干細(xì)胞向耳蝸毛細(xì)胞分化的研究概況

李迪 吳欣陽 吳革平

[摘要] 內(nèi)耳毛細(xì)胞作為感知和平衡聲音的主要換能器，它的形成受損或缺失都會導(dǎo)致不同程度的聽力障礙。在哺乳動物中，內(nèi)耳毛細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞，因此毛細(xì)胞的損傷或缺失是不可再生的，造成的聽力障礙也是永久性的。目前，很多研究者希望通過體外培養(yǎng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞或者毛細(xì)胞樣細(xì)胞（HCLs）的方式來治療因毛細(xì)胞缺失引起的聽力障礙。雖然干細(xì)胞是有前途的細(xì)胞治療的來源，但目前很少研究能使干細(xì)胞誘導(dǎo)成有效的毛細(xì)胞；并且即使能誘導(dǎo)成毛細(xì)胞，但是成功移植并使其在正確的位置發(fā)揮正常的生理學(xué)功能也是目前面臨的一項巨大挑戰(zhàn)。在該綜述中，總結(jié)干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化的研究現(xiàn)狀。

[關(guān)鍵詞] 感音神經(jīng)性耳聾；內(nèi)耳干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；毛細(xì)胞

[中圖分類號] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）01（b）-0196-03

[Abstract] The inner hair cells， as a major transducer of perceiving and balancing voices， its defect or loss can lead to different degrees of dysaudia. In the mammals， the inner hair cell is a kind of terminal differentiation cell， therefore， the injury or loss of hair cells is non-renewable， and the dysaudia is permanent. Currently， many researchers hope to treat the dysaudia caused by the loss of hair cells by in vitro culture of stem cells. Even though the stem cells are the origin of promising cells， there are few studies that can make the stem cells become the effective hair cells， even if it can be induced into the hair cells， the successful transplantation and making them give play to the normal physiology function in an accurate site is a great challenge， and we summarize the research status of cell differentiation from stem cells to cochlea hair cells in this paper.

[Key words] Sensorineural deafness； Inner ear stem cells； Embryonic stem cell； Hair cells

感音神經(jīng)性耳聾是聽力障礙疾病的統(tǒng)稱，主要由于先天或后天性的內(nèi)耳、聽覺神經(jīng)及聽覺中樞病變，使傳入內(nèi)耳的聲波不能被接收所引起的一種聽力障礙。人類耳蝸包含內(nèi)外兩種毛細(xì)胞， 外毛細(xì)胞對聲信號起到協(xié)調(diào)作用，內(nèi)毛細(xì)胞把外界傳入內(nèi)耳的聲信號轉(zhuǎn)換成電信號，聽覺神經(jīng)元把接收到的電信號進(jìn)一步傳入聽覺通道，進(jìn)而傳入聽覺中樞[1]。人類的內(nèi)耳毛細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞，因此毛細(xì)胞的損傷或缺失是不可再生的，造成的聽力障礙也是永久性的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的內(nèi)耳毛細(xì)胞（HC）或與其下游的蝸神經(jīng)元的損傷或丟失是導(dǎo)致聽力障礙的主要原因。

雖然目前臨床對于感音神經(jīng)性耳聾的治療途徑眾多，主要有助聽器、振動聲橋、人工耳蝸植入等。但這些方法都有各自的局限性，不能從根本上解決耳聾問題。為了重塑聽覺功能，研究者們把研究目標(biāo)指向了生物治療——體外再生毛細(xì)胞。干細(xì)胞是具有自我更新和多種分化潛能的一種多功能細(xì)胞，因此研究者們希望通過體外培養(yǎng)干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞或內(nèi)耳祖細(xì)胞，然后把內(nèi)耳毛細(xì)胞重新植入耳聾患者耳蝸內(nèi)并發(fā)揮典型的內(nèi)耳毛細(xì)胞的生理學(xué)功能，從而達(dá)到治療感音神經(jīng)性耳聾目的[3]。

