吡格列酮對大鼠腦出血后炎癥因子的影響

韓寧　吳丹紅　黎佳思　丁素菊　鄧本強　畢曉瑩

腦出血是一種致死、致殘率較高的疾病，目前認為炎癥、自由基以及細胞凋亡是造成腦損傷的重要環(huán)節(jié)[1-2]。吡格列酮(pioglitazone，Pio)屬于噻唑烷二酮類藥物，通過激活過氧化小體增殖劑激活型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR γ)改善胰島素抵抗，控制血糖水平，臨床上被廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARr激動劑可通過抑制組織炎癥反應(yīng)起到神經(jīng)保護作用[4-6]，但其對于腦出血所致腦損傷的影響及相關(guān)機制未見報道。本研究采用2次注血/退針法制備大鼠腦出血模型，觀察吡格列酮對大鼠腦出血后腦組織炎癥反應(yīng)的影響，探討吡格列酮在大鼠腦出血性損傷中的保護作用及可能機制。

1　材料及方法

1.1器材與試劑

吡格列酮(sigma公司)；腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor，TNF-α)抗體、肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Cell Signaling公司)、TNF-α ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)；石蠟切片機(Leica RM2235)；LeicaHI1220水平干式烘干儀；立體定位儀(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)；OLYMPUS熒光顯微鏡；Image Pro Expess分析系統(tǒng)、酶標儀(Bio-TEK公司synergy HT型，美國)。

1.2實驗動物

健康SD雄性大鼠72只，體重250～300 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供提供(實驗動物使用許可證號2007-0005)，實驗大鼠自由攝取飲水，常規(guī)條件飼養(yǎng)。

1.3大鼠模型的制備和分組

大鼠術(shù)前8 h禁食，不禁水；60只大鼠參照Deinsberger[7]、周中和等[8]的報道方法采用2次注血/退針法，即緩慢注射自體血100 μL至基底節(jié)制成大鼠ICH模型。大鼠模型成功標準：參照Bederson等[9]的方法,即神經(jīng)功能缺損評分≥2分。以大鼠腦切片中有明顯血腫存在為模型制備成功。

將60例造模成功的大鼠隨機分為5組，每組各12只。持續(xù)吡格列酮組：造模前6h給予胃灌注吡格列酮，造模后維持原劑量；術(shù)前吡格列酮組：造模前6 h給予胃灌注吡格列酮，造模后停用；術(shù)后吡格列酮組：造模前不給藥，造模后給予胃灌注吡格列酮；模型組：造模前后均不給予吡格列酮灌注；假手術(shù)組：同一部位進針注血，不給予吡格列酮灌注。另外選取12例未造模的正常大鼠作為正常組。吡格列酮胃灌注15 mg·kg-1·d-1，1次·d-1，持續(xù)3 d。

1.4行為學評定

大鼠參照Ohlsson[10]、Garcia[11]和De Ryck[12]等描述的神經(jīng)行為學評分方法。神經(jīng)行為學評分于術(shù)后72 h處死大鼠前由1名非手術(shù)人員盲法進行。評分標準(總分14分，分數(shù)越低癥狀越重)為(1)平衡木試驗：將大鼠放在一根長84 cm，寬2.4 cm的木條上，看其能否早過去。0分為掉下來；1分為未掉下來，但不能走；2分為在行走時掉下來；3分為能走過去，但患側(cè)后肢不起作用；4分為能走過去，超過50%的步子打滑；5分為能走過去，偶爾打滑；6分為順利走過；(2)提尾行走試驗：輕提大鼠尾巴末端，使后肢離地行走。0分為無法行走；1分為左前肢稍有伸展，行走時向左打轉(zhuǎn)；2分為左前肢較右前肢伸展少，稍向左傾行走；3分為雙前肢對稱伸展，沿直線協(xié)調(diào)行走；(3)四肢協(xié)調(diào)運動試驗：輕提大鼠尾巴末端，使其懸空觀察四肢的協(xié)調(diào)運動。0分為左前肢不移動；1分為左側(cè)肢體很少伸展；2分為左側(cè)肢體較右側(cè)伸展少或慢；3分為四肢協(xié)調(diào)伸展；(4)四肢放置試驗：該試驗由De Ryck等[12]加以簡化和改良。0分為不能正確放置左側(cè)肢體；1分為不能完全正確或者放置肢體動作緩慢(>2 s)；2分為迅速準確的放置。

