實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前庭感覺(jué)毛細(xì)胞的定量觀察

丁大連，李鵬，亓衛(wèi)東，張建輝

(1.紐約州立大學(xué)布法羅大學(xué)，紐約 布法羅 14214； 2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510230； 3.成都市第三人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，四川 成都 610014； 4.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200040)

內(nèi)耳功能主要分為聽(tīng)覺(jué)功能和平衡功能，其中耳蝸是內(nèi)耳的聽(tīng)覺(jué)器官，而前庭則是內(nèi)耳的平衡器官。在每個(gè)內(nèi)耳中的前庭感覺(jué)區(qū)包含2個(gè)感知線性加速度改變的耳石器(球囊斑和橢圓囊斑)和3個(gè)感知角加速度改變的壺腹嵴[1-3]。位于這些前庭感覺(jué)區(qū)的毛細(xì)胞是前庭系統(tǒng)中感受自身運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頭位空間位置的平衡感受器，前庭毛細(xì)胞因運(yùn)動(dòng)或體位改變釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)通過(guò)毛細(xì)胞底部的傳入神經(jīng)末梢經(jīng)前庭神經(jīng)節(jié)傳送到腦干中的前庭核，然后再與其他參與平衡感知和調(diào)控的中樞神經(jīng)核團(tuán)建立間接的神經(jīng)聯(lián)系[4-5]。由此可見(jiàn)，前庭毛細(xì)胞是內(nèi)耳中接受平衡感覺(jué)刺激的唯一感受器，前庭毛細(xì)胞的破壞將直接造成內(nèi)耳的平衡功能障礙甚至導(dǎo)致內(nèi)耳的平衡功能喪失，這意味著前庭毛細(xì)胞的定量病理學(xué)評(píng)估對(duì)研究前庭性平衡障礙至關(guān)重要。

在內(nèi)耳前庭感覺(jué)毛細(xì)胞的定量組織病理學(xué)研究中，對(duì)前庭感覺(jué)區(qū)連續(xù)切片進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法因工作量過(guò)大和準(zhǔn)確性欠佳而早已不再被采用[6]。自前庭膜迷路鋪片技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，由于該技術(shù)為實(shí)現(xiàn)各個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)的毛細(xì)胞定量分析提供了非常理想的觀察角度而日益得到更多的應(yīng)用[7-16]。

了解受試動(dòng)物前庭感覺(jué)區(qū)的測(cè)量參數(shù)和確定各個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)的前庭毛細(xì)胞數(shù)量或毛細(xì)胞密度，是定量觀察前庭毛細(xì)胞病理學(xué)改變的基本要素。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)測(cè)量多種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)及其毛細(xì)胞數(shù)量的重要數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開展前庭組織病理學(xué)的定量觀察和分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試動(dòng)物種類

本實(shí)驗(yàn)測(cè)量了正常CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長(zhǎng)尾猴等七種常用的成年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(每種動(dòng)物6只)的前庭感覺(jué)區(qū)的面積和毛細(xì)胞的數(shù)據(jù)。受試動(dòng)物的一側(cè)耳被用于本實(shí)驗(yàn)的球囊斑和橢圓囊斑面積測(cè)量及前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)毛細(xì)胞的定量觀察，另一側(cè)耳被用于其他實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除南美栗鼠和新西蘭白兔的實(shí)驗(yàn)程序得到復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)之外，其余所有動(dòng)物的樣本制備程序均根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院發(fā)布指南并得到布法羅大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 各個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)的取材鋪片技術(shù)

將取出的受試動(dòng)物的顳骨浸入到10%福爾馬林固定液浸泡數(shù)小時(shí)，然后在解剖顯微鏡下摘除鐙骨并打開前庭池外側(cè)骨壁，充分暴露位于前庭池內(nèi)的每一個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)(圖1)。用分離針緊貼前庭池內(nèi)側(cè)骨壁截?cái)嗲蚰野弑硞?cè)穿入到中篩斑的神經(jīng)纖維和血管，分離取下球囊斑，然后摘除覆蓋在球囊斑表面的耳石膜。用分離針在上篩斑緊貼骨壁截?cái)鄼E圓囊斑背側(cè)的神經(jīng)纖維和血管，分離取下橢圓囊斑，然后摘除覆蓋在橢圓囊斑表面的耳石膜。用分離針?lè)謩e在上篩斑和下篩斑處的前庭池骨壁截?cái)嗤獍胍?guī)管壺腹嵴和上半規(guī)管壺腹嵴及后半規(guī)管壺腹嵴的神經(jīng)纖維和血管，再分別截?cái)?個(gè)膜半規(guī)管取下3個(gè)膜壺腹，最后打開膜壺腹暴露壺腹腔內(nèi)的壺腹嵴。將取下并完成暴露的各個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)常規(guī)染色后鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片[7,9,17-19]。

