1株產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉 燕， 任歡歡， 馬秀梅， 徐運(yùn)飛， 張 繼， 姚 健*

(1.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州 730070)

菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜，是一種菊科向日葵屬宿根性草本植物。菊芋的塊莖中含有大量的菊糖，其含量可占其干重的70%以上。菊糖，又名菊粉，是一種天然果聚糖，是由 D-果糖殘基通過β-(l-2)糖苷鍵脫水縮合而成的鏈狀多糖，末端連接一個(gè)葡萄糖分子，其聚合度一般為 2～60，平均分子質(zhì)量為5 500左右。菊芋具有易于種植、適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，有資料顯示菊芋塊莖畝產(chǎn)量可達(dá)5 000 kg，但這種資源至今尚未得到很好地利用[1]。菊粉酶(niunliaes.Ec. 3.2.1.7)，即β-2,1-D-果聚糖酶，是一種水解酶，能夠催化水解菊糖中的β-2,1-呋喃果糖苷鍵，在一定條件下，可將菊糖水解為果糖或低聚果糖[2]。按照作用方式的不同，菊粉酶被分為內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶。其中能夠隨機(jī)將菊糖鏈內(nèi)部的糖苷鍵斷開的稱為內(nèi)切型菊粉酶，水解產(chǎn)物主要為低聚果糖；外切菊粉酶則作用于菊粉鏈非還原性末端的糖苷鍵，將果糖逐一水解釋放，此種作用方式下得到的果糖是一種己酮糖，用來制備高果糖漿[3-5]。國外對酶水解菊糖生產(chǎn)果糖漿的研究始于20世紀(jì)70年代，先后開展了菌株篩選、酶學(xué)性質(zhì)以及工業(yè)生產(chǎn)、固定化技術(shù)等研究。我國菊粉酶的相關(guān)研究起步較晚，且大部分工作僅停留在菌株篩選及酶學(xué)研究階段[6]?，F(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明，利用微生物產(chǎn)菊粉酶的絲狀真菌 有17個(gè)屬40余種，酵母菌10個(gè)屬20余種，細(xì)菌12個(gè)屬10余種。國外有研究證明，霉菌的菊粉酶活性高于酵母菌，其中產(chǎn)酶活性最高的微生物是Aspergillus屬和Penicillium屬[7-8]。本研究從自然界篩選獲得1株產(chǎn)菊粉酶的真菌，經(jīng)鑒定為黑曲霉(Aspergillusniger)，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，為菊粉酶的后續(xù)研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 菊芋的根際土壤于2015年8月采自甘肅蘭州安寧區(qū)菊芋生長地，選擇3個(gè)有代表性的樣地，在每個(gè)樣地內(nèi)呈“品”字形采集根際土樣，4 ℃冰箱中保存；新鮮菊芋塊莖采自甘肅蘭州，所購原材料為紅皮菊芋，將所購材料洗凈、切片后，室溫下陰干，用粉碎機(jī)破碎至一定粒度的菊芋干粉，60 ℃烘箱干燥至恒重后備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 菊芋提取液的制備[9]：熱水浸提法制備菊芋汁，在液固比為18∶1(mL/g)，提取時(shí)間 41 min，提取溫度 86 ℃的條件下水浴浸提，過濾得濾液即為菊芋汁；分離培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：酵母膏0.5，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.3，瓊脂1.5，菊芋汁定容至200 mL，pH自然，1×105Pa滅菌15 min；活化培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：蛋白胨1.0，葡萄糖3.0，酵母膏1.0，瓊脂1.5，1×105Pa滅菌 15 min；酶源菌株初篩培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：蛋白胨1.0，酵母膏1.0，瓊脂1.5，菊芋汁定容至200 mL，pH自然，1×105Pa滅菌 15 min；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：酵母膏0.5，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.3，菊芋汁定容至200 mL，pH自然，1×105Pa滅菌15 min。

1.1.3 試劑 3,5-二硝基水楊酸(AR，上海中泰)；無水亞硫酸鈉(AR，上海硫酸廠)；酒石酸鉀鈉(AR，宜興化學(xué)試劑廠)；檸檬酸(AR，天津福晨)；磷酸氫二鈉(AR，上海中泰)；乳酸酚棉蘭染液(北京索萊寶)。其他試劑均為市售分析純或生物試劑。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選 ①菌株分離：菊芋切片，埋于所采土壤中于室溫透氣培養(yǎng)1周使其長菌[10]。取1 g帶菌土壤于9 mL無菌水中振蕩30 min混勻。將混勻的土壤懸液10倍稀釋法依次用無菌水稀釋至10-6mg/mL，取10-4、10-5、10-6mg/mL三個(gè)稀釋濃度涂布于分離培養(yǎng)基平板上。28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取形態(tài)不同的單個(gè)菌落接入活化培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d。②透明圈法初篩：將在活化培養(yǎng)基中生長良好的菌株點(diǎn)接于初篩培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～7 d，觀察并記錄菌落透明圈直徑。

