核輻射污染區(qū)真菌的分布及多樣性研究

張志東, 張麗娟, 朱 靜, 唐琦勇, 王 瑋, 顧美英, 宋素琴

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所，新疆 烏魯木齊 830091)

自1956 年美國人首次發(fā)現(xiàn)耐輻射奇異球菌(Deinococcusradiodurans)以來[1]，耐輻射微生物因其驚人的耐輻射能力，以及特殊的生命現(xiàn)象、生理機(jī)制和功能基因，為研究生物起源、物種進(jìn)化等提供了重要研究材料和科學(xué)論據(jù)。同時(shí)，因其在環(huán)境工程、人類健康、生物技術(shù)乃至軍事等方面具有極大的應(yīng)用前景，已成為科學(xué)界關(guān)注、研究的熱點(diǎn)[2-5]。耐輻射真菌的相關(guān)研究最早可追溯到1960年，Durrell等[6]首次對美國內(nèi)華達(dá)核試驗(yàn)基地中真菌進(jìn)行了調(diào)查研究。此后，國際上在不同環(huán)境下和樣品中也分離到具有一定輻射耐受性的真菌[7-8]。目前，較為系統(tǒng)研究主要針對前蘇聯(lián)發(fā)生核事故的切諾貝爾利核電站周邊的真菌的研究[9-11]。研究表明，該區(qū)域存在豐富的真菌多樣性。通過與相應(yīng)對照區(qū)域分離出的真菌相比，具有較強(qiáng)的抗氧化劑能力和較高的抗氧化酶酶活性，能吸收諸如137Cs、121Sr、152Eu、239Pu 和241Am等多種放射性核素，特別是部分菌株存在著不同程度的趨輻射性生長特性，部分菌株可以吸收輻射射線作為生長能源的能力，展現(xiàn)了輻射污染區(qū)真菌難以置信的輻射適應(yīng)性[12-15]。中國核輻射污染區(qū)地處我國新疆自治區(qū)中東部，與切爾諾貝利核電站氣候和生態(tài)環(huán)境完全不同，是典型的干旱荒漠地區(qū)，該區(qū)域先后開展了多次不同核素、不同劑量的相關(guān)核試驗(yàn)，成為我國獨(dú)一無二、不可復(fù)制的人造特殊環(huán)境[16]，由于該區(qū)域的特殊性，國內(nèi)外少有科學(xué)研究者對該區(qū)域真菌群落進(jìn)行研究。 因此，本研究以輻射污染區(qū)真菌為研究對象, 以中國輻射污染區(qū)某污染源為圓心，在其半徑50 km范圍內(nèi)進(jìn)行了樣品采集，并采用多種樣品預(yù)處理方法及多種培養(yǎng)基對輻射區(qū)內(nèi)真菌進(jìn)行分離篩選，初步分析了該區(qū)域真菌的分布和多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究區(qū)域概況與樣品 2013年9月, 以中國輻射污染區(qū)某污染源為圓心，在其半徑50 km范圍內(nèi)進(jìn)行樣品采集，在各采樣點(diǎn)除去5 cm的表層土后，取深5～30 cm 的土壤(混勻)裝入無菌取樣盒中，4 ℃冰箱保存。根據(jù)其輻射污染程度分為高(H)、中(AI)、低(L)污染樣品，具體為高輻射污染 >10 000 Bq/kg，中輻射污染為1 000～2 000 Bq/kg，低輻射污染為100～200 Bq/kg，相關(guān)土樣其他信息見表1。

表1 不同輻射污染程度下土壤樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基、馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基以及查氏培養(yǎng)[17-18]。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 根據(jù)輻射采樣區(qū)域和輻射劑量的不同，對所采集的樣品進(jìn)行相關(guān)合并，分別取出部分樣品經(jīng)3 kGy(劑量率為100 Gy/h)60Co輻射處理或0.01 mol/L H2O2浸泡1 h處理后，采用梯度稀釋法涂布，對檢出真菌數(shù)量進(jìn)行分析，并以未處理樣品為對照[11]。

