聚乙烯亞胺對(duì)人血清白蛋白的構(gòu)象和結(jié)合能力的影響

韋邦幟，郭志勇，王帆，黃愛(ài)民，馬林

廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530004

1 引言

基因治療由于在治療和預(yù)防遺傳性和獲得性疾病方面具有的潛在應(yīng)用而成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最前沿的研究課題之一，基因治療應(yīng)用最大的障礙在于缺乏高效、安全的基因載體系統(tǒng)。病毒載體是迄今最有效的基因傳遞系統(tǒng)，但是病毒載體常常引起嚴(yán)重的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)，使得人們把注意力逐步轉(zhuǎn)向以陽(yáng)離子聚合物和陽(yáng)離子脂質(zhì)體為基材而設(shè)計(jì)和制備基因載體系統(tǒng)1–4。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)由于其高電荷密度和獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”而具有良好的轉(zhuǎn)染效率，相對(duì)分子量25 kDa的支化PEI和相對(duì)分子量22 kDa的線性 PEI被認(rèn)為是高分子基因載體的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”5–8。

PEI材料具有不同程度的細(xì)胞毒性，然而，載體材料的細(xì)胞毒性評(píng)估大都是建立在體外細(xì)胞活性分析(如 MTT)的基礎(chǔ)上，這種試驗(yàn)通常在利用材料處理細(xì)胞后4–8 h進(jìn)行，其結(jié)果只能反映細(xì)胞對(duì)材料的急性應(yīng)答，可能并不代表基因治療中載體材料安全性的真實(shí)情況6–11。Moghimi等9發(fā)現(xiàn)利用PEI處理細(xì)胞后24 h受處理細(xì)胞中才表現(xiàn)出明顯的半胱天冬酶激活現(xiàn)象(細(xì)胞凋亡的表現(xiàn))。目前，盡管 PEI基因載體材料的改性工作已有大量報(bào)道6–8，但是人們對(duì)PEI進(jìn)入生物后對(duì)各種生物大分子和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)功能的影響和作用機(jī)理的了解還相當(dāng)缺乏。

在實(shí)際應(yīng)用中，載體材料攜帶基因通過(guò)多種途徑進(jìn)入生物體。由于血管網(wǎng)絡(luò)遍及生物體，載體材料及其降解碎片總會(huì)或多或少、或早或遲、或直接或間接地進(jìn)入生物體循環(huán)系統(tǒng)，因此，研究載體材料對(duì)血漿蛋白和血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的影響也是其安全性評(píng)估的重要內(nèi)容。研究顯示，PEI能與血漿蛋白結(jié)合并引起血紅細(xì)胞、血小板的結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)的變化11,12。血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，在維持體內(nèi)pH平衡、血漿滲透壓方面具有重要作用。同時(shí)，血清白蛋白是循環(huán)系統(tǒng)中最重要的運(yùn)輸?shù)鞍字?，在許多外源性和內(nèi)源性活性分子的轉(zhuǎn)運(yùn)、分配和代謝中具有關(guān)鍵作用13,14，因此成為了研究生物材料生物相容性最常用的模型蛋白質(zhì)之一15–20。但是，到目前為止，關(guān)于 PEI對(duì)血清白蛋白結(jié)構(gòu)和結(jié)合功能的影響的報(bào)道還非常少。

論文綜合應(yīng)用吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜(circular dichroism，CD)、動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)技術(shù)和zeta-電位測(cè)定研究相對(duì)分子量為25和1.8 kDa的支化PEI與人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的相互作用對(duì)HSA 構(gòu)象的影響。同時(shí)以 8-苯氨基萘-1-磺酸鎂(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)和槲皮素(quercetin，Que)為模型化合物，應(yīng)用熒光光譜法分析PEI對(duì)HSA與小分子化合物結(jié)合能力的影響及機(jī)理，為了解 PEI生物安全性的分子作用機(jī)制提供有用信息。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑

支化PEI (平均相對(duì)分子量為1.8和25 kDa，記為 PEI1.8k和 PEI25k）、HSA(＞ 96%，凍干粉)和ANS (＞ 97%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，生化純槲皮素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。所有試劑未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。

PEI和 HSA 溶解于 10 × 10?3mol·L?1磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)分別配制 10 mg·mL?1和 2.5 ×10?4mol·L?1儲(chǔ)備液，以 HCl/NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH至7.4，0–5 °C保存?zhèn)溆?，使用時(shí)以PBS稀釋至所需要的濃度。由于論文工作中所用的 PEI的平均相對(duì)分子量相差很大，為便于比較，PEI的濃度以質(zhì)量濃度表示，而其他物料的濃度則以摩爾濃度表示。

ANS溶解于PBS制成儲(chǔ)備液，0–5 °C保存。ANS儲(chǔ)備液濃度利用日本 Shimadzu UV-2501PC分光光度計(jì)在350 nm測(cè)定，摩爾吸光系數(shù)取6300 L·mol?1·cm?121。

槲皮素溶解于分析純乙醇配制 1.0 × 10?2mol·L?1儲(chǔ)備液，0–5 °C 保存?zhèn)溆?。使用前?PBS稀釋至 1.0 × 10?4mol·L?1，光譜測(cè)定時(shí)稀釋至所需濃度。

2.2 儀器和實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光

以PBS緩沖液配制系列濃度的PEI溶液，加入 HSA儲(chǔ)備液、混合均勻(HSA最終濃度為 5 ×10?6mol·L?1)，25 °C 下利用日本 Shimadzu RF6000熒光分光光度計(jì)測(cè)定 HSA的發(fā)射熒光光譜(λex=295 nm)，測(cè)量時(shí)激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為3 nm，波長(zhǎng)掃描范圍為300–450 nm。

2.2.2 紫外-可見(jiàn)光吸收

配制PEI濃度系列變化的HSA-PEI溶液，以相同濃度的PEI溶液作為參比，利用1 cm光程石英比色皿在日本 Shimadzu UV-2501PC分光光度計(jì)測(cè)定 HSA的吸收光譜，波長(zhǎng)掃描范圍為 200–500 nm。

2.2.3 動(dòng)態(tài)光散射和zeta-電位

配制PEI濃度系列變化的HSA-PEI溶液，25 °C下在英國(guó)Malvern Zetasizer Nano ZS納米粒度電位測(cè)定儀上測(cè)定 HSA的流體動(dòng)力學(xué)直徑和 zeta-電位。相同條件下至少測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

2.2.4 圓二色譜

配制PEI濃度系列變化的HSA-PEI溶液，使用光程為 1 mm的石英樣品池在 Chirascan Spectrometer型 CD 光譜儀(英國(guó) Applied Photophysics Ltd.公司)室溫下測(cè)定 HSA 在 190–250 nm的圓二色譜，測(cè)量時(shí)掃描步進(jìn)0.5 nm，響應(yīng)時(shí)間0.1 s，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次后取平均。相同條件下測(cè)定同濃度 PEI溶液的圓二色譜，其影響在最終結(jié)果中扣除。

2.2.5 ANS和槲皮素?zé)晒?/p>

準(zhǔn)確移取所需的 ANS (或槲皮素)儲(chǔ)備液、HSA儲(chǔ)備液和PEI儲(chǔ)備液，配置PEI濃度系列變化的 ANS (或槲皮素)-PEI溶液和 ANS (或槲皮素)-PEI-HSA溶液(ANS、槲皮素和HSA最終濃度均為 5 × 10?6mol·L?1，利用 1 cm × 1 cm 石英比色皿在日本Shimadzu RF6000熒光分光光度計(jì)上測(cè)定ANS和槲皮素的發(fā)射熒光光譜。ANS熒光激發(fā)波長(zhǎng)λex= 388 nm，波長(zhǎng)掃描范圍為400–600 nm；槲皮素?zé)晒饧ぐl(fā)波長(zhǎng)λex= 465 nm，波長(zhǎng)掃描范圍為480–700 nm。測(cè)量時(shí)激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為3和1.5 nm。