1.3 球囊斑和橢圓囊斑的面積測(cè)量

首先對(duì)每種受試動(dòng)物的球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片在放大100倍的光學(xué)顯微鏡下拍攝兩個(gè)囊斑鋪片的整體照片，應(yīng)用Image J軟件的圖像測(cè)量程序，分別測(cè)量CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長(zhǎng)尾猴的球囊斑和橢圓囊斑的實(shí)際面積。見(jiàn)圖2。

1.4 球囊斑和橢圓囊斑毛細(xì)胞總數(shù)的計(jì)數(shù)方法

在光學(xué)顯微鏡下，將平整鋪片的球囊斑和橢圓囊斑照片上的囊斑區(qū)域劃分為面積相同的若干網(wǎng)格區(qū)域(圖3)。 在放大圖像下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)每個(gè)方格中的毛細(xì)胞數(shù)量，然后將每個(gè)方格的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相加，從而獲得每種受試動(dòng)物的球囊斑和橢圓囊斑上的毛細(xì)胞總數(shù)。

1.5 前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)局部毛細(xì)胞密度的測(cè)量

由于球囊斑和橢圓囊斑比較平整，因而容易制作成球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片。從球囊斑和橢圓囊斑鋪片進(jìn)行毛細(xì)胞全計(jì)數(shù)的方法雖然可行，但是耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)而且需要確保制作出完整無(wú)損的整個(gè)囊斑鋪片，加上文獻(xiàn)中報(bào)道的有關(guān)前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)毛細(xì)胞總數(shù)的參考數(shù)據(jù)由于各自存在的技術(shù)原因而具有相當(dāng)大的差異，這些都給定量評(píng)估前庭兩個(gè)囊斑上的毛細(xì)胞總數(shù)帶來(lái)一定的困難。在光學(xué)顯微鏡高倍鏡的放大條件下，對(duì)前庭感覺(jué)區(qū)鋪片上的小視野范圍內(nèi)進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而獲取局部的毛細(xì)胞密度，不失為一種簡(jiǎn)便有效的前庭毛細(xì)胞定量觀察方法(圖4)。壺腹嵴具有一個(gè)立體的隆起的外形，在制作鋪片時(shí)很難鋪放平整而難免總有被遮擋的部位使之難以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)壺腹嵴上所有毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。但是，應(yīng)用前庭小視野定量觀察技術(shù)計(jì)算出前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)小視野范圍內(nèi)毛細(xì)胞密度的方法卻既簡(jiǎn)單又可靠，還可以在同一個(gè)樣品上對(duì)幾個(gè)不同的區(qū)域進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，再以平均值來(lái)代表該前庭感覺(jué)區(qū)的毛細(xì)胞密度[8,20-21]。我們?cè)陬A(yù)先設(shè)定的放大倍數(shù)下，首先拍攝取景框視野內(nèi)顯微測(cè)微尺的照片，從而計(jì)算出該放大倍數(shù)下攝影取景框的實(shí)際面積，然后對(duì)該放大倍數(shù)下攝影取景框內(nèi)的毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，這樣就可獲得該受試動(dòng)物前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)的毛細(xì)胞密度(圖4)。