1 胚胎干細(xì)胞向毛細(xì)胞的分化

胚胎干細(xì)胞（ESC）是一種具有多種分化潛能的細(xì)胞，在適宜的條件下可以分化為幾乎所有的細(xì)胞類型。因此，干細(xì)胞治療成為目前研究的熱點。在早期研究中，ESC是被接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）形成的滋養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)的，MEF滋養(yǎng)層可以供給ESC生長所需的營養(yǎng)，并使ESC細(xì)胞處于未分化狀態(tài)[4]。但是這種培養(yǎng)方式過程復(fù)雜、培養(yǎng)難度系數(shù)較大。此外在2D培養(yǎng)環(huán)境中，ESC細(xì)胞會直接粘附在培養(yǎng)板上；因此，它們的生長方式被限制為以平坦形狀生長，不利于模擬體內(nèi)組織器官的生長發(fā)育所需要的微環(huán)境。

近年來，根據(jù)臨床實際應(yīng)用的需要Koehler KR等利用一種新的培養(yǎng)技術(shù)：3D懸浮培養(yǎng)方式，不需要MEF的一類培養(yǎng)基即MEF-free培養(yǎng)基，以Matrigel作為底物，利用一種磁性微球載體和磁懸浮技術(shù)使貼有細(xì)胞的磁性微球載體懸浮在培養(yǎng)液中，加入多種細(xì)胞因子來維持ESC的自我更新，使ESC呈三維立體形態(tài)生長[5]。這種培養(yǎng)方式突破了傳統(tǒng)的利用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或微孔板等2D細(xì)胞培養(yǎng)方式中的繁瑣、耗時、細(xì)胞產(chǎn)量小等局限性。這種培養(yǎng)方式就像ESC細(xì)處在胚胎中一樣，可以更好的模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育的微環(huán)境。但是MEF-free這種培養(yǎng)方式因為成本比較高而限制了其使用率。所以，現(xiàn)在培養(yǎng)ESC使用比較多的還是基于MEF的培養(yǎng)方式。

在ESC向毛細(xì)胞分化的過程中會經(jīng)歷幾個比較典型的階段。例如，在Koehler KR的3D培養(yǎng)方式中，取E3.5的胚泡期胚胎，培養(yǎng)在LIF-2i培養(yǎng)基中，Matrigel作為底物，在E6.5的時候形成明確的外胚層；此時加入骨形態(tài)生成蛋白4（BMP4）和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）的抑制劑SB-431542的條件下，開始沿著非神經(jīng)外胚層方向分化，在E7.5的時候形成NNE；接下來加入BMP4的抑制劑LDN-193189抑制BMP4的活性，并在生長因子FGF的作用下形成前基板外胚層，PPE隨后形成otic-epibranchialplacode domain（OEPD），OEPD在Wnt的參與調(diào)控下發(fā)育成具有含有內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的假復(fù)層上皮的耳囊泡，并產(chǎn)生具有毛細(xì)胞靜纖毛束和毛囊的毛細(xì)胞[5]。并有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Emx2參與調(diào)控毛細(xì)胞的立體纖毛束取向[6]。經(jīng)過電生理檢測顯示，這些由干細(xì)胞衍生來的毛細(xì)胞具有典型內(nèi)耳毛細(xì)胞的生理學(xué)功能，并且與分化而來的感覺神經(jīng)元形成專門的突觸聯(lián)系，為內(nèi)耳器官的體外發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