圖1 HSA在含PEI的PBS緩沖液(pH 7.4)中的吸收光譜

3 結(jié)果與討論

3.1 PEI與HSA的相互作用對(duì)HSA構(gòu)象的影響

3.1.1 吸收光譜

HSA在含系列濃度PEI的緩沖液中的吸收光譜匯總于圖1。在PBS緩沖溶液中，HSA在210 nm附近具有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰。一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)在190–240 nm 的吸收源自于酰胺基團(tuán)的 n→π*和π→π*躍遷，其變化與骨架肽鏈的結(jié)構(gòu)有關(guān)，可以反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化22,23。圖2給出了含不同濃度PEI的緩沖液中HSA酰胺基團(tuán)最大吸收波長(zhǎng)和最大吸收強(qiáng)度，可見(jiàn)，隨著溶液中 PEI濃度的增加，HSA酰胺基團(tuán)吸收峰逐步紅移，吸收強(qiáng)度下降，意味著PEI可能與HSA的酰胺基團(tuán)結(jié)合并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

PEI與HSA結(jié)合形成復(fù)合物還表現(xiàn)為溶液體系光密度的變化。HSA和PEI在300 nm以上波長(zhǎng)基本沒(méi)有吸收(圖 1和圖 S1 (見(jiàn) Supporting Information))，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSA溶液中添加少量PEI25k可以使得300 nm以上波長(zhǎng)的吸光度輕微增加(圖1)，由于實(shí)驗(yàn)中以同濃度的PEI溶液為參比，因此HSA-PEI溶液300 nm以上波長(zhǎng)的吸光度主要?dú)w因于溶液中HSA-PEI復(fù)合物顆粒光散射導(dǎo)致的光密度的變化。圖3給出了HSA-PEI25k溶液500 nm光密度值隨著溶液中PEI25k濃度的變 化 關(guān) 系， 可 見(jiàn)， cPEI25k≥ 0.2 mg·mL?1時(shí)HSA-PEI25k溶液500 nm光密度值基本不變，表明PEI25k與HSA結(jié)合達(dá)到飽和。

蛋白質(zhì)分子芳香族氨基酸殘基的 π→π*躍遷在260–300 nm范圍內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)弱的吸收峰，其吸收強(qiáng)度和波長(zhǎng)的變化通常意味著酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸所處微區(qū)環(huán)境發(fā)生改變24。在實(shí)驗(yàn)研究的PEI濃度范圍內(nèi)，HSA芳香族氨基酸殘基最大吸收波長(zhǎng)無(wú)明顯變化，但是少量PEI25k可以使吸收強(qiáng)度明顯增加，PEI25k濃度大于0.2 mg·mL?1時(shí)吸收強(qiáng)度輕微下降。這一規(guī)律與溶液體系光密度的變化不同(圖3)，說(shuō)明芳香族氨基酸殘基暴露程度減小，蛋白質(zhì)分子可能形成更緊密的構(gòu)象。

由圖1和圖2可以看到，PEI與蛋白質(zhì)的相互作用具有明顯的分子尺寸效應(yīng)，相對(duì)分子量較大的 PEI25k對(duì) HSA構(gòu)象的影響更明顯，HSA-PEI1.8k溶液250 nm以上波長(zhǎng)吸收光譜變化很小，因此圖3未給出含PEI1.8k的緩沖液中HSA氨基酸殘基吸收和溶液光密度的分析結(jié)果。

3.1.2 zeta-電位

圖4給出了含不同濃度PEI25k和PEI1.8k的緩沖液中HSA的zeta-電位。HSA是一種酸性蛋白(pI ～5.6)25，在中性 PBS (pH7.4)中其 zeta-電位為?10.5 mV。溶液中添加PEI25k導(dǎo)致HSA表面電位增加，并在濃度大于0.06 mg·mL?1時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)檎怠EI1.8k同樣導(dǎo)致HSA表面電位增加，但是在研究的濃度范圍內(nèi)，HSA的zeta-電位均為負(fù)值。