1.6 前庭感覺(jué)區(qū)毛細(xì)胞損害模型的定量觀察

為了驗(yàn)證上述前庭感覺(jué)區(qū)毛細(xì)胞定量觀察技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，我們將測(cè)量前庭毛細(xì)胞密度的定量觀察方法應(yīng)用于以下幾種前庭毛細(xì)胞損害的不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。①?gòu)膶?duì)準(zhǔn)大鼠外耳道口的沖擊波發(fā)生器釋放出的加壓空氣沖擊波的峰值壓力達(dá)到20帕斯卡(Pascals)，爆震聲強(qiáng)達(dá)到196.8 dB SPL。受試大鼠在爆震暴露2周后終止實(shí)驗(yàn)，常規(guī)制備前庭感覺(jué)區(qū)鋪片后用蘇木素染色并在光學(xué)顯微鏡下對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)觀察；②將裝載進(jìn)微滲透泵(Osmotic pump)的每mL Hank’s溶液含有400 μL慶大霉素的溶液通過(guò)插入到南美栗鼠上半規(guī)管開出的小孔以每小時(shí)0.5 μL的速率向前庭池內(nèi)持續(xù)緩慢灌注7 d。在停止灌流后的第14天終止實(shí)驗(yàn)，常規(guī)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)琥珀酸脫氫酶染色后制備的前庭感覺(jué)區(qū)鋪片進(jìn)行毛細(xì)胞的定量觀察;③按照每公斤體重100毫克的劑量向南美栗鼠腹腔內(nèi)一次性注射卡鉑，在注射卡鉑30 d后終止實(shí)驗(yàn)，常規(guī)制備前庭感覺(jué)區(qū)鋪片后用蘇木素染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行定量觀察。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物球囊斑和橢圓囊斑的實(shí)際面積和毛細(xì)胞總數(shù)

按照材料與方法中對(duì)“球囊斑和橢圓囊斑的面積測(cè)量”方法的描述和“球囊斑和橢圓囊斑毛細(xì)胞總數(shù)的計(jì)數(shù)方法”，我們對(duì)CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長(zhǎng)尾猴的球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片實(shí)施了面積測(cè)量。并獲得了每種受試動(dòng)物球囊斑毛細(xì)胞的總數(shù)和橢圓囊斑毛細(xì)胞的總數(shù)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、圖5。

表1 7種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物球囊斑和橢圓囊斑的實(shí)際面積與球囊斑和橢圓囊斑上的毛細(xì)胞總數(shù)

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)局部的毛細(xì)胞密度

每個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)上不同部位的毛細(xì)胞密度見(jiàn)表2。每個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)的毛細(xì)胞都包含著兩種類型的毛細(xì)胞，它們分別是Ⅰ型毛細(xì)胞和Ⅱ型毛細(xì)胞。外形呈燒瓶狀的Ⅰ型毛細(xì)胞體型較胖，主要集中在球囊斑和橢圓囊斑的微紋區(qū)以及壺腹嵴的頂部；而外形呈柱狀的Ⅱ型毛細(xì)胞體型較瘦，主要分布在球囊斑和橢圓囊斑的周邊區(qū)和壺腹嵴的兩側(cè)。由于Ⅰ型毛細(xì)胞比Ⅱ毛細(xì)胞占據(jù)著更大的空間，因此，Ⅰ型毛細(xì)胞聚集的球囊斑微紋區(qū)和橢圓囊斑微紋區(qū)的毛細(xì)胞密度要顯著低于這兩個(gè)囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度。人們?cè)缇桶l(fā)現(xiàn)松鼠猴囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度平均要比微紋區(qū)的毛細(xì)胞密度高 1.62 倍[22]。有鑒于此，球囊斑微紋區(qū)和橢圓囊斑微紋區(qū)的毛細(xì)胞密度應(yīng)該與這兩個(gè)囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度區(qū)分開來(lái)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(圖4、6)[12,21,23]。