2 內(nèi)耳干細(xì)胞向毛細(xì)胞的分化

2003年，Li等從成年小鼠橢圓囊感覺上皮中分離出了一類可以在體外自我更新并分化為毛細(xì)胞的細(xì)胞。他們將這類細(xì)胞命名為內(nèi)耳干細(xì)胞。后來，研究人員也逐漸從耳蝸器大上皮脊小上皮脊前庭球囊和橢圓囊感覺上皮等不同組織中分離得到了內(nèi)耳干細(xì)胞。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳干細(xì)胞在體外可以分化為多種類型的細(xì)胞。Li等將分離的內(nèi)耳干細(xì)胞接種在多聚賴氨酸預(yù)處理過的培養(yǎng)皿中，在無血清的條件下貼壁培養(yǎng)，14 d之后檢測細(xì)胞組分，發(fā)現(xiàn)有毛細(xì)胞標(biāo)志性分子Myosin VIIA和Brn3c的表達(dá)，表明至少部分細(xì)胞已經(jīng)成功分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞。隨后，Li等利用Myosin VIIA，Brn3c和Espin等毛細(xì)胞的特異性標(biāo)記物通過免疫熒光的方法進(jìn)一步證明了分化的細(xì)胞中確實有毛細(xì)胞的存在。另外，Oshiima將內(nèi)耳干細(xì)胞接種在聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12培養(yǎng)基（含B27和N2）在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化兩周。之后也成功檢測毛細(xì)胞的存在。還有研究證實，內(nèi)耳干細(xì)胞所處的微環(huán)境以及與相鄰細(xì)胞之間物質(zhì)交換、信號傳遞等對于內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的內(nèi)耳毛細(xì)胞是至關(guān)重要的。

雖然體外已經(jīng)成功的實現(xiàn)由內(nèi)耳干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化，但不可忽略的是在其分化的相關(guān)過程中仍然具有很多局限性。例如內(nèi)耳毛干細(xì)胞的數(shù)目是非常有限的；并且體外培養(yǎng)過程比較復(fù)雜、培養(yǎng)難度系數(shù)大；再者其向毛細(xì)胞誘導(dǎo)的效率非常低，即使有部分內(nèi)耳干細(xì)胞分化產(chǎn)生毛細(xì)胞，但這些毛細(xì)胞是否具有典型毛細(xì)胞的特性和生理學(xué)功能還需要進(jìn)一步的論證。

3 其他干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化

有研究結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可以有效的分化為耳蝸毛細(xì)胞。Atoh1在間充質(zhì)干細(xì)胞向毛細(xì)胞的分化中起著重要的調(diào)控作用。當(dāng)過表達(dá)Atoh1，并與螺旋神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，體外間充質(zhì)干細(xì)胞成功分化為毛細(xì)胞[7]。另外，還有研究證明誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞在合適的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件下也可以完成向內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化。說明在體外內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的探索中，可供選擇的干細(xì)胞種類還是比較多的。

4 誘導(dǎo)過程中毛細(xì)胞的檢測

耳蝸發(fā)育最重要的一步是將感覺前體細(xì)胞分化為毛細(xì)胞。這一過程受到一系列的轉(zhuǎn)錄因子以及信號通路的調(diào)控，如陽性調(diào)節(jié)因子Atoh1[7]，負(fù)調(diào)控因子Hes1和Hes5[8]，細(xì)胞周期蛋白，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK）抑制劑（CKI）等。細(xì)胞分化和退出細(xì)胞周期是發(fā)育過程中兩個緊密協(xié)調(diào)的過程。研究表明，抑制細(xì)胞周期抑制劑CKIs活性可以有助于毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的產(chǎn)生[9]；RRD251可以破壞細(xì)胞周期調(diào)控因子Rb和Raf-1之間的物理相互作用，阻斷Rb磷酸化，使毛細(xì)胞不能正常跳出細(xì)胞周期，從而抑制內(nèi)耳毛細(xì)胞再生[10]。因此，準(zhǔn)確鑒定和調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子有助于更準(zhǔn)確掌握毛細(xì)胞的分化情況。Atoh1是毛細(xì)胞形成過程中不可缺少的一個“螺旋-環(huán)-螺旋”結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子[7]。在哺乳動物中Atoh1的表達(dá)成為檢測干細(xì)胞向毛細(xì)胞分化過程中的一個重要標(biāo)志[7]。沒有表達(dá)Atoh1的前體細(xì)胞，后期不能誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞和支持細(xì)胞。在出生后早起，雖然Atoh1只在短暫的時期內(nèi)表達(dá)，但是研究結(jié)果顯示在耳蝸發(fā)育中Atoh1這種瞬時性的表達(dá)對耳蝸毛細(xì)胞的正常發(fā)育所必要的。研究顯示，Atoh1在E15.5至E17.5的表達(dá)是新生成的毛細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素。隨后，毛細(xì)胞的成熟以及立體纖毛束的生成都離不開Atoh1的表達(dá)。以上研究表明在耳蝸發(fā)育中Atoh1是毛細(xì)胞正常分化、存活和成熟的必要條件。