PEI為多胺化合物，其氨基易于發(fā)生質(zhì)子化而帶正電荷。Yasuhara等26研究表明相對(duì)分子量較低的PEI更易于質(zhì)子化。Sabín等27曾測(cè)定PEI1.8k在不同pH下的zeta-電位，根據(jù)他們的結(jié)果，pH7.4時(shí)PEI1.8k的zeta-電位約為13 mV。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PEI25k和PEI1.8k在PBS (pH 7.4)中的zeta-電位分別為7.0和14.1 mV，與Yasuhara26和Sabín27等的結(jié)果相吻合。然而，由圖4可以看到，相對(duì)分子量較高的PEI對(duì)HSA表面電位具有更大的影響，說(shuō)明HSA表面電位的增加不是由于與帶正電荷的PEI的簡(jiǎn)單混合、而是由于HSA與PEI形成靜態(tài)復(fù)合物而造成的。

圖2 PBS緩沖液(pH 7.4)中HSA酰胺基團(tuán)最大吸收波長(zhǎng)λmax (實(shí)線)和最大吸收強(qiáng)度Amax (虛線)隨著PEI濃度的變化關(guān)系

圖 3 HSA-PEI25k 溶液 280 nm (■) 和 500 nm (○)吸光度隨著溶液中PEI25k濃度的變化關(guān)系

圖4 PBS緩沖液(pH 7.4)中HSA的zeta-電位隨著PEI濃度的變化關(guān)系

大分子離子吸附帶相反電荷的聚電解質(zhì)常常導(dǎo)致表面電位的反轉(zhuǎn)。在含高濃度PEI25k的緩沖液中HSA-PEI復(fù)合物的表面電位為正值，說(shuō)明結(jié)合在HSA表面的PEI分子所攜帶的正電荷多于蛋白質(zhì)的負(fù)電荷。根據(jù)Nguyen和Shklovskii的觀點(diǎn)28,29，由于分子間或者支鏈間的靜電排斥作用，吸附于蛋白質(zhì)表面的 PEI只有部分鏈段與蛋白質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合，而游離的陽(yáng)離子基團(tuán)導(dǎo)致表面電位的反轉(zhuǎn)。研究顯示，相對(duì)分子量較低的 PEI更傾向于以平鋪的構(gòu)象吸附在陰離子基質(zhì)的表面30。Anderson等31認(rèn)為PEI以疏松、卷曲的構(gòu)象平鋪結(jié)合在蛋白質(zhì)分子表面，相對(duì)分子量較低的 PEI更有利于與蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生緊密的接觸。因此，與PEI25k相比，結(jié)合在HSA表面的PEI1.8k分子上游離的陽(yáng)離子氨基基團(tuán)的數(shù)量較少，從而使復(fù)合物具有較低的表面電位(圖4)。

3.1.3 動(dòng)態(tài)光散射

利用DLS測(cè)定了HSA-PEI溶液的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑，結(jié)果匯總于圖5。HSA在PBS中的流體動(dòng)力學(xué)直徑約為10.2 nm，添加少量PEI25k (≤ 0.05 mg·mL?1)使得溶液的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑先減小后增加，在0.01 mg·mL?1附近達(dá)到最小值，進(jìn)一步增加PEI25k濃度時(shí)平均流體動(dòng)力學(xué)直徑緩慢增加。低濃度PEI1.8k (≤ 0.02 mg·mL?1)同樣導(dǎo)致溶液平均流體動(dòng)力學(xué)直徑迅速減小，隨著PEI1.8k濃度的進(jìn)一步增加，溶液平均流體動(dòng)力學(xué)直徑輕微減小。