1.2.2 菌種的分離篩選 采用稀釋涂布平板法分離土壤中的真菌,每一處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，涂布后置于25 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，根據(jù)菌落形態(tài)，對每種土樣及培養(yǎng)基中分離菌株進(jìn)行單獨(dú)編號、純化保存，并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)。將純化菌株接種PDA平板上, 主要參照中國真菌志[19-22]，每隔24 h觀察菌落形態(tài)、顏色、培養(yǎng)基顏色；用載片培養(yǎng)法，觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形態(tài)，定期觀察，并進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 菌種ITS序列分析 真菌基因組DNA的提取采用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(北京博大泰克公司生產(chǎn))。ITS rDNA的PCR擴(kuò)增采用真菌的通用引物,正向引物ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGC，反向引物ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC，由上海生工生物技術(shù)公司合成。擴(kuò)增條件[18]：94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA片段快速膠回收試劑盒(北京博大泰克公司生產(chǎn))回收純化后，由北京鼎國生物技術(shù)公司完成測序工作。經(jīng)測序所得菌株完整的ITS序列(包括5.8S rDNA)，與GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對，并調(diào)取GenBank的相似序列進(jìn)行多重序列比對后，使用MEGA 5.0的Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[23]。實(shí)驗(yàn)菌株ITS已在GenBank注冊， Accession number分別為 KY931491～KY931517。

1.2.4 土壤真菌的多樣性測度 根據(jù)鑒定的土壤真菌和各測試指數(shù)的特點(diǎn)及取樣數(shù)據(jù)的類型，應(yīng)用生態(tài)學(xué)評價(jià)方法[24],選用物種的豐富度指數(shù):S=N; Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)，Simpson優(yōu)勢度(D)，PieLou均勻度指數(shù)(J)。

1.2.5 菌種耐輻射特性研究 將分離獲得真菌菌株按分類選取部分代表菌株，接種于裝有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)3 d，用無菌試鏡紙過濾去除菌球和大段菌絲，5 000 r/min離心收集菌體，用0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)洗滌菌體3次，并調(diào)整至濃度OD6001.0左右。取上述菌懸液 5 mL裝至15 mm×150 mm無菌試管中，置于60Co γ射線(劑量率100 Gy/min)進(jìn)行不同劑量照射后，分別稀釋至10-2，取0.1 mL稀釋液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察存活菌落。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土樣及處理對真菌檢出的影響

采集的54份樣品總體均為戈壁荒漠土，土壤pH 8.0以上。盡管樣品周邊存在不同的植被情況，但為了研究的可比性，本研究所用土樣均為無植被覆蓋區(qū)域，樣品總有機(jī)質(zhì)在0.21%～0.43%，根據(jù)其輻射污染程度樣品進(jìn)行了相關(guān)合并為9份，大至可以分為3類，即高(H)、中(M)、低(L)污染土樣。

樣品經(jīng)3 kGy(劑量率為100 Gy/h)60Co輻射處理或0.01 mol/L H2O2浸泡1 h處理后，分別采用梯度稀釋法涂布至各類分離平板上，統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基中檢出真菌數(shù)量，并以檢出數(shù)量最高的培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以未處理樣品為對照，結(jié)果見圖1。

圖1 不同土樣處理下真菌群落檢出情況Fig.1 Effection of fungal colonies on different pretreatments

由圖1可以看出，試驗(yàn)樣品中的真菌數(shù)量隨著離輻射源的距離而增加，由于輻射劑量率與輻射源的距離成反比，因此，菌落數(shù)也與輻射劑量成反比，即輻射劑量越高真菌的數(shù)量越少。通過對土樣不同處理發(fā)現(xiàn)，低劑量輻射對中、高輻射污染區(qū)樣品中真菌有明顯的激活效應(yīng)，真菌菌落最高檢出可以提高2倍以上，但低輻射區(qū)樣品真菌反而有所降低，其原因可能為部分非耐輻射真菌被輻射致死，進(jìn)而總體菌落略有下降。H2O2浸泡1 h處理后，各樣品中真菌檢出均有所下降，可能與H2O2殺死部分菌種有關(guān)，但該處理據(jù)報(bào)道可以提高耐輻射真菌的篩選[11]。

同時(shí)，根據(jù)菌落形態(tài)對每種土樣及培養(yǎng)基中分離的菌株進(jìn)行單獨(dú)編號、純化保存，并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)，共獲得209株各類真菌。對不同培養(yǎng)基在使用輻射處理和無輻射處理篩選出菌株情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中使用的4種真菌篩選培養(yǎng)基中，PDA培養(yǎng)基中篩選的菌株種類最多，其次為查氏培養(yǎng)基，MEA培養(yǎng)基中分離的菌株最少(圖2);而且通過輻射預(yù)處理土樣，有利于提高輻射污染區(qū)中真菌的種類。