在目前體外培養(yǎng)毛細(xì)胞的方法中，最終分化而來的細(xì)胞是否為毛細(xì)胞，是否具有典型毛細(xì)胞的生理活性，還需要進(jìn)一步的檢測，目前主要的檢測方法有以下幾種。

①基因檢測。在體外干細(xì)胞向毛細(xì)胞的誘導(dǎo)中，誘導(dǎo)成功的毛細(xì)胞通常會檢測到Myosin VIIA，Brn3c和Espin這些蛋白的表達(dá)。因此，可以通過提取mRNA方式，檢測分子Myosin VIIA，Brn3c和Espin的mRNA表達(dá)水平，來作為一個判定是否為毛細(xì)胞的條件[11]。

②免疫熒光染色標(biāo)記檢測。在內(nèi)耳干細(xì)胞向毛細(xì)胞的分化過程中，內(nèi)耳干細(xì)胞一般經(jīng)過7 d分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞，經(jīng)過14 d形成毛細(xì)胞。這3個典型的發(fā)育階段可以通過FM1-43特異性標(biāo)記后經(jīng)流式分選得到，提取這3個階段細(xì)胞的RNA做基因表達(dá)譜檢測之后，確定了這3個階段的特異性marker：內(nèi)耳毛干細(xì)胞marker（Gdf10+Ccdc121），內(nèi)耳祖細(xì)胞marker（Tmprss9+Orm1），毛細(xì)胞marker（Chrna9+Espnl[12]。因此可以免疫熒光染色的檢測可作為判定毛細(xì)胞的一個重要依據(jù)。

③膜片鉗電生理功能檢測。通過檢測分化而來的毛細(xì)胞的全細(xì)胞膜電流，K離子電流等分析此毛細(xì)胞是否具有電生理功能。

④電子掃描顯微鏡形態(tài)檢測。內(nèi)耳干細(xì)胞表面沒有靜纖維束，未成熟的毛細(xì)胞表面沒有靜纖維束或有較短的排列不規(guī)整的靜纖維束，而分化成熟的毛細(xì)胞表面有規(guī)則排列的靜纖毛束。

5 挑戰(zhàn)與展望

近年來，毛細(xì)胞的相關(guān)研究取得了巨大的突破。從細(xì)胞系的建立，到一套成熟的培養(yǎng)方式的建立，再到后來的毛細(xì)胞以及類毛細(xì)胞樣細(xì)胞的成功誘導(dǎo)以及分化各階段的檢測手段的建立等，都是研究者們不斷探索的成功。但是目前仍有許多挑戰(zhàn)：①毛細(xì)胞誘導(dǎo)率問題。毛細(xì)胞誘導(dǎo)率還很低。②毛細(xì)胞生理功能問題。雖然已有多種體外毛細(xì)胞檢測判定方式，但都比較片面，目前未公認(rèn)的權(quán)威的判定方式來。③植入問題。即使現(xiàn)在有多種植入方式，如從圓窗、蝸軸、半規(guī)管、鼓階等，但哪種植入方式是比較有效的還有待考究。④植入后存活率以及發(fā)揮生理功能等問題都是目前面臨的困難與挑戰(zhàn)。

基于現(xiàn)有的感音神經(jīng)性耳聾的治療研究，我們推測感音神經(jīng)性耳聾的治療需要基因治療與藥物治療、基因修飾、干細(xì)胞治療甚至是與電子耳蝸植入相結(jié)合才使得臨床治療感音神經(jīng)性聾真正成為可能。

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（收稿日期：2017-10-11）