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    1株芘降解酵母菌HXY-5的篩選鑒定及對芘的降解研究

    2018-03-21 00:39:12周振宇張家傲徐夢婷張陳齊
    微生物學(xué)雜志 2018年1期
    關(guān)鍵詞:無機(jī)鹽氮源碳源

    鄧 超, 周振宇, 張家傲, 徐夢婷, 張陳齊, 卜 寧

    (沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 沈陽 110034)

    多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)或雜環(huán)的有機(jī)化學(xué)污染物[1-2],廣泛分布于空氣、水體、土壤以及植物等環(huán)境中,許多PAHs具有持久性、生物積累性以及高生物毒性等特點(diǎn),可致畸、致癌和致突變,對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成巨大危害[3]。芘是高分子量PAHs的典型代表,具有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)和不易降解性,是檢測環(huán)境PAHs污染的指示物[4-5]。微生物種類多樣且代謝速率高效,是修復(fù)治理環(huán)境PAHs等有機(jī)污染物的有效途徑之一[6]。已有的研究表明,許多細(xì)菌、真菌等對PAHs都具有降解作用[7],目前已分離出的PAHs降解菌主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)[8]、紅球菌屬(Rhodococcus)[9]、氣單胞菌屬 (Aeromonas)[10]、 芽胞桿菌屬(Bacillus)[11]、伯克氏菌屬(Burkholderia)[12]和分支桿菌屬 (Mycobacterium)[13]等。相對于細(xì)菌來說,真菌降解PAHs的效率雖然通常高于細(xì)菌,在降解高環(huán)PAHs方面表現(xiàn)突出,但種類并不多,特別是有關(guān)芘降解的酵母菌方面的研究較少。本研究以分離得到的酵母菌為研究對象,探究其對芘的降解情況,為其在環(huán)境修復(fù)中的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 污染土壤樣品 供試土樣采自沈撫污灌渠三寶屯區(qū)段的污灌底泥。隨機(jī)選取5個采樣點(diǎn),用抓斗式采泥器分別采集灌渠底泥,將采集的5份土樣混勻、分裝,于無菌紙袋中4 ℃冰箱保存,備用。

    1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.02,KH2PO41.0,NH4NO31.0,F(xiàn)eCl30.05, pH 6.0;含芘母液:稱取芘溶于甲醇溶液中,搖勻使其終濃度為1 g/L;芘無機(jī)鹽培養(yǎng)基:將用0.22 μm濾膜除菌的含芘母液置于無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基;牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:牛肉膏 3,蛋白胨 10,NaCl 5,瓊脂 20,pH 6.0;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯 200,蔗糖 20,瓊脂 20,pH自然;PDB培養(yǎng)基:馬鈴薯 200,蔗糖 20,pH自然。

    1.1.3 主要試劑 芘,純度98%,Aldrich公司。

    1.2 方法

    1.2.1 污染土壤懸液的制備 將供試土壤樣品1 g加入裝有玻璃珠并含有99 mL無菌水的250 mL錐形瓶中,25 ℃、175 r/min振蕩2 h制成土壤懸液,待靜止沉淀2 h后,取上清液作為菌源。

    1.2.2 芘降解菌的富集、分離純化 將制備的菌源接入到50 mL以芘為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,芘初始質(zhì)量濃度為50 mg/L,25 ℃、175 r/min富集培養(yǎng)7 d,取第一次富集培養(yǎng)液以10%體積比轉(zhuǎn)接到新的含芘無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,進(jìn)行第二次富集培養(yǎng),如此反復(fù)4次,每轉(zhuǎn)接1次,芘質(zhì)量濃度依次調(diào)整為50、100、150、200、300 mg/L。將經(jīng)5次富集后的培養(yǎng)液稀釋并分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng),挑取不同菌落形態(tài)的單菌落,采用平板劃線法進(jìn)行分離純化。將分離純化的菌株分別轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng)后于4 ℃冰箱保存、備用。