圖6 毛細(xì)胞觀察 6A：大鼠橢圓囊斑微紋區(qū)的正常毛細(xì)胞密度； 6B：沖擊波暴露造成了橢圓囊斑微紋區(qū)毛細(xì)胞的嚴(yán)重破壞，但并未破壞橢圓囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞； 6C：南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)和周邊區(qū)的正常毛細(xì)胞密度。紅色方框顯示球囊斑微紋區(qū)內(nèi)的小視野，黃色方框顯示球囊斑周邊區(qū)的小視野； 6D：慶大霉素造成南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)毛細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害； 6E：毛細(xì)胞密度直方圖顯示慶大霉素造成的南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)毛細(xì)胞的損壞程度顯著高于周邊區(qū) (6A、B：蘇木素 ×400； 6C、D：琥珀酸脫氫酶 ×200) 圖7 南美栗鼠橢圓囊斑鋪片對(duì)毛細(xì)胞定量觀察 7A：正常對(duì)照南美栗鼠的Ⅰ型毛細(xì)胞在細(xì)胞核平面的周圍就有一個(gè)圓環(huán)樣的Ⅰ型傳入神經(jīng)末梢，Ⅱ型毛細(xì)胞細(xì)胞核平面的周圍則不具備圓環(huán)狀的神經(jīng)末梢結(jié)構(gòu)； 7B：一次性注射卡鉑(100 mg/kg體重)后30 d，橢圓囊斑鋪片上殘存的毛細(xì)胞只剩下不具備圓環(huán)狀神經(jīng)末梢的Ⅱ型毛細(xì)胞，說(shuō)明卡鉑選擇性破壞南美栗鼠的Ⅰ型毛細(xì)胞，但是并不損害南美栗鼠的Ⅱ型毛細(xì)胞； 7C：毛細(xì)胞密度直方圖中的星號(hào)顯示南美栗鼠的前庭Ⅰ型毛細(xì)胞確可被卡鉑選擇性破壞 (7A、B：蘇木素 ×1 000) 圖8 大鼠橢圓囊斑鋪片相同視野下的毛細(xì)胞細(xì)胞核平面和支持細(xì)胞細(xì)胞核平面的照片 (ToPro-3 ×630) 8A:當(dāng)顯微鏡的焦距對(duì)準(zhǔn)在毛細(xì)胞的細(xì)胞核平面時(shí)，可見(jiàn)毛細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞之間的間隙都比較大; 8B:當(dāng)顯微鏡的焦距對(duì)準(zhǔn)在毛細(xì)胞下方支持細(xì)胞的細(xì)胞核平面時(shí)，可見(jiàn)支持細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞之間的間隙都很小。說(shuō)明毛細(xì)胞的細(xì)胞密度顯著低于支持細(xì)胞的細(xì)胞密度 圖9 6種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的壺腹嵴鋪片 (蘇木素 ×100) 9A：小鼠；9B：大鼠；9C：豚鼠；9D：南美栗鼠；9E：羊；9F：猴

測(cè)量球囊斑和橢圓囊斑局部小視野中的毛細(xì)胞密度，除了應(yīng)該對(duì)微紋區(qū)和周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度區(qū)分計(jì)數(shù)之外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察的需要，有時(shí)還需要對(duì)Ⅰ型毛細(xì)胞和Ⅱ型毛細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分計(jì)數(shù)。例如卡鉑選擇性破壞南美栗鼠的Ⅰ型毛細(xì)胞，我們通過(guò)對(duì)橢圓囊斑鋪片的小視野范圍內(nèi)的Ⅰ型毛細(xì)胞和Ⅱ型毛細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分計(jì)數(shù)，就可以從兩種毛細(xì)胞存活密度的改變來(lái)證明這個(gè)特殊現(xiàn)象。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2、圖7～9。

表2 6種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物球囊斑和橢圓囊斑及壺腹嵴在光學(xué)顯微鏡下前庭小視野毛細(xì)胞平均密度的參考數(shù)據(jù) (毛細(xì)胞/0.03 mm2，1 000倍，

3 討論

3.1 球囊斑和橢圓囊斑面積測(cè)量及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法的可靠性問(wèn)題

