病毒樣顆粒。Rep和Cap可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生中和抗體[29]。琚春梅等[30-31]以pT-PCV為模板擴(kuò)增730 bp的ORF2基因，插入pgG-uni得pgG-ORF2，加PRV/TK-/gG-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別28 000的ORF2蛋白；將105TCID50重組病毒采用肌肉注射方法接種BALB/c鼠，首次免疫后4周加強(qiáng)1次，ELISA表明血中和抗體在首次免疫后3～8周升高，首次免疫后8周達(dá)較高水平；在首次免疫后8周肌肉注射104TCID50偽狂犬病毒Ea株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周免疫組的存活率為100% （6/6），而對(duì)照組為0（0/6）。

宋云峰等[32]以PCV2基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增705 bp的ORF2，插入pMD18-T得pT-ORF2，與pIECMV重組得pIE-ORF2，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，篩選重組病毒，South?ern印跡發(fā)現(xiàn)ORF2基因插入重組病毒的基因組中，但未進(jìn)行保護(hù)力試驗(yàn)。鈔安軍等[33]將702 bp的ORF2基因插入pG得pG-ORF2，加HB98減毒株轉(zhuǎn)染豬睪丸細(xì)胞株ST，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別27 800的ORF2蛋白；將1×106PFU重組病毒采用肌肉注射途徑免疫昆明種小鼠，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，ELISA顯示免疫鼠血清IgG在初次免疫后5～8周升高，初次免疫后8周達(dá)較高水平；脾細(xì)胞檢測(cè)表明在初次免疫后8周增殖，此時(shí)用1×106PFU豬園環(huán)病毒Ⅱ型NY株腹腔注射攻擊，攻擊后3周取肺，用RT-PCR擴(kuò)增1767 bp的PCV2特異片段，發(fā)現(xiàn)免疫組的保護(hù)力為80% （8/10），而對(duì)照組為0（0/10）。

IL-18是一種細(xì)胞因子佐劑，可促進(jìn)免疫應(yīng)答。Zhang等[34]將702 bp的ORF2基因插入pG得pG-ORF2，將579 bp的IL-18基因插入pG-ORF2得pG-ORF2-IL-18，加HB98減毒株轉(zhuǎn)染PK15株，然后進(jìn)行重組病毒的篩選；從重組病毒抽提基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR可擴(kuò)增出702 bp的ORF2和579 bp的IL-18基因；將107TCID50重組病毒皮下注射BALB/c鼠，初次免疫后2周加強(qiáng)1次，ELISA表明血中和抗體在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后8周達(dá)較高水平；脾細(xì)胞檢測(cè)顯示在初次免疫后8周增殖；FACS發(fā)現(xiàn)脾CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目增加，此時(shí)皮下注射106TCID50的豬園環(huán)病毒Ⅱ型HN株進(jìn)行攻擊，攻擊后3周取肺，發(fā)現(xiàn)免疫組的肺病毒負(fù)荷下降3×104倍。

Ju等[35]以Yu-A株基因組DNA為模板擴(kuò)增960 bp的ORF1和600 bp的ORF2，將ORF1插入pIECMV得pIE-ORF1，再將ORF2基因插入pIEORF1 得 pIE-ORF1-ORF2，加 PRVΔTKΔgEΔgI減毒株轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞株IBRS-2，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別58 000的融合蛋白；將105TCID50重組病毒肌肉注射28 d齡仔豬，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，初次免疫后6周發(fā)現(xiàn)血清IgG升高，外周血單核細(xì)胞增殖。將105TCID50重組病毒肌肉注射BALB/c鼠，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，發(fā)現(xiàn)血清中和抗體在初次免疫后3～8周升高，初次免疫后6周達(dá)較高水平，初次免疫后8周發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞增殖，此時(shí)肌肉注射106TCID50偽狂犬病毒Ea株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周發(fā)現(xiàn)免疫組的存活率為100% （6/6），而對(duì)照組為0（0/6）。

3.2 豬細(xì)小病毒

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是初孕母豬繁殖障礙綜合征的病原體之一。VP2是一種結(jié)構(gòu)蛋白，可自身折疊為VLPs，將其免疫仔豬可誘導(dǎo)有效的保護(hù)力[36-37]。Chen等[38]將VP2基因插入pPI-2EGFP得pPI-VP2，加SA215減毒株轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別93 000的VP2蛋白；將5×105TCID50重組病毒肌肉注射6月齡初孕母豬，血清中和抗體在免疫后4～16周升高，免疫后16周達(dá)較高水平，在免疫后11周靜脈注射106.5TCID50豬細(xì)小病毒SC1株進(jìn)行攻擊，免疫組的分娩后仔豬死亡率為3.6% （1/28），而對(duì)照組為22.6% （7/31）。