    1.2.3 HXY-5菌株的鑒定 ①HXY-5菌株的形態(tài)學(xué)鑒定:a.細(xì)胞個體形態(tài)觀察:光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞個體形態(tài)。b.菌落形態(tài)觀察:將篩選出的HXY-5菌種接種于50 mL的PDB培養(yǎng)基中25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng),活化24 h。接種活化后的HXY-5菌株于PDA培養(yǎng)基中涂布,25 ℃倒置培養(yǎng)數(shù)天,觀察菌落形態(tài)。②HXY-5菌株的分子生物學(xué)鑒定:用真菌基因組快速提取試劑盒提取HXY-5菌株的基因組DNA。以菌株HXY-5的基因組為模板,以18S-ITS1和18S-ITS4為引物,采用20 μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行同源性序列分析與比對。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.4 HXY-5菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化 ①不同培養(yǎng)時間對菌株生長的影響:將1 mL活化后的菌液,分別加入到含有50 mL PDB培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中,25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng),間隔4 h取出一組,0~40 h共11組。每組做3個平行。②初始 pH對菌株生長的影響:將1 mL活化后的菌液,分別加入到含有50 mL PDB培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中,PDB培養(yǎng)基的初始pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)24 h,每組3個平行。③不同碳、氮源對菌株生長的影響:在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入2%的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖,以不加碳源為對照,接種0.5 mL HXY-5菌株母液,25 ℃、175 r/min培養(yǎng)24 h,測定菌體濃度,每組處理設(shè)3個重復(fù),以篩選最佳碳源;用相同方法在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2%的牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉為供試氮源,以不加氮源的培養(yǎng)基為對照,篩選最佳氮源。④正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):以最佳碳源(蔗糖和甘露醇)、最佳氮源(酵母浸粉)、MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4和FeCl3七個因素設(shè)計(jì)7因素4水平正交試驗(yàn),測定HXY-5菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

    表1 正交試驗(yàn)因素與水平

    1.2.5 HXY-5菌株對芘降解的研究 ①芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:取0.1 g芘溶于甲醇中,定容至100 mL,利用分光光度計(jì)在270~600 nm范圍內(nèi)測定芘標(biāo)準(zhǔn)溶液的最高吸收峰。取0.2 g芘溶于甲醇中,定容至250 mL,再取配制好的溶液分別稀釋2、4、8倍,配制濃度分別為0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL,在紫外分光光度計(jì)下測定其OD600值[14]。②不同芘濃度對 HXY-5菌株降解芘的影響:將1 mL活化后的菌液,分別加入到含有50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中,其初始芘濃度分別為0、50、100、200、400 mg/L,25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)15 d。每組3個平行,以空白培養(yǎng)基對為照。③不同培養(yǎng)時間對 HXY菌株降解芘的影響:將1 mL活化后的菌液,加入芘濃度為100 mg/L的含有50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中,25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)15 d,分別于第3、6、9、12和15天取出3瓶,用紫外分光光度計(jì)測定芘的濃度[8]。每組3個平行,以空白培養(yǎng)基為對照。

    芘降解計(jì)算公式如下:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HXY-5菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

    HXY-5細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可見,光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞呈圓形或橢圓形,細(xì)胞內(nèi)可見明顯的大液泡,細(xì)胞大小(1.0~4.7)μm×(0.8~4.0)μm,可出芽生殖。HXY-5菌落形態(tài)見圖2。由圖2可見,HXY-5菌株在PDA平板培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色,不透明,菌落邊緣整齊,表面光滑較粘稠,易挑取,菌落正反面顏色相同。

    圖1 HXY-5菌株的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of HXY-5 strain

    圖2 HXY-5菌落形態(tài)Fig.2 HXY-5 colonies morphology

    2.2 HXY-5菌株的分子生物學(xué)鑒定

    HXY-5菌株的18S rDNA序列經(jīng)BLAST對比,可鑒定該菌株為間型假絲酵母(Candidaintermedia),基因同源性相似度達(dá)99%。MEGA6.0構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。

    2.3 HXY-5菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2.3.1 不同培養(yǎng)時間對菌株生長的影響 由圖4可知,0~24 h內(nèi)OD600值隨培養(yǎng)時間的增加而加大,菌數(shù)呈指數(shù)增長,在24 h時達(dá)到最大;24 h以后,OD600值隨培養(yǎng)時間的增加而減少,菌數(shù)不再增加,整個群體生長進(jìn)入穩(wěn)定期、衰亡期。

    2.3.2 初始 pH對菌株生長的影響 由圖5可知,pH為3.0~6.0時,菌體數(shù)量隨著初始pH的增大而加大,菌數(shù)呈指數(shù)增長,pH為6.0時達(dá)到最大;pH 6.0~9.0時,菌體數(shù)量隨著初始pH的增大而減少。

    2.3.3 不同碳、氮源對HXY-5菌株生長的影響 由于酵母菌菌體較大,故采取光電比濁法計(jì)算該菌株的濃度。從圖6、7中數(shù)據(jù)可以看出,該菌株在以蔗糖或甘露醇為碳源時生長情況相似,酵母浸粉為氮源時生長情況最好。

    2.3.4 HXY-5菌株培養(yǎng)基優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以蔗糖、甘露醇為碳源,酵母浸粉為氮源,同時選取MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、FeCl3設(shè)計(jì)7因素4水平正交試驗(yàn),結(jié)果見表2。