1.5PPARγ蛋白表達水平測定

每組隨機取6只大鼠在腦出血模型建立成功后72 h處死，立即取全腦，用冰生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱取部分腦組織重量，用勻漿器勻漿后放入離心管中，加入100 uL RIPA裂解液，至細胞完全裂解；使用BCA蛋白定量法測定PPARγ蛋白表達水平。蛋白質(zhì)變性后放置100 g/L SDS-PAGE柱上進行電泳分析；電泳后轉(zhuǎn)移至經(jīng)甲醇活化的PVDF膜上，并在5%脂肪粉溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合；棄去封閉液后膜中加入PPARγ抗體、β-actin抗體，4 ℃搖晃過夜，PBST洗膜3次，每次5 min；加入HRP標記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標準，室溫孵育膜1 h；TBS/T洗膜3次，每次5 min；將膜置于pierce化學發(fā)光試劑盒中2種試劑等比例混合為反應(yīng)液中室溫孵育1 min，去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光對膜進行掃描分析，其表達水平為目標蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比。

1.6TNF-α蛋白、NF-κB蛋白表達水平測定

各組剩余6只大鼠于造模成功后72 h用水合氯醛麻醉后開胸經(jīng)左心室插管至主動脈，依次灌注生理鹽水100 mL，4 ℃ 4%多聚甲醛250mL，斷頭去腦，于4%多聚甲醛固定24 h，然后使用酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋。

用免疫組織化學染色法進行TNF-α蛋白、NF-κB蛋白表達陽性細胞測定。組織切片脫蠟、水化后用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗2～3次，每次5 min；3%過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)(80%甲醇)滴加在腫瘤組織芯片(tissue microarray，TMA)上，室溫靜置10 min；PBS洗2～3次，每次5 min；進行抗原熱修復后PBS洗2～3次，每次5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體；滴加TNF-α兔抗鼠多克隆抗體和NF-κB兔抗鼠多克隆抗體50 μL，室溫靜置1 h；4 ℃過夜后在37 ℃復溫45 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加Ⅱ抗40～50 μL，室溫靜置，或37 ℃1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

染色成功后每個標本取2張切片，在200倍光鏡下隨機觀察并取血腫周邊5個不重復視野，顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，分析陽性細胞積分光密度，取平均值，單位為積分光密度/每個200倍視野。

1.7血漿TNF-α表達水平測定

各組隨機取6只大鼠在造模成功后72 h深度麻醉后打開胸腔，下腔靜脈取血2 mL，注入加有抗凝劑的試管中，4 ℃條件下3000 r/min，離心15 min后取上清液；用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ，ELISA)測定血漿中TNF-α的表達水平。

1.8統(tǒng)計學處理

2　結(jié)　果

2.1吡格列酮對大鼠腦出血后行為學評分的影響

6組行為學評分有顯著差異(F=12.767，P<0.001)；持續(xù)吡格列酮組行為學評分顯著高于術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組、模型組，顯著低于假手術(shù)和正常組(t=2.410、3.879、5.423、9.001、9.101，P=0.037、0.007、0.000、0.000、0.000)；術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組行為學評分顯著高于模型組，顯著低于假手術(shù)和正常組(t1=2.614、10.527、10.608，P1=0.026、0.000、0.000；t2=2.247、13.863、13.992,P2=0.049、0.000、0.000)，術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組行為學評分無明顯差異(t=0.613，P=0.554)；模型組行為學評分顯著低于假手術(shù)組和正常組(t=15.404、15.520，P均=0.000)(表1)。

表1　吡格列酮對大鼠腦出血后行為學評分的影響,分)

注：與持續(xù)吡格列酮組比較，*P<0.05；與術(shù)前吡格列酮組比較，△P<0.05；與術(shù)后吡格列酮組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2吡格列酮對大鼠腦出血后腦組織NF-κB和TNF-α蛋白表達水平的影響