HSA-PEI溶液平均流體動(dòng)力學(xué)直徑的變化可能受到以下因素的影響：(1) PEI對(duì)溶液體系散射光的影響，(2) PEI與HSA結(jié)合形成復(fù)合物，(3)HSA構(gòu)象的變化。高支化PEI分子可以近似看作球形26，由于所用PEI的相對(duì)分子量較大，其對(duì)HSA流體動(dòng)力學(xué)直徑的測(cè)定不容忽視，因此論文利用DLS 技術(shù)測(cè)定 0.1、0.5 和 1.0 mg·mL?1三個(gè)不同濃度下 PEI的流體動(dòng)力學(xué)直徑，結(jié)果顯示改變濃度對(duì)PEI分子的流體動(dòng)力學(xué)直徑的影響可以忽略，PEI25k和PEI1.8k分子的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑分別為 10.9 和 2.5 nm。由圖 5可以看到，PEI25k濃度大于 0.05 mg·mL?1時(shí)，HSA-PEI25k 溶液平均流體動(dòng)力學(xué)直徑緩慢增加，并與PEI25k分子流體動(dòng)力學(xué)直徑非常接近，因此可以認(rèn)為含高濃度PEI25k的HSA-PEI25k溶液體系動(dòng)態(tài)散射光測(cè)定結(jié)果主要體現(xiàn)PEI25k的影響。由于HSA-PEI復(fù)合物的形成將導(dǎo)致顆粒流體動(dòng)力學(xué)直徑的增加，因此含低濃度PEI25k的HSA-PEI25k溶液平均流體動(dòng)力學(xué)直徑減小說(shuō)明HSA形成更緊密的構(gòu)象。由Rayleigh定律可知，散射光強(qiáng)度與顆粒粒徑的 6次方成正比，由于PEI1.8k的流體動(dòng)力學(xué)直徑遠(yuǎn)小于HSA，因此HSA-PEI1.8k溶液動(dòng)態(tài)散射光測(cè)定結(jié)果主要體現(xiàn) HSA-PEI1.8k復(fù)合物的形成和蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化，溶液平均流體動(dòng)力學(xué)直徑減小表明PEI1.8k與HSA的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子形成更緊密的構(gòu)象。

圖5 HSA-PEI溶液平均流體動(dòng)力學(xué)直徑Dhy隨著溶液中PEI濃度的變化關(guān)系

圖6 PBS緩沖液(pH 7.4)中PEI25k對(duì)HSA發(fā)射熒光光譜的影響

3.1.4 內(nèi)源熒光

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光主要來(lái)自色氨酸殘基和酪氨酸殘基。色氨酸殘基熒光對(duì)環(huán)境極性非常敏感，一般情況下，色氨酸殘基的熒光光譜發(fā)生紅移，意味著所處微區(qū)環(huán)境極性增強(qiáng)或在極性環(huán)境中的暴露程度增加32,33。由于酪氨酸與色氨酸殘基的熒光光譜相互疊加，對(duì)蛋白質(zhì)熒光光譜的分析帶來(lái)一定的困難，論文采用295 nm激發(fā)波長(zhǎng)避免酪氨酸殘基與色氨酸殘基之間的共振能量轉(zhuǎn)移由于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化對(duì)后者發(fā)射熒光的影響32。由于PEI1.8k對(duì)HSA熒光光譜的影響不明顯，圖6僅給出了HSA在含PEI25k的緩沖液中的詳細(xì)結(jié)果。由圖可見(jiàn)，PBS緩沖溶液中HSA色氨酸殘基在350 nm附近出現(xiàn)最大熒光，低濃度PEI25k對(duì)HSA最大發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但是高濃度PEI25k導(dǎo)致HSA色氨酸發(fā)射熒光光譜輕微藍(lán)移，說(shuō)明色氨酸殘基所處環(huán)境極性下降。HSA只有 1個(gè)色氨酸殘基Trp214，位于結(jié)構(gòu)亞域IIA的疏水口袋中34,35，上述結(jié)果說(shuō)明PEI結(jié)合導(dǎo)致HSA形成更緊密的構(gòu)象，與吸收光譜分析相吻合。