1.2.2 酶活測定[11-12]①酶液酶活的測定：取1 mL粗酶液，加入4 mL 2%菊粉溶液(pH 4.5醋酸緩沖液配制)，55 ℃水浴保溫30 min，測定其還原糖的含量(以滅活的粗酶液作空白對照)；②還原糖的測定:采用 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法。取樣品0.5 mL，加入 1.5 mL pH 4.8磷酸緩沖液及3 mL DNS試劑，充分混合，沸水浴煮沸 7 min顯色，流水冷卻后用蒸餾水稀釋至 10 mL，在波長 530 nm處測吸光度；③酶活力的定義：在一定條件下，1 mL酶液每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量，稱為一個(gè)酶活單位，以U/mL表示。

酶活力E=(1 000×C×N)/(T×V)

其中，E:樣品的酶活力(U/mL)；C：由樣品的平均吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對應(yīng)的葡萄糖含量(mg/mL)；N：粗酶液的稀釋倍數(shù)；T：反應(yīng)時(shí)間(min)；V：參與反應(yīng)的粗酶液體積(mL)。

1.2.3 菌株的鑒定 通過菌落及菌體的形態(tài)觀察和基因序列分析法等對菌株A-15進(jìn)行分類鑒定[13]。提取A-15菌株的DNA后，以總DNA為模板，以18S引物序列對 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對nrDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積30 μL：模板1.0 μL, Primer 1和Primer 2各3.0 μL，Taq酶0.2 μL，dNTP mixture 2 μL，10×Buffer 3 μL，ddH2O 17.8 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s， 55℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.2.4 產(chǎn)菊粉酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化 影響A-15菌株發(fā)酵液酶活較為顯著的因素有氮源種類、氮源量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH值[14-15]。對上述因素分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以酶活為考察指標(biāo)，選取氮源量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH值為考察因素，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)[16]，探究其對發(fā)酵培養(yǎng)基中酶源菌株酶活力的影響水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選

經(jīng)過初篩挑選出生長良好的菌株23株，再經(jīng)透明圈法初篩得到透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株18株，將18株菌落挑取接入發(fā)酵培養(yǎng)基，測其酶活力，最終選出酶活力較高的10株菌株，如表1所示。其中菌株A-15的酶活性最高，為149.57 U/mL，因此選擇菌株A-15進(jìn)行鑒定和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

表1 產(chǎn)菊粉酶微生物的篩選結(jié)果

2.2 菌株的分子鑒定

2.2.1 菌落及菌體形態(tài)特征觀察結(jié)果 菌株A-15在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3～7 d，如圖1所示，菌落在PDA培養(yǎng)基上生長良好，近圓形，絨毛狀，初為白色、表面隆起，繼而轉(zhuǎn)為中間黑色邊緣白色，菌落背部為略黃色。顯微鏡觀察如圖2所示，菌絲無色透明、較粗而長，無隔膜，分生孢子淡灰色。

圖1 菌株A-15平板培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of A-15 A: 菌落正面特征; B: 菌落背面特征 A: The right side of Colony morphology; B: the reverse side of Colony morphology

圖2 菌株A-15菌體顯微形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of A-15

2.2.2 菌株的分子鑒定結(jié)果 菌株A-15的18S菌保守序列PCR擴(kuò)增電泳圖如圖 3 所示，條帶為500 bp，GenBank登錄號(hào)為KY064578。經(jīng)北京六合華大基因科技有限公司測序后，得到18S rRNA基因序列，將菌株A-15的18S rRNA序列結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析， 結(jié)果顯示此序

圖3 菌株A-15 PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoregram of A-15 1：菌株A-15條帶; 2:Marker 條帶 1： Strain A-15 band; 2: Marker band

列與曲霉屬菌株相似性較高，相似度在99%～100%。在NCBI上下載與菌株A-15所測序列有較高相似性的序列，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 4 所示，菌株A-15與黑曲霉Aspergillusniger在同一分支上，最終確定菌株A-15屬于黑曲霉(Aspergillusniger)。

圖4 菌株A-15系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the strain A-15 based on 18S rDNA sequences

2.3 菌株產(chǎn)酶的發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 菌株A-15產(chǎn)菊粉酶發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn) 氮是構(gòu)成微生物細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，本實(shí)驗(yàn)研究了不同的無機(jī)氮源和有機(jī)氮源對菌種產(chǎn)菊粉酶的影響。分別用磷酸氫二銨、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、黃豆粉、玉米粉、尿素作為該菌產(chǎn)酶的氮源，以菊芋汁為唯一碳源，發(fā)酵液用菊芋汁定容，pH自然， 28 ℃搖床培養(yǎng)7 d后測定酶活性。由圖5可以看出，菌株A-15在多種氮源上均可生長，工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)要從產(chǎn)酶和經(jīng)濟(jì)綜合考慮，但本文側(cè)重研究，故選用了有機(jī)氮源酵母膏作為最佳氮源，在此條件下產(chǎn)酶達(dá)433.50 U/mL。