6組TNF-α、NF-κB表達水平有顯著差異(F=11.24，8.91，P均=0.00)；持續(xù)吡格列酮組TNF-α表達水平顯著低于術(shù)前吡格列酮組、模型組，顯著高于假手術(shù)組、正常組(t=2.707、11.233、4.048、4.647，P=0.022、0.000、0.001、0.001)；持續(xù)吡格列酮組NF-κB表達水平顯著低于術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組、模型組，顯著高于假手術(shù)組、正常組(t=8.951、3.053、25.855、5.728、9.848，P=0.000、0.012、0.000、0.000、0.000)。術(shù)前吡格列酮組TNF-α、NF-κB表達水平顯著低于模型組，顯著高于術(shù)后吡格列酮組、假手術(shù)組、正常組(t1=2.424、4.702、5.910、5.689，P1=0.036、0.001、0.000、0.000；t2=7.259、6.778、11.530、13.627，P2=0.000、0.000、0.000、0.000)；術(shù)后吡格列酮組TNF-α、NF-κB表達水平顯著低于模型組，顯著高于假手術(shù)組、正常組(t1=12.650、7.844、6.976，P1均=0.000；t2=22.183、7.873、11.781，P2均=0.000)；模型組TNF-α、NF-κB表達水平顯著高于假手術(shù)組、正常組(t1=18.930，17.831，P1均=0.000；t2=22.723、26.489，P2均=0.000)。假手術(shù)組和正常組TNF-α無明顯差異(t=0.270，P=0.792)，但假手術(shù)組NF-κB蛋白表達水平顯著高于正常組(t=3.134，P=0.011)。(表2，圖1～2)。

表2　吡格列酮對大鼠腦出血后腦組織NF-κB、 TNF-α蛋白表達水平的影響,%)

注：與持續(xù)吡格列酮組比較，*P<0.05；與術(shù)前吡格列酮組比較，△P<0.05；與術(shù)后吡格列酮組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與假手術(shù)組比較，▽P<0.05

2.3吡格列酮對腦出血大鼠血漿中TNF-α表達水平的影響

6組大鼠血漿TNF-α表達水平有顯著差異[(0.702±0.013)vs(0.765±0.016)vs(0.787±0.011)vs(0.960±0.028)vs(0.656±0.004)vs(0.643±0.002)ng/dL](F=9.875，P<0.001)，其中模型組最高，而正常組最低。持續(xù)吡格列酮組TNF-α表達水平顯著低于術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組、模型組(t=7.486、12.226、20.471，P均=0.000)，與術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組TNF-α表達水平顯著高于模型組，顯著低于假手術(shù)組、正常組(t1=14.811、16.189、18.533，P1均=0.000；t2=14.086、27.415、31.545，P2均=0.000)，但術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組TNF-α表達水平無顯著差異(t=2.775，P=0.020)；假手術(shù)組TNF-α表達水平顯著高于正常組(t=7.120，P=0.000)。

圖1　大鼠腦出血后72h腦組織NF?κB免疫組化染色(×200倍)　箭頭所示棕色細胞為NF?κB陽性細胞；A為持續(xù)吡格列酮組，顯示NF?κB陽性細胞明顯少于B、C、D；B為術(shù)前吡格列酮組，陽性細胞少于D，但明顯多于其余圖；C為術(shù)后吡格列酮組；D為模型組；E為假手術(shù)組；F為正常組，NF?κB陽性細胞最少

圖2　大鼠腦出血后72h腦組織TNF?α免疫組化染色(×200倍)　A為持續(xù)吡格列酮組；B為術(shù)前吡格列酮組；C為術(shù)后吡格列酮組；D為模型組；E為假手術(shù)組；F為正常組

3　討　論

腦出血后炎癥反應(yīng)、自由基生成、脂質(zhì)過氧化等多種病理機制導致腦損傷區(qū)周圍甚至更廣泛的腦神經(jīng)元繼發(fā)性死亡是引起出血性腦損傷的的重要原因之一[1-2]。