3.1.5 圓二色譜

論文測(cè)定了含PEI溶液中HSA的圓二色譜(詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖S2 (Supporting Information))。HSA在208和222 nm出現(xiàn)兩個(gè)明顯的負(fù)峰，這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色特征36,37。與PEI25k的結(jié)合不改變HSA的圓二色特征，但是208和222 nm圓二色橢圓度隨著 PEI25k濃度的增加先減小后增加，在0.02 mg·mL?1附近達(dá)到最小值。與 PEI25k不同，PEI1.8k使得 HSA圓二色橢圓度持續(xù)下降(圖 7)。Mazzaferro等25認(rèn)為酸性蛋白質(zhì)在PEI溶液中聚集導(dǎo)致 CD信號(hào)的減弱，然而，比較圖 7與圖 3和圖5可以看到，含PEI溶液中HSA圓二色橢圓度與溶液光密度的變化規(guī)律具有很大區(qū)別，而與溶液平均流動(dòng)動(dòng)力學(xué)直徑的變化非常相似，說(shuō)明HSA圓二色橢圓度的變化主要是由于蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化引起的，相對(duì)分子量較低的PEI1.8k和低濃度的PEI25k引起HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，而高濃度的PEI25k對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用。

圖7 PBS緩沖液(pH 7.4)中HSA在222 nm的圓二色橢圓度θ222隨著PEI濃度的變化關(guān)系

圖8 PBS緩沖液(pH7.4)中ANS最大發(fā)射熒光強(qiáng)度隨著PEI濃度的變化關(guān)系

圖9 含HSA的PBS緩沖液(pH 7.4)中ANS最大發(fā)射熒光強(qiáng)度隨著PEI濃度的變化關(guān)系

3.2 PEI對(duì)藥物小分子與HSA結(jié)合的影響

3.2.1 HSA-ANS結(jié)合

ANS能與血清白蛋白結(jié)合并猝滅其內(nèi)源熒光38,39。熒光猝滅法是研究藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用的有用方法，但是ANS-HSA-PEI溶液中各組分之間相互作用和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化使得解釋HSA與ANS之間的共振能量轉(zhuǎn)移變得很復(fù)雜。因此，論文根據(jù)ANS熒光光譜分析PEI對(duì)HSA與ANS結(jié)合能力的影響，測(cè)定了PEI濃度系列變化的ANS-HSA-PEI溶液中ANS的發(fā)射熒光光譜(λex=388 nm)，考慮到PEI與ANS的相互作用，論文同時(shí)測(cè)定了ANS-PEI溶液中ANS熒光光譜(詳細(xì)結(jié)果匯總于圖 S3和 S4 (見(jiàn) Supporting Information))，其最大熒光發(fā)射強(qiáng)度隨著溶液中PEI濃度的變化規(guī)律示于圖8和圖9。