Crile于1940年提出了一個(gè)計(jì)算前庭感覺(jué)上皮面積和前庭感覺(jué)區(qū)毛細(xì)胞數(shù)量與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重之間的A=aBWb 的冪函數(shù)計(jì)算公式[24]，這個(gè)計(jì)算公式被沿用至今[25-26]。這個(gè)計(jì)算公式的意思是每個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)的表面積和毛細(xì)胞總數(shù)等于系數(shù)a乘以受試動(dòng)物的體重再乘以系數(shù)b。對(duì)于體重小于4 kg的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，計(jì)算球囊斑和橢圓囊斑的面積及毛細(xì)胞總數(shù)的系數(shù)a和系數(shù)b分別是0.045±0.01和0.45±0.03；計(jì)算壺腹嵴毛細(xì)胞的系數(shù)a和系數(shù)b則分別是0.025±0.013和0.44±0.07。對(duì)于體重大于4 kg的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重與球囊斑面積之間冪律關(guān)系的斜率為0.45，體重與橢圓囊斑面積之間冪律關(guān)系的斜率為 0.44。雖然這個(gè)計(jì)算公式看上去似乎可以通過(guò)簡(jiǎn)單測(cè)量動(dòng)物體重得知每個(gè)測(cè)試動(dòng)物各個(gè)前庭感覺(jué)區(qū)的表面積和毛細(xì)胞總數(shù)，但是，這種既不測(cè)量實(shí)際前庭感覺(jué)區(qū)面積也不對(duì)前庭毛細(xì)胞進(jìn)行實(shí)際計(jì)數(shù)的體重?fù)Q算法，其可靠性和合理性及實(shí)用性都值得被懷疑。試想一只豚鼠在出生后1個(gè)月的體重大約為100 g，到出生后12個(gè)月其體重可以增加到800 g左右。那么，在系數(shù)a和b不變但體重增加了8倍的情況下，難道這只豚鼠的前庭感覺(jué)區(qū)的表面積和毛細(xì)胞總數(shù)也會(huì)增加8倍嗎？這顯然是完全不可能的?？梢源_定的是，成年哺乳類動(dòng)物內(nèi)耳的感覺(jué)毛細(xì)胞不會(huì)再有增殖，因此，內(nèi)耳毛細(xì)胞的數(shù)量絕不可能隨著動(dòng)物體重的增加而變得更多。假設(shè)這個(gè)體重?fù)Q算公式真能換算出前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)的表面積和毛細(xì)胞的總數(shù)，那么如果毛細(xì)胞被耳毒性藥物永久破壞之后，難道體重也會(huì)發(fā)生改變嗎？我們認(rèn)為前庭毛細(xì)胞的數(shù)量和動(dòng)物體重之間沒(méi)有任何必然的聯(lián)系。僅憑稱量動(dòng)物體重來(lái)推算前庭各個(gè)感覺(jué)區(qū)表面積和毛細(xì)胞總數(shù)的算法，對(duì)前庭毛細(xì)胞的定量病理學(xué)評(píng)估毫無(wú)價(jià)值。