PPARs涉及多種能量代謝及細胞活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)，其合成配體噻唑烷二酮類藥物吡格列酮除改善胰島素抵抗外，還具有一定抗炎、抗氧化作用[13-15]。國外研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激活劑可抑制單核細胞表達白介素-6(interleukin- 6，IL-6)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，并可抑制巨噬細胞表達一氧化氮合酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9, MMP-9)和A型清道夫受體，其機制也可能與拮抗NF-κB活性有關(guān)[16-17]。Li等[18]的研究顯示，在動脈粥樣硬化的小鼠模型中格列酮類藥物降低了主動脈根部TNF-α和明膠酶B的表達水平。同時張俊峰等[19]發(fā)現(xiàn)PPARγ激活劑可以顯著抑制人巨噬細胞源泡沫細胞IL-6、TNF-α的分泌，抑制MMP-9的分泌和活性，其機制可能與NF-κB通路有關(guān)。

NF-κB信號通路參與炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等重要的病理生理過程。已有研究證實腦出血早期即有NF-κB表達，參與腦出血周圍組織繼發(fā)性損傷及腦水腫形成[20]；劉兵榮等[21]也發(fā)現(xiàn)NF-κB與腦出血后腦水腫有關(guān)。目前研究認為NF-κB的激活可能是腦出血后神經(jīng)細胞凋亡的一個重要原因[22]。本研究發(fā)現(xiàn)胃灌注吡格列酮能降低NF-κB 的表達水平，且持續(xù)吡格列酮組NF-κB表達水平顯著低于術(shù)前吡格列酮組、術(shù)后吡格列酮組，術(shù)前吡格列酮組NF-κB表達水平顯著高于術(shù)后吡格列酮組(P<0.05)，可見持續(xù)給藥能夠增強NF-κB表達，減少對神經(jīng)細胞的損傷，抑制炎性因子釋放；但術(shù)前吡格列酮組NF-κB表達水平較高，可能與造模后腦出血大鼠炎性因子維持高水平，而造模后未用藥有關(guān)。

TNF-α是前炎性細胞因子，主要由激活的單核巨噬細胞產(chǎn)生，是腦出血后引起周圍腦組織水腫形成的重要因素之一[23]。TNF-α可直接作用于血管內(nèi)皮細胞，引起腦組織多核白細胞聚集和激活，釋放炎性介質(zhì)，誘導粘附因子、白介素等合成和釋放，進一步加重腦損傷[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激活劑吡格列酮可有效降低大鼠腦出血72 h血漿和腦組織中TNF-α表達水平，從而減輕全身及腦組織中的炎癥反應(yīng)，并促進了大鼠神經(jīng)功能的恢復。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者腦組織內(nèi)TNF-α處于高表達水平，直接參與到腦出血損傷中。本研究持續(xù)吡格列酮組血漿和腦組織TNF-α表達水平均最低，其中術(shù)前吡格列酮組TNF-α表達水平顯著高于術(shù)后吡格列酮組，但2組血漿TNF-α表達水平無明顯差異，故本研究推測吡格列酮能夠下降TNF-α的釋放能力，負性調(diào)節(jié)腦組織中的TNF-α表達水平，但造模后腦組織和血清中TNF-α表達水平均明顯上升，僅術(shù)前給藥可能無法達到預期的治療效果。

綜上所述，吡格列酮作為PPARγ激活劑，能降低NF-κB 的表達水平，并抑制TNF-α的表達，促進了大鼠神經(jīng)功能的恢復，發(fā)揮腦出血后的腦保護作用。但本研究僅就PPARγ激活劑吡格列酮對于大鼠炎癥相關(guān)因子NF-κB、TNF-α表達水平的影響進行了探討，相關(guān)通路及機制尚需要進一步研究。

[1]Xi GH,Keep RF,Hoff JT.Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage[J].The Lancet Neurology,2006,5(1):53-63.

[2]Aronowski J,Zhao X.Molecular pathophysiology of cerebral hemorrhage: secondary brain injury[J].Stroke,2011,42(6):1781-1786.