呂建強(qiáng)等[39]以PPV的RF株基因組DNA為模板擴(kuò)增VP2基因，插入pMD18-T得pMD-VP2，與pUSK重組得pUSK-VP2，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，然后進(jìn)行重組病毒的篩選，免疫印跡表明重組病毒表達(dá)的64 000的VP2蛋白可被陽性血清所識(shí)別。付朋飛等[40]將VP2基因插入pG得pG-VP2，加HB98減毒株轉(zhuǎn)染豬睪丸細(xì)胞ST，進(jìn)行重組病毒的篩選，免疫印跡表明重組病毒表達(dá)的64 000的VP2蛋白可被陽性血清識(shí)別；將1×106PFU重組病毒采用肌肉注射方法接種昆明鼠，初次免疫后2周加強(qiáng)1次，ELISA表明血清中和抗體在初次免疫后1～7周升高，初次免疫后7周達(dá)較高水平；FACS顯示在初次免疫后7周，脾CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目增加，此時(shí)皮下注射102.95TCID50偽狂犬病毒NY株進(jìn)行攻擊，攻擊后3周免疫組的存活率為100% （5/5），而對(duì)照組為 0（0/5）。

3.3 日本腦炎病毒

日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是日本腦炎的病原體。膜前蛋白（premem?brane protein，PrM）、外膜蛋白（envelope glycopro?tein，E）及非結(jié)構(gòu)蛋白 1（nonstructural protein 1,NS1）均是糖基化蛋白，將它們的DNA疫苗免疫小鼠和仔豬可產(chǎn)生一定的保護(hù)力[41-42]。李自力[43-44]以JEV的SA14-14-2株總RNA為模板擴(kuò)增558 bp的PrM基因，插入pgG-uni得pgG-prM，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)患者血清識(shí)別19 000的PrM蛋白；將105.0TCID50重組病毒采用足墊注射方法接種BALB/c鼠，首次免疫后4周加強(qiáng)1次，在首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)血中和抗體滴度為1∶160，血PBMC的CTL活性升高，此時(shí)肌肉注射105.0TCID50偽狂犬病毒鄂A株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周免疫組的存活率為100% （8/8），對(duì)照組為0（0/8）。

Xu等[45]以JEV SA14-14-2株總RNA為模板擴(kuò)增1.2 kb的NS1基因，插入pMD-18T得pMDNS1，與pUSK重組得pUSK-NS1，加PRV減毒株轉(zhuǎn)染倉鼠腎細(xì)胞株BHK-21，篩選重組質(zhì)粒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別46 000的NS1蛋白；將105PFU重組質(zhì)粒肌肉注射BALB/c鼠，免疫后1周肌肉注射106.5PFU偽狂犬病毒Ea株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周免疫組的存活率為100% （10/10），而對(duì)照組為 0（0/10）。

Qian等[46]將PrM-E融合基因插入pCAGGS得pCAGGS-prM-E，與pIECMV重組得pIE-prM-E，加PRVΔTKΔgE減毒株轉(zhuǎn)染PK-15株，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別19 000的PrM蛋白和53 000的E蛋白；將1×106TCID50重組病毒采用肌肉注射途徑免疫BALB/c鼠，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，ELISA顯示血清中和抗體在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后6周達(dá)較高水平，在初次免疫后8周發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ，此時(shí)腹腔注射1×107PFU日本腦炎病毒SX09S-01株進(jìn)行攻擊，攻擊后10 d免疫組的存活率為80% （8/10），而對(duì)照組為10% （1/10）。

3.4 豬瘟病毒

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）是豬瘟的病原體，外膜糖蛋白E2（envelope glco?protein 2，E2）是一種有效的免疫原，將重組Ad-E2免疫仔豬可對(duì)抗CSFV的攻擊[47]。Wang等[48]將CMV-E2基因插入p0K-LR得p0K-CMV-E2，加Bartha-K61減毒株轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別50 000的E2蛋白；將106TCID50重組病毒采用肌肉注射途徑接種6周齡仔豬，初次免疫后3周加強(qiáng)1次，ELISA表明血中和抗體在初次免疫后2～5周升高，初次免疫后5周達(dá)較高水平，滴度為1∶32；在初次免疫后5周肌肉注射106TCID50豬瘟病毒shimen株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周免疫組的存活率為100% （5/5），而對(duì)照組為 0（0/5）。Lei等[49]將 104、105和 106TCID50的重組病毒肌肉注射仔豬，首次免疫后3周加強(qiáng)1次，首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)各組血中和抗體分別為 1∶152、1∶360和 1∶737，此時(shí)肌肉注射 106TCID50豬瘟病毒shimen株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周取血和鼻拭子，RT-PCR查豬瘟病毒的特異靶基因，發(fā)現(xiàn)各組的病毒排出率為60% （3/5）、0（0/5）和0（0/5），各組的存活率分別為60% （3/5）、100% （5/5）和100% （5/5）。