ANS是分析疏水相互作用的良好探針，其熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移通常意味著所處環(huán)境疏水性的增強(qiáng)32,40。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PBS中ANS在517 nm附近有一個(gè)非常弱的熒光峰，添加 PEI引起 ANS熒光輕微增強(qiáng)和光譜藍(lán)移(圖S3)，說(shuō)明PEI分子與ANS結(jié)合并增強(qiáng)了ANS所處環(huán)境的疏水性。與HSA的結(jié)合使得ANS的熒光藍(lán)移至473 nm，熒光強(qiáng)度急劇增強(qiáng)(圖S4)，說(shuō)明ANS進(jìn)入了HSA的疏水內(nèi)核。中性條件下ANS在HSA和BSA分子上的平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為14和17.641，Daniel和Weber39的研究結(jié)果顯示，ANS與BSA結(jié)合后其熒光大部分來(lái)自結(jié)合在疏水內(nèi)核的4–5個(gè)ANS分子。由此可知，ANS-HSA-PEI溶液中任何兩個(gè)組分間都能形成復(fù)合物。由于PEI結(jié)合在蛋白質(zhì)表面，同時(shí) PEI分子具有大量的氨基基團(tuán)，因此可以假設(shè)HSA-PEI復(fù)合物的形成對(duì)PEI與ANS結(jié)合的影響較小，PEI對(duì)HSA與ANS結(jié)合能力的影響取決于PEI與ANS的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。由于HSA對(duì)ANS熒光的增強(qiáng)作用遠(yuǎn)大于PEI (圖8和圖9)，PEI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合將導(dǎo)致ANS熒光強(qiáng)度的下降。然而，由熒光光譜分析可知，PEI結(jié)合增強(qiáng)了HSA分子內(nèi)部疏水性，這將有利于與 ANS的結(jié)合。這就很好解釋了ANS-HSA-PEI溶液中 ANS的熒光強(qiáng)度隨著 PEI濃度的增加而先減弱后增強(qiáng)的現(xiàn)象(圖 9)。盡管PEI25k對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響更有效，但是圖9結(jié)果顯示含PEI1.8k溶液中ANS熒光的變化更明顯，這可能歸因于相對(duì)分子量較大的PEI25k具有更強(qiáng)的ANS結(jié)合能力(圖8)。

3.2.2 HSA-槲皮素結(jié)合

槲皮素具有熒光活性，但是5-羥基與4-羰基的氫鍵作用使得槲皮素容易發(fā)生激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在水中觀察不到明顯的熒光，槲皮素與其他分子結(jié)合時(shí)常?？梢韵肿觾?nèi)氫鍵導(dǎo)致的熒光猝滅，從而表現(xiàn)出不同的熒光特征42–46。因此，論文根據(jù)槲皮素?zé)晒夤庾V分析PEI對(duì)HSA與槲皮素結(jié)合能力的影響，測(cè)定了 PEI濃度系列變化的槲皮素-PEI溶液和槲皮素-HSA-PEI溶液中槲皮素的發(fā)射熒光光譜(λex= 465 nm)，結(jié)果匯總于圖10和11。

圖10 含PEI的PBS緩沖液(pH 7.4)中槲皮素發(fā)射熒光光譜

圖11 含HSA和PEI的PBS (pH 7.4)緩沖液中槲皮素的發(fā)射熒光光譜

槲皮素在PBS中無(wú)明顯熒光(圖10)，與HSA結(jié)合后在530 nm附近表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光(圖11)。槲皮素與 BSA結(jié)合后也有相同的現(xiàn)象。Dangles等44認(rèn)為，與BSA的結(jié)合促進(jìn)了槲皮素的5-羥基、3-羥基和 4-羰基之間的分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，形成高熒光活性的類(lèi)吡喃結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。質(zhì)子性溶劑，如乙醇和纖維素通過(guò)與槲皮素的 5-羥基形成氫鍵消除了槲皮素分子內(nèi)氫鍵導(dǎo)致的熒光猝滅45,46。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PEI也導(dǎo)致槲皮素出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)在560 nm附近(圖10)，與槲皮素在乙醇中的發(fā)射熒光光譜相類(lèi)似45，說(shuō)明 PEI作為質(zhì)子受體與槲皮素分子5-羥基形成氫鍵。

以上分析表明，槲皮素-HSA-PEI溶液中任何兩個(gè)組分都可以形成復(fù)合物，因此，應(yīng)該從蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和 PEI的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合兩個(gè)因素理解 PEI對(duì)HSA-槲皮素復(fù)合物形成的影響。由于槲皮素-HSA和槲皮素-PEI復(fù)合物的特征熒光光譜相互疊加，論文對(duì)槲皮素-HSA-PEI溶液中槲皮素的熒光光譜按以下方程進(jìn)行分解，