圖2 不同處理下各培養(yǎng)基對分離菌株種類的影響Fig.2 Effection of isolate types on different screening media

2.2 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析

本研究獲得209株各類真菌，再次通過詳細(xì)的菌落特征和顯微形態(tài)觀察后,選取具有代表性菌株52株，進(jìn)行ITS rDNA序列測定。所得ITS rDNA序列長度為514～641 bp，序列經(jīng)Blast與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并調(diào)出相關(guān)菌株的有效序列，使用MEGA5.0軟件進(jìn)行序列比對、聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖3)。由圖3可以看出，代表性菌株分別歸屬于真菌的交鏈孢霉(Alternaria)、離蠕孢屬(Bipolaris)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、Westerdykella、短梗霉屬(Aureobasidium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、Kernia、毛殼屬(Chaetomium)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、座孢霉屬(Myrothecium)、鐮孢屬(Fusarium)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、紅酵母屬(Rhodotorula)、隱球酵母屬(Cryptococcus)等16屬27個(gè)種，絕大部分菌株為已知菌。其中代表菌株Y521、PCK401與相關(guān)種屬最近種的同源性在94%以下，通過28S LSU D1/D2 序列及翻譯延長因子(translation elongation factor 1)、β微管蛋白(beta-tubulin)、磷酸透性酶(phosphate permease)多基因序列比對，初步確定其為潛在新種，相關(guān)研究將另行報(bào)道。

2.3 輻射區(qū)真菌群落的分布

對分離的16個(gè)屬209株真菌統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，輻射污染程度對真菌的種群分布和組成有極大影響，輻射污染程度越高，其分離的菌株數(shù)量越少，其中高輻射污染土樣分離株僅占9.6 %(表2)。在分離獲得真菌中曲霉屬、隱球酵母屬、青霉屬和鐮孢霉屬菌株最多，分別占所有分離株的22.5%、19.1%、17.2%和11.0%，合計(jì)近70%(表3)。在各組土樣中，青霉屬、莖點(diǎn)霉屬、隱球酵母屬、短梗霉屬菌株均有發(fā)現(xiàn)，隨著輻射污染程度逐步降低，土樣中逐次開始檢出鐮孢霉屬、交鏈孢霉屬、毛殼霉屬和曲霉屬、Kernia屬真菌，而根霉屬、離蠕孢屬、座孢霉屬、紅酵母屬和小克銀漢霉屬僅在低污染程度中出現(xiàn)。而Westerdykella屬和葡萄孢霉屬僅分別在高污染土樣和中污染土樣中檢出(表3)，上述結(jié)果可能與各屬真菌的耐輻射和生長耐性有關(guān)，相關(guān)研究正在開展。

通過對樣品按高(H)、中(M)、低輻射污染土樣(L)進(jìn)行合并，分別使用菌屬豐富度、香農(nóng)指數(shù)(H)、辛普森指數(shù)(D)、Pielou指數(shù)(J)對樣品多樣性隨著輻射的增加變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表4)。結(jié)果顯示，隨著污染程度的增加，各個(gè)指數(shù)迅速降低，證明輻射污染程度對真菌的豐富度、多樣性以及均勻度影響明顯。

表2 不同輻射程度樣品中真菌分離情況

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的部分輻射污染區(qū)真菌分離株N-J進(jìn)化樹Fig.3 Neighbor-Joining tree of isolates and related species based on ITS sequences 節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值基于1 000計(jì)算后的百分可信值，刻度尺為核酸序列差異0.05時(shí)的距離 Numbers on the nodes are the bootstrap values (percentages) based on 1 000 replicate. Bar, 0.05 substitutions per nucleotide position

種屬HMLNo.0No.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7No.8分離真菌/株所占比例/%Penicillium+++++++++3617.22Phoma+++++?115.26Cryptococcus+++++++4019.14Aureobasidium+++++?94.31Fusarium+++++2311.00Alternaria+++++83.83Chaetomium+++++115.26Aspergillus++++4622.01Rhizopus+++125.74Bipolaris+?20.96Myrothecium+?+20.96Rhodotorula++20.96Cunninghamella++31.44Westerdykella+?10.48Kernia++?20.96Stachybotrys+?10.48

注：“+”為樣品中分離出

表4 不同輻射污染土樣中真菌多樣性指數(shù)