3.5 豬繁殖與呼吸綜合征病毒

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproduc?tive and respiratory syndrome virus，PRRSV）基因組的ORF5和ORF6分別編碼包膜糖蛋白GP5和非糖基化膜蛋白M，在病毒顆粒中通常以異二聚體形式存在。將GP5/M的DNA疫苗免疫仔豬可誘導(dǎo)中和抗體，有效對(duì)抗PRRSV的攻擊[50-51]。錢平等[52]以PRRSV的總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增765 bp的GP3基因，插入pgG-uni得pgG-GP3，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株，共同轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別43 000的GP3蛋白。方六榮等[53]以pMD-ORF5擴(kuò)增607 bp的ORF5基因，插入pgG-uni得pgG-ORF5，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別25 000的GP5蛋白；將106TCID50重組病毒皮下注射免疫BALB/c鼠，首次免疫后4周加強(qiáng)1次，ELISA顯示在首次免疫后8周血中和抗體不升高。

ORF5m表位是在ORF5的N端覆蓋表位與中和表位之間插入通用Th細(xì)胞表位PADRE形成的，該表位編碼GP5m蛋白。牛皰疹病毒Ⅰ型有一種VP22蛋白，具有獨(dú)特的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可提高與之整合的外源蛋白的遞呈效率，增強(qiáng)免疫原性。江云波等[54]以PRRSV基因組DNA為模板擴(kuò)增650 bp的ORF5m基因，插入pMD18-T得pMDORF5m，與pIECMV重組得pIE-ORF5m，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別27 000的ORF5m蛋白；將1×105TCID50重組病毒用肌肉注射方法接種BALB/c鼠，首次免疫后4周加強(qiáng)1次，首次免疫后10周發(fā)現(xiàn)血清IgG升高，滴度1∶16，脾細(xì)胞增殖。趙武等[55-56]分別以pIECMV-ORF5m、pCMVRA-ORF6和pMRVP22為模板擴(kuò)增650 bp的ORF5m、550 bp的ORF6和780 bp的VP22基因，將它們分別插入pIECMV的相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建pIE-VP22/ORF5m/ORF6，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別60 000的VP22-E和52 000的VP22-M蛋白；將105TCID50重組病毒采用肌肉注射途徑接種BALB/c鼠，首次免疫后4周加強(qiáng)1次，ELISA表明在首次免疫后10周血清中和抗體滴度為1∶32～1∶64，脾細(xì)胞增殖。田志軍等[57]將 pUC-GP5與pBdTK-Uni重組得pUni-GP5，與pBS-lacZ重組得pGP5-lacZ，加PRV減毒株轉(zhuǎn)化Vero株，進(jìn)行重組病毒的篩選，免疫印跡表明重組病毒表達(dá)的34 000的GP5蛋白可被陽性血清識(shí)別；將1×107PFU重組病毒滴鼻免疫小豬，初次免疫后4周肌肉注射1×107PFU重組病毒進(jìn)行加強(qiáng)，初次免疫后9周血中和抗體升高，此時(shí)用105TCID50豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-1a株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后1周免疫組的存活率為100% （4/4），對(duì)照組為0（0/3）。

Qiu等[58]將pGP5-lacZ與pSTK重組得pGP5K-lacZ，加Bartha-K61減毒株轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞株，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別38 000的GP5融合蛋白；將107PFU重組病毒肌肉注射4周齡仔豬，免疫后4周用106.5TCID50豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-1a株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后4周免疫組臨床癥狀好轉(zhuǎn)，肺病理減輕，血IgG升高，肺組織無病毒負(fù)荷。Jiang等[59]將GP5基因插入pIECMV得pIE-GP5，將M基因插入pIE-GP5得pIE-GP5-M，加PRVΔTKΔgE減毒株轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別48 000的GP5-M融合蛋白；將1×106PFU重組病毒肌肉注射4周齡仔豬，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，初次免疫后6周血中和抗體升高，脾細(xì)胞增殖，初次免疫后9周用5×105TCID50豬繁殖與呼吸綜合征病毒YA1株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后3周取肺，RT-PCR擴(kuò)增PRRSV的ORF-7基因，發(fā)現(xiàn)免疫組肺病毒負(fù)荷為0（0/5），而對(duì)照組為100% （5/5）。