其中 FQue-HSA(λ)和 FQue-PEI(λ)為槲皮素-HSA 和槲皮素-PEI復(fù)合物的特征熒光光譜。溶液中槲皮素與HSA和PEI的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡過(guò)程，由于試驗(yàn)中無(wú)法分離槲皮素-HSA和槲皮素-PEI復(fù)合物并獲得其特征熒光光譜，因此實(shí)際計(jì)算中以無(wú)PEI的槲皮素-HSA溶液和含高濃度PEI25k (1.0 mg·mL?1)的槲皮素-PEI25k溶液的熒光光譜作為參考，所得參數(shù)B和C代表槲皮素-HSA-PEI溶液中槲皮素-HSA和槲皮素-PEI復(fù)合物與對(duì)照溶液中槲皮素復(fù)合物的相對(duì)濃度。參數(shù)A無(wú)明確物理意義，可能代表基線漂移、光散射等其他因素的影響。計(jì)算結(jié)果顯示，上述方法可以很好擬合槲皮素-HSA-PEI溶液中槲皮素?zé)晒夤庾V，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，所得參數(shù)B和C匯總于圖12。參數(shù)A值與相應(yīng)溶液中槲皮素最大熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值小于0.8%，可以忽略不計(jì)。

HSA與BSA結(jié)構(gòu)高度相似，因此可以認(rèn)為槲皮素與HSA的結(jié)合機(jī)理與BSA相同。研究表明槲皮素通過(guò)疏水相互作用結(jié)合到BSA的疏水空穴44，與ANS與BSA的相互作用機(jī)理相類(lèi)似39,41。因此，可以推測(cè)，槲皮素-HSA-PEI溶液中槲皮素與HSA的結(jié)合將受到 PEI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性增強(qiáng)兩個(gè)相反因素的影響。如圖12所示，隨著PEI濃度的增加，槲皮素-HSA-PEI溶液中PEI-槲皮素復(fù)合物的濃度單調(diào)增加，而槲皮素-HSA復(fù)合物的濃度則表現(xiàn)出“S”型的變化規(guī)律，少量 PEI (濃度低于0.1 mg·mL?1)顯著減少了HSA-槲皮素復(fù)合物的形成，但是其影響隨著溶液中 PEI濃度的增加迅速減弱，隨著溶液中PEI濃度的進(jìn)一步增加，HSA對(duì)槲皮素的結(jié)合能力緩慢下降，其下降速率略有增加。這一規(guī)律與ANS-HSA-PEI溶液中ANS熒光的變化相類(lèi)似(圖9)，不同之處在于，可能由于ANS熒光對(duì)環(huán)境疏水性變化非常敏感，PEI濃度較高的溶液中 ANS熒光明顯增加(圖 9)，而槲皮素-HSA復(fù)合物僅表現(xiàn)為濃度下降速率的減緩(圖 12)。

圖12 槲皮素-HSA-PEI的PBS (pH 7.4)緩沖液中槲皮素?zé)晒夤庾V分解擬合參數(shù)B和C隨著PEI濃度的變化關(guān)系

4 結(jié)論

PEI與HSA結(jié)合形成靜態(tài)復(fù)合物，在一定程度上影響了HSA的構(gòu)象和結(jié)合能力。在水溶液中，PEI結(jié)合有助于HSA形成更緊密的構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子流體動(dòng)力學(xué)直徑變小和分子內(nèi)環(huán)境疏水性增強(qiáng)。相對(duì)分子量較低的PEI1.8k能引起HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，低濃度的PEI25k也有類(lèi)似的作用，但是高濃度的PEI25k對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用。PEI對(duì)HSA結(jié)合能力的影響主要?dú)w因于PEI的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和PEI與HSA結(jié)合引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。PEI的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合降低了HSA對(duì)ANS和槲皮素的結(jié)合效率，但是蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化增強(qiáng)了HSA與ANS和槲皮素的結(jié)合能力。PEI與HSA的相互作用具有明顯的分子尺寸效應(yīng)，增加PEI的相對(duì)分子量可以增強(qiáng)對(duì)HSA構(gòu)象和結(jié)合能力的影響。

Supporting Information:available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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