    圖3 基于18S rDNA序列構(gòu)建的HXY-5系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 HXY-5 phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences

    試驗(yàn)號蔗糖/(g·L-1)甘露醇/(g·L-1)酵母浸粉/(g·L-1)MgSO4·7H2O/(g·L-1)CaCl2/(g·L-1)KH2PO4/(g·L-1)FeCl3/(g·L-1)OD60011040100.02200.7392102000.250.0210.10.55530100.500.0420.050.9294401000.250.01200.524520100.510.0100.10.9816402000.500.50.050.58971000.50.5020.11.1968040010.0110.050.54494010200.020.50.0251.133

    續(xù)表2

    根據(jù)R值大小可得各因素作用的主次順序?yàn)榈?酵母浸粉)>無機(jī)鹽(硫酸鎂)>無機(jī)鹽(氯化鈣)>碳源(蔗糖)>碳源(甘露醇)>無機(jī)鹽(磷酸二氫鉀)>無機(jī)鹽(三氯化鐵)。由上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果中的各列K值可知:碳源蔗糖的最適濃度為20 g/L,碳源甘露醇的最適濃度為20 g/L,氮源酵母浸粉的最適濃度為2 g/L,硫酸鎂的最適濃度為0.5 g/L,氯化鈣的最適濃度為0.01 g/L,磷酸二氫鉀的最適濃度為0.5 g/L,三氯化鐵的最適濃度為0.025 g/L。

    由測定結(jié)果可知,HXY-5菌株最佳培養(yǎng)基的配方(g/L):蔗糖20, 酵母浸粉2, MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.01,KH2PO40.5。

    2.4 HXY-5菌株對芘的降解作用

    2.4.1 芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線 用1.0、2.0、3.0 mg/L的芘標(biāo)準(zhǔn)溶液測定紫外吸收光譜,得到芘標(biāo)準(zhǔn)溶液在320 nm處有最高吸收峰。在波長320 nm處測得芘標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1~0.8 mg/L 的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,見圖8。

    圖4 HXY-5菌株生長曲線Fig.4 HXY-5 strain growth curve

    圖5 初始pH對HXY-5菌株生長的影響Fig.5 Effect of initial pH on the growth of HXY-5 strain

    圖6 不同碳源對HXY-5菌株生長的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on the growth of HXY-5 strain

    圖7 不同氮源對HXY-5菌株生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on the growth of HXY-5 strain

    圖8 芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of pyrene

    2.4.2 HXY-5菌株對芘的降解 HXY-5菌株在芘濃度為0~400 mg/L時的生長狀況見圖9。由圖9可知,當(dāng)芘濃度為100 mg/L時,菌株的生長情況最好,芘在第3、6、9、12、15天降解率分別為8%、20%、32%、46%和63%。

    圖9 不同芘濃度對HXY-5菌株生長的影響Fig.9 Effect of pyrene concentration on the growth of HXY-5 strain

    3 討 論

    從被石油嚴(yán)重污染的污灌渠底泥中分離得到芘降解菌HXY-5,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定其為間型假絲酵母(Candidaintermedia)。該菌株的優(yōu)化培養(yǎng)條件為蔗糖20 g,酵母浸粉2 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl20.01 g,KH2PO40.5 g,初始pH 6.0, 25 ℃培養(yǎng)24 h。在芘濃度為100 mg/L時,該菌株對芘的降解效果明顯,培養(yǎng)15 d時芘降解率可達(dá)63%。

    對HXY-5酵母菌的光學(xué)顯微鏡觀察顯示,其細(xì)胞內(nèi)具較大液泡,但其液泡內(nèi)卻具有一可見的桿狀物質(zhì),且在活體細(xì)胞內(nèi)呈較活躍的運(yùn)動狀,其對低濃度美藍(lán)的著色情況與活體酵母菌相同。該桿狀物是否與芘的降解有關(guān),有待進(jìn)一步的研究。

    利用微生物修復(fù)自然環(huán)境中PAHs污染是污染治理的關(guān)鍵,因其具有費(fèi)用低、二次污染少、修復(fù)徹底等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已成為較高效、安全的生物修復(fù)技術(shù)[15-17]。本研究從HXY-5菌株生長條件入手,探究了HXY-5菌株對芘的降解作用。研究表明,該菌株對芘的降解效果良好。對HXY-5菌株的研究,有利于進(jìn)一步探究該菌株的生物學(xué)價值,探究該菌株在石油污染環(huán)境下生存的意義,并為治理芘污染提供高效、低消耗的可能。

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