3.6 口蹄疫病毒

口蹄疫病毒（Foot andmouth disease virus，F(xiàn)MDV）可引起家畜的口蹄疫。P1-2A是FMDV的殼蛋白前體，在蛋白水解酶3C作用下裂解為VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1和VP2含有許多細(xì)胞表位，將它們的DNA疫苗免疫仔豬、小鼠或豚鼠均可產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[60-61]。金梅林等[62]以pMD-P1為模板擴(kuò)增P1基因，插入pgG-uni得pgG-P1，加PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同 轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，進(jìn)行重組病毒的篩選，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別80 000的P1蛋白?？軘⒌萚63]以FMDV基因組DNA為模板擴(kuò)增VP1基因，插入pEGFP-CI得 pEGFP-VP1，與 pPolyⅡ-PRVΔPK 重組得 pPRVΔPK-VP1，加 PRV/TK-/gE-/lacZ+減毒株共同轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，進(jìn)行重組病毒的篩選，RTPCR發(fā)現(xiàn)從重組病毒抽提的總RNA可擴(kuò)增出823 bp的VP1基因。Hong等[64]將P1-2A基因插入pIECMV得pIE-P1-2A，將VP2基因插入pIE-P1-2A得pIE-P1-2A-VP2，加PRV減毒株轉(zhuǎn)染PK-15株，進(jìn)行重組病毒的篩選；從重組病毒抽提基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR可擴(kuò)增出2.3 kb的P1-2A和0.44 kb VP2基因；將1×105TCID50重組病毒采用肌肉注射途徑接種BALB/c鼠，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，ELISA表明血中和抗體在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后6周達(dá)較高水平，在初次免疫后8周肌肉注射107TCID50偽狂犬病毒Ea株進(jìn)行攻擊，攻擊后3周免疫組的存活率為100% （8/8），而對(duì)照組為0（0/8）。

FHG是一個(gè)復(fù)合表位基因，含6個(gè)VP2的B細(xì)胞表位、1個(gè)VP1的T細(xì)胞表位和1個(gè)3A的T細(xì)胞表位。He等[65]將FHG基因插入pIECMV得pIEFHG，將P1基因插入pIE-FHG得pIE-FHG-P1，加PRVΔTKΔgG減毒株轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，篩選重組病毒，Southern印跡證實(shí)2.3 kb的FHG-P1基因整合入PRV基因組中；將1×105TCID50重組病毒肌肉注射5周齡仔豬，初次免疫后4周加強(qiáng)1次，在初次免疫后8周血中和抗體升高，PBMC明顯增殖。Zhang等[66]將P12A3C基因插入pIECMV得pIEP12A3C，加PRVΔTKΔgG減毒株轉(zhuǎn)染IBRS-2株，篩選重組病毒，免疫熒光發(fā)現(xiàn)重組病毒表面存在融合蛋白分子；將106TCID50重組病毒肌肉注射6周齡仔豬，初次免疫后3周加強(qiáng)1次，發(fā)現(xiàn)血中和抗體和PBMC在初次免疫后2～3周升高，初次免疫后15周達(dá)較高水平，在初次免疫后5周肌肉注射103ID50FMDV進(jìn)行攻擊，攻擊后10 d免疫組的存活率為60% （3/5），而對(duì)照組為0（0/5）。

3.7 豬流感病毒

豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）是豬流感的病原體，其RNA第5節(jié)段編碼的血凝素（hemagglutinin，HA）是一種主要表面糖蛋白，將其DNA疫苗免疫仔豬可對(duì)抗SIV攻擊[67]。李敏等[68]以SIV基因組DNA為模板擴(kuò)增H1A基因和H3A基因，將H1A插入pIRESneo得pIRES-H1A，與pUC-TK重組得pUC-P-H1A，將H3A插入pUC-PH1A得pUC-P-H1A-H3A，加PRV減毒株共同轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，然后進(jìn)行重組病毒的篩選，免疫印跡表明重組病毒表達(dá)的60 000的HA蛋白可被陽性血清識(shí)別。