3.2 毛細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法的可靠性問(wèn)題

我們把從每個(gè)囊斑上記錄到的實(shí)際毛細(xì)胞總數(shù)與早先的論文報(bào)導(dǎo)做了相互比較，除了那些通過(guò)體重?fù)Q算得到的囊斑毛細(xì)胞總數(shù)結(jié)果不具備可比性之外，一些發(fā)表文章報(bào)道的毛細(xì)胞總數(shù)與我們的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果有一定的出入。例如，Lindeman在20世紀(jì)60年代應(yīng)用相差顯微鏡對(duì)戊二醛四氧化鋨雙重固定的豚鼠球囊斑和橢圓囊斑毛細(xì)胞的實(shí)際計(jì)數(shù)結(jié)果與我們所得結(jié)果就存在著顯著差異[27]。雖然四氧化鋨可以染色脂肪小滴和髓鞘，但是由于前庭毛細(xì)胞既不含有脂肪小滴也不含有髓鞘，因此，Lindeman實(shí)際上觀察的是未經(jīng)染色的前庭囊斑鋪片。我們的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的毛細(xì)胞總數(shù)分別為(4 882.2±208.7)個(gè)和(4 925.3±271.1)個(gè)，可是Lindeman記錄到的豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的毛細(xì)胞總數(shù)卻分別為7 500(6 018～7 983)個(gè)和9 000(7 118～10 760)個(gè)。 為什么同樣是在顯微鏡下對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行實(shí)際計(jì)數(shù)卻會(huì)出現(xiàn)如此大的總數(shù)差異？ 我們?cè)诠簿劢癸@微鏡下對(duì)同一區(qū)域的毛細(xì)胞層和支持細(xì)胞層中的細(xì)胞數(shù)量分別進(jìn)行了計(jì)數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)由于毛細(xì)胞細(xì)胞核的大小顯著大于支持細(xì)胞的細(xì)胞核，因而同一區(qū)域的毛細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于同一區(qū)域支持細(xì)胞的數(shù)量。我們?cè)谝粋€(gè)放大630倍的顯微鏡下的毛細(xì)胞細(xì)胞核的聚焦平面，在視野中可以識(shí)別約有130個(gè)毛細(xì)胞的細(xì)胞核，但是在這個(gè)相同視野毛細(xì)胞層下方的支持細(xì)胞的細(xì)胞核的聚焦平面，支持細(xì)胞的數(shù)量卻幾乎超過(guò)毛細(xì)胞一倍(圖8)。由此我們推測(cè)，Lindeman是否在對(duì)未經(jīng)染色的囊斑鋪片進(jìn)行觀察時(shí)，不得不通過(guò)辨別細(xì)胞間相互連接的折光明暗來(lái)勉強(qiáng)識(shí)別每一個(gè)細(xì)胞間的輪廓。在這種情況下，隨著顯微鏡焦距的上下移動(dòng)，支持細(xì)胞或許有可能與毛細(xì)胞相互混淆而都被當(dāng)作毛細(xì)胞被計(jì)數(shù)。我們得到的熒光染色的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果則完全是來(lái)自染色清晰的完整的囊斑鋪片樣品，所有的圖像資料都是在共聚焦顯微鏡區(qū)清晰區(qū)分出囊斑鋪片的毛細(xì)胞層面，因此我們不可能將支持細(xì)胞誤認(rèn)作是毛細(xì)胞。為了確保我們的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果不與支持細(xì)胞相混淆，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還專門用硝酸銀對(duì)豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的表面實(shí)施了金屬沉淀法的鍍銀染色[8,28]，經(jīng)鍍銀染色后，在光學(xué)顯微鏡下可以清晰分辨囊斑表面呈圓形的毛細(xì)胞表皮板輪廓，而不可能將支持細(xì)胞的不規(guī)則形表皮板誤認(rèn)為是毛細(xì)胞的表皮板(圖4C)。囊斑表面鍍上的這一層金屬膜使細(xì)胞不再透明，因而不僅不能看到毛細(xì)胞的細(xì)胞核而且也不能看到毛細(xì)胞層下方的支持細(xì)胞層面。由此可見(jiàn)，前庭感覺(jué)區(qū)上皮的表面鍍銀染色也為我們提供了一種可靠的鑒別毛細(xì)胞的方法。誠(chéng)然，如果應(yīng)用Myosin VI等抗體對(duì)毛細(xì)胞施行特異性染色標(biāo)記后再對(duì)標(biāo)記的毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，相信結(jié)果一定會(huì)更有說(shuō)服力。但是，根據(jù)毛細(xì)胞與支持細(xì)胞大小形態(tài)的顯著差異和毛細(xì)胞圓形表皮板的典型特征，無(wú)論是對(duì)共聚焦顯微鏡下獲得的單層毛細(xì)胞圖像實(shí)施對(duì)毛細(xì)胞的計(jì)數(shù)，還是在光學(xué)顯微鏡下對(duì)表面鍍銀的毛細(xì)胞表皮板進(jìn)行計(jì)數(shù)，我們都可以做到準(zhǔn)確無(wú)誤。因此，我們相信我們獲得的前庭毛細(xì)胞定量觀察結(jié)果是可靠的。

3.3 在壺腹嵴鋪片上展現(xiàn)壺腹嵴上所有毛細(xì)胞的可能性問(wèn)題

由于壺腹嵴在壺腹腔內(nèi)呈一個(gè)橫位小峰樣隆起而高低不平[18,29-31]，因而從壺腹嵴鋪片的觀察平面只能看到壺腹嵴面對(duì)物鏡的感覺(jué)上皮，如果壺腹嵴鋪片呈側(cè)位，則不可能看到壺腹嵴背側(cè)區(qū)域的毛細(xì)胞；如果壺腹嵴鋪片的嵴頂部朝上，則不可能看到壺腹嵴雙側(cè)與觀察視線平行區(qū)域的毛細(xì)胞(圖9)。由此可見(jiàn)，要想從壺腹嵴鋪片的一個(gè)平面上獲取整個(gè)壺腹嵴多個(gè)不同平米上所有毛細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，從技術(shù)上來(lái)說(shuō)存在著難以克服的困難。盡管有人主張應(yīng)用酶分離方法嘗試將壺腹嵴的上皮層從壺腹嵴上剝離下來(lái)再制作成平整的鋪片[25]，但是由于剝離壺腹嵴上皮細(xì)胞層的制作難度較大而并未得到多數(shù)人的認(rèn)可和贊同。然而，從前庭小視野局部區(qū)域的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果得到前庭毛細(xì)胞在壺腹嵴上的平均密度，或許比嘗試從凹凸不平相互遮擋的壺腹嵴鋪片上找到每一個(gè)毛細(xì)胞更能有效解決壺腹嵴毛細(xì)胞的定量觀察問(wèn)題[6,8,12,20,23,28,32]。