[3]韓寧,吳丹紅,黃菲菲,等.吡格列酮對大鼠腦出血后腦組織細胞凋亡及自由基水平的影響[J].中國臨床神經(jīng)科學,2012,20(4):391-396.

[4]Luo Y,Yin W,Signore AP,et al.Neuroprotection against focal ischemic brain injury by the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist rosiglitazone[J].J Neurochem,2006,97(2):435-448.

[5]Park SW,Yi JH,Miranpuri G,et al.Thiazolidinedione class of peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists prevents neuronal damage, motor dysfunction, myelin loss, neuropathic pain, and inflammation after spinal cord injury in adult rats[J].J Pharmacol Exp Ther,2007,320(3):1002-1012.

[6]楊璐,宋美情,張秋玲,等.吡格列酮、二甲雙胍對2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血清視黃醇結(jié)合蛋白4、脂聯(lián)素水平的影響比較[J].中國醫(yī)學科學院學報,2014,36(3):309-312.

[7]Deinsberger W,Vogel J,Kuschinsky W,et al.Experimental intracerebral hemorrhage: description of a double injection model in rats[J].Neurol Res,1996,18(5):475-477.

[8]周中和,曲方,何祥,等.一種改良大鼠自體血腦出血模型:二次注血/退針法[J].中國臨床神經(jīng)科學,2004,12(4):406-408.

[9]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[10] Ohlsson AL,Johansson BB.Environment influences functional outcome of cerebral infarction in rats[J].Stroke,1995,26(4):644-649.

[11] Garcia JH,Wagner S,Liu KF,et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation[J].Stroke,1995,26(4):627-634; discussion 635.

[12] Shih AY,Li P,Murphy TH.A small-molecule-inducible Nrf2-mediated antioxidant response provides effective prophylaxis against cerebral ischemia in vivo[J].J Neurosci,2005,25(44):10321-10335.

[13] Park S,Yi J,Miranpuri G,et al.Thiazolidinedione class of peroxisome proliferator-activated receptorgamma agonists prevents neuronal damage,motor dysfunction,myelin loss,neuropathic pain and inflammation after spinal cord injury in adult rats[J].J Pharm Exp Therap,2007,320(3):1002-1012.

[14] Mctigue DM,Tripathi R,Wei P,et al.The PPAR gamma agonist Pioglitazone improves anatomical and locomotor recovery after rodent spinal cord injury[J].Exp Neurol,2007,205(2):396-406.

[15] De Ryck M,Van Reempts J,Borgers M,et al.Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats[J].Stroke,1989,20(10):1383-1390.

[16] Ricote M,Li AC,Willson TM,et al.The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation[J].Nature,1998,391(6662):79-82.

[17] Jiang C,Ting AT,Seed B.PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines[J].Nature,1998,391(6662):82-86.

[18] Li AC,Brown KK,Silvestre MJ,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands inhibit development of atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice[J].J Clin Invest,2000,106(4):523-531.

[19] 申琳,王浩,葉平.吡格列酮對大鼠缺血/再灌注心肌過氧化物酶體增殖物受體γ輔激活因子lα表達的影響[J].南方醫(yī)科大學學報,2014,6(2):197-200.

[20] Aronowski J,Hall CE.New horizons for primary intracerebral hemorrhage treatment: experience from preclinical studies[J].Neurol Res,2005,27(3):268-279.

[21] 李鴻娟,張東輝,劉海津.吡格列酮聯(lián)合二甲雙胍對2型糖尿病患者胰島素抵抗及脂肪細胞因子水平的影響[J].中國老年學雜志,2014,15(9):2416-2417, 2418.

[22] 吳丹,滕偉禹.大鼠實驗性腦出血后腦組織TLR2,NF-B/p65及caspase-3表達變化的研究[J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2010,27(6):484-488.

[23] 王立娜,鄭麗娜.蘆珊珊等.吡格列酮對多囊卵巢綜合征患者血清CRP,IL-6,TNF-α水平的影響[J].山東醫(yī)藥,2015,28(38):58-59.

[24] Bhatia M,Moochhala S.Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndmme[J].Pathol,2004,202(2):145-156.