Klingbeil等[69-70]人工合成密碼子優(yōu)化的HAsyn和NAsyn，分別插入pCDNA3-1得pCD-HAsyn/NAsyn，與 pRRV-BaΔgGG 重 組 得 pPRV-HAsyn/NAsyn，加PRV減毒株共同轉(zhuǎn)染PK13細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別75 000的HA和70 000的NA蛋白；將2×107PFU重組病毒肌肉注射仔豬，首次免疫后3周加強(qiáng)1次，在首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)血IgG升高，F(xiàn)ACS證實(shí)血PBMC中激活B細(xì)胞（CD3-CD2-CD21+）和記憶B細(xì)胞（CD3-CD2-CD21-）的數(shù)目均明顯增加，此時(shí)用2×106TCID50豬流感病毒H1N1株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后2～4 d取血和鼻拭子，RT-PCR擴(kuò)增H1N1株的M基因，發(fā)現(xiàn)免疫組的病毒負(fù)荷下降1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

Tian等[71]將HA基因插入pBdTK-Uni得pUni-HA，與 pBS-lacZ重組得 pLTK-HA，加 PRV Bar?tha-K61株轉(zhuǎn)染PK-15株，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)陽性血清識(shí)別60 000的HA蛋白；將1×105PFU重組病毒采用滴鼻途徑接種BALB/c鼠，ELI?SA顯示血清IgG在免疫后1～4周升高，免疫后3周達(dá)較高水平，在免疫后4周用1×105TCID50豬流感病毒H3N2株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后2周取肺，免疫組的肺組織病毒負(fù)荷為0，肺組織病變減輕。

3.8 狂犬病毒

狂犬病毒（Rabies virus）是狂犬病的病原體，狂犬病毒的糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RGP）具有較強(qiáng)的免疫原性[72]。Yuan等[73]將RGP基因插入peGFPC1得peGFP-RGP，與p8AA重組得p8AA-RGP，加PRV減毒株轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，進(jìn)行重組病毒的篩選，免疫熒光發(fā)現(xiàn)特異熒光抗體識(shí)別重組病毒表達(dá)的融合蛋白分子；將2×107PFU重組病毒免疫比格犬，發(fā)現(xiàn)血清中和抗體在免疫后2～26周升高，免疫后6周達(dá)較高水平，滴度 為 1∶128。 袁子 國 等[74]將 103、104、105和 106TCID50重組病毒經(jīng)由肌肉注射分別免疫比格犬，免疫后5周血中和抗體的滴度分別為1∶23、1∶30、1∶48和1∶53，此時(shí)皮下注射6×104LD50狂犬病毒CVS-11株進(jìn)行攻擊，攻擊后30 d各組的存活率分別為50% （5/10）、60% （6/10）、100% （10/10）和100% （10/10），而對(duì)照組為0（0/10）。

3.9 犬瘟熱病毒

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）的H基因編碼的糖蛋白H在該病毒的融合、生長(zhǎng)和細(xì)胞嗜性等方面具有重要作用，將其DNA疫苗免疫幼犬可誘導(dǎo)較強(qiáng)的保護(hù)力[75]。李業(yè)偉等[76]將pMD-H與pDNA3.1重組得pCD-H，與p8AA重組得p8AA-H，加PRV減毒株共同轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫電鏡發(fā)現(xiàn)直徑22 nm的陽性病毒顆粒。

4 結(jié)語

偽狂犬病毒的宿主范圍廣，不感染人體，可減少不必要的公眾恐慌；其基因組的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，遺傳背景清晰，無致癌性；基因組可插入大于10 kb的外源基因，能夠穩(wěn)定表達(dá)，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞，產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫應(yīng)答；重組偽狂犬病毒可以口服和滴鼻接種，簡(jiǎn)便有效；但偽狂犬病毒的早期感染可能干擾重組偽狂犬病毒的復(fù)制，降低疫苗的免疫效率，影響加強(qiáng)免疫，可先用DNA免疫，再用重組PRV疫苗加強(qiáng)克服其不足。

隨著現(xiàn)代生物科技的發(fā)展，偽狂犬病毒的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及表觀遺傳學(xué)已得到比較廣泛和深入的研究，這對(duì)于弄清偽狂犬病毒抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要意義，有助于篩選新的抗原分子，從而構(gòu)建由各期抗原分子組成的多期多價(jià)疫苗。須進(jìn)一步探討它們的免疫原性、轉(zhuǎn)化效率、MHC限制性以及能否長(zhǎng)期在宿主體內(nèi)表達(dá)，研制新型佐劑、疫苗載體和制備融合抗原也勢(shì)在必行。還須積極探索重組偽狂犬病毒的免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫間隔時(shí)間和免疫接種途徑等，而闡明這些問題必將推動(dòng)重組偽狂犬病毒疫苗的研究勢(shì)頭。