2.4 輻射污染區(qū)真菌菌株耐輻射特性

對實(shí)驗(yàn)獲得部分真菌輻射耐受性進(jìn)行初步分析，結(jié)果見表5。由表5可見，輻射污染區(qū)中分離的真菌存在耐輻射特性上的多樣性，不僅屬間存在輻射耐受性差異，且同屬種間的耐受性也存在明顯差異?？傮w來說，分布于中高輻射污染區(qū)的真菌如青霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、鐮孢霉屬、交鏈孢霉屬等均具有較高的輻射耐受性。在同屬間不同物種如青霉屬的C701、P601和曲霉屬的CCK301、M403、C312在輻射耐受性上也存在明顯的差別。另外，在輻射污染區(qū)真菌同種間是否存在耐輻射特性間差異的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 部分代表菌株輻射-存活特性

續(xù)表5

注：“+”每平板存活菌落大于100個(gè)；“-”未見生長；“W”每平板存活菌落小于100個(gè)

3 討 論

前期研究中，本項(xiàng)目組已對輻射污染區(qū)分離獲得的放線菌及細(xì)菌多樣性以及短梗霉屬菌株耐輻射特性進(jìn)行了報(bào)道[24,27]。相關(guān)研究顯示，輻射污染區(qū)存在著豐富的微生物資源和物種多樣性，其中多數(shù)微生物呈現(xiàn)不同程度的耐輻射特性，并孕育著大量未知微生物屬種。同時(shí)，輻射污染對該區(qū)域微生物分布有明顯影響，隨著輻射污染程度的增高菌株的檢出率顯著下降，不同輻射區(qū)域獲得微生物耐輻射特性中存在明顯差異。一般來說，污染程度越高的土樣，高劑量輻射耐受性的微生物所占比例較高。本研究對輻射污染區(qū)真菌的分離篩選也得到類似的結(jié)果。

目前，有關(guān)輻射污染區(qū)真菌多樣性研究最為系統(tǒng)的是切爾諾貝利核電站污染區(qū)，國外學(xué)者20余年的研究中，已從該區(qū)域分離出約2 000株真菌，涉及98個(gè)屬的200余種，證明該區(qū)域存在著豐富的真菌多樣性[12-14]。其中，Penicillium、Fusarium、Chrysosporium、Scopulariopsis、Hyalodendron、Verticillium、Mucor等菌屬占分離到的耐輻射真菌的80%以上。本研究中，Penicillium和Fusarium同樣為主要優(yōu)勢菌群，除此之外，Cryptococcus、Aspergillus也為主要優(yōu)勢菌群，四者合計(jì)占總篩選株的近70%。

在群落分布上，切爾諾貝利核電站污染區(qū)研究表明[13]，Paecilomyceslilacinus和Chaetomiumaureum是土壤高劑量輻射((3.7×106)～(3.7×108)Bq/kg)的優(yōu)勢菌、Acremoniumstrictum和Arthriniumphaeospermum中劑量輻射((3.7×103)～(3.7×105)Bq/kg)的優(yōu)勢菌；Myrotheciumroridum和Metarhiziumanisopliae是低劑量輻射(<(3.7×102)Bq/kg)的指示菌株，上述菌株同時(shí)可以作為相應(yīng)輻射劑量的指示菌。本研究結(jié)果表明，該區(qū)域真菌的菌屬豐富度、多樣性及均勻度明顯受輻射污染影響，導(dǎo)致其不同污染程度下真菌種群分布和組成有明顯的差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，輻射污染區(qū)各組土樣中真菌群落存在一定的分布特征，隨著輻射污染程度逐步降低，土樣中逐次開始檢出鐮孢霉屬、交鏈孢霉屬、毛殼霉屬和曲霉屬、Kernia屬，而根霉屬、離蠕孢屬、座孢霉屬、紅酵母屬和小克銀漢霉屬僅出現(xiàn)在低污染程度土樣中。Westerdykella和葡萄孢霉屬分別僅存在于高污染土樣和中污染土樣，上述結(jié)果可能與各屬真菌的耐輻射和生長耐性有關(guān)，相關(guān)研究正在開展。

盡管本研究采用了多種真菌分離培養(yǎng)基，最大限度地分離和保存各土樣中真菌資源，但由于可培養(yǎng)方法受多種因素限制，不能全面反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，利用最新高通量測序技術(shù)的分子手段以及Biolog Eco技術(shù)的生態(tài)多樣性研究進(jìn)一步對本研究進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充非常必要，相關(guān)研究正在進(jìn)行。

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