圖5 不同氮源對酶活的影響Fig.5 The effect of nitrogen sources on enzyme activity

以酵母膏為氮源進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究氮源量對菌種產(chǎn)菊粉酶的影響。發(fā)酵液用菊芋汁定容，pH自然，28 ℃搖床培養(yǎng)5 d后測定酶活，結(jié)果如圖6。由圖6可以看出，隨著培養(yǎng)基中酵母膏量的增加，菌體產(chǎn)菊粉酶活呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，當(dāng)酵母膏量在0.8%時(shí)，酶活為220.35 U/mL，隨后變化趨勢趨于穩(wěn)定。

圖6 不同氮源量對酶活的影響Fig.6 The effect of quantity of nitrogen sources on enzyme activity

在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，酵母膏0.6%、28 ℃搖床培養(yǎng)不同時(shí)間，測定酶活確定最佳的培養(yǎng)時(shí)間。由圖7可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，酶活也在增加，培養(yǎng)7 d時(shí)菌株酶活最高達(dá)到346.36 U/mL，但7 d后酶活下降，原因可能是微生物對發(fā)酵過程中產(chǎn)生的糖有分解利用作用。

圖7 不同培養(yǎng)時(shí)間對酶活的影響Fig.7 The effect of time on enzyme activity

在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，酵母膏0.6%，設(shè)定搖床在不同溫度下培養(yǎng)5 d，測定酶活確定最佳培養(yǎng)溫度。由圖8可以看出，隨著培養(yǎng)溫度增加，酶活也在增加，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，菌株酶活最高達(dá)到171.09 U/mL。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對酶活的影響Fig.8 The effect of temperature on enzyme activity

pH對微生物生長和產(chǎn)酶影響很大，各種微生物都有一定的生長和產(chǎn)酶最適pH值。在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，酵母膏0.6%，28 ℃搖床培養(yǎng)5 d，測定酶活確定最佳初始pH。由圖9可以看出，隨著pH的變化，酶活先增加后減小，初始pH為6時(shí)，菌株酶活最高達(dá)到223.25 U/mL。

2.3.2 菌株A-15產(chǎn)菊粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取氮源量(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)、培養(yǎng)溫度(C)、pH值(D)4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

圖9 不同初始pH對酶活的影響Fig.9 The effect of initial pH value on enzyme activity

水平A/%B/dC/℃D10.66265.020.87286.031.08307.0

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差 R值的大小可以判斷，影響因素的排序C>A>B>D，培養(yǎng)溫度對菌株A-15產(chǎn)菊粉酶活性影響最大，其次是氮源量和培養(yǎng)時(shí)間，pH對其影響最小。綜合各因素的K值和直觀比較,得出理論最佳工藝條件為 A3B1C3D2；根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果表明 A、C影響非常顯著，P<0.01，B因素影響顯著，P<0.05，最終確定菌株 A-15的最優(yōu)發(fā)酵條件：最佳氮源為酵母膏，氮源量1.0%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.3%，菊芋汁定容至200 mL，初始 pH 6，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖瓶發(fā)酵6 d，此時(shí)菌株A-15產(chǎn)菊粉酶酶活達(dá)到934.07 U/mL。

2.3.3 最佳發(fā)酵工藝驗(yàn)證 通過正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果，所確定的最佳組合均為A3B1C3D2，即氮源量1.0%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.3%，初始 pH 6，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖瓶發(fā)酵6 d，此時(shí)菌株A-15產(chǎn)菊粉酶酶活達(dá)到934.07 U/mL。為了檢驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可行性，采用得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行菌株A-15產(chǎn)菊粉酶酶活的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下重復(fù) 3次，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，取平均值，實(shí)際酶活平均值達(dá)到947.52 U/mL，菌株A-15產(chǎn)菊粉酶酶活較高且具有重復(fù)性，并與正交試驗(yàn)7號(hào)結(jié)果接近，說明正交試驗(yàn)得到的發(fā)酵條件參數(shù)穩(wěn)定可靠，有一定的實(shí)踐參考價(jià)值。

3 討 論

本研究從菊芋根際土壤中篩選得到多株具有對菊糖分解能力的菌株，最終確定1株以菊芋中菊糖為碳源且具有較高的菊糖分解能力的菌株 A-15。經(jīng)生理生化鑒定及PCR測序后，確定菌株為黑曲霉(Aspergillusniger)。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株 A-15的發(fā)酵條件分析結(jié)果顯示，確定該黑曲霉產(chǎn)菊粉酶以菊糖為唯一碳源的最優(yōu)培養(yǎng)條件：最佳氮源為酵母膏，氮源量1.0%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.3%，菊芋汁定容至200 mL，初始 pH 6，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖瓶發(fā)酵6 d。

本研究通過生物轉(zhuǎn)化法，利用其工藝簡單、產(chǎn)率高、對環(huán)境友好等特點(diǎn)，篩選了1株產(chǎn)菊粉酶的微生物并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，研究方法和結(jié)果期望為菊粉酶制劑的生產(chǎn)及高果糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

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