• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    里氏木霉組成型表達(dá)siRNA干擾cre1基因?qū)w維素酶表達(dá)的調(diào)控作用

    2018-03-21 00:42:14高云雨鐘路遙董冠園佘偉怡周嬌嬌劉思遠(yuǎn)田生禮
    微生物學(xué)雜志 2018年1期
    關(guān)鍵詞:里氏木霉濾紙

    高云雨, 鐘路遙, 董冠園, 佘偉怡, 周嬌嬌, 劉思遠(yuǎn), 田生禮

    (深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院 深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518052)

    里氏木霉(Trichodermareesei)是一種絲狀真菌,是重要的纖維素酶產(chǎn)生菌,廣泛用于生產(chǎn)纖維素酶[1]。里氏木霉纖維素酶是一個復(fù)雜的酶體系,由三類酶組成,包括內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1,4-D-glucanase,EG)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-g1ucanase,CBH)和 β-葡萄糖苷酶(β-g1ucosidase,BGL)。里氏木霉具有強(qiáng)大的合成和分泌蛋白的能力,其主要生產(chǎn)纖維素酶和纖維二糖水解酶 I (CBH1),表達(dá)量最高的菌株分泌的纖維素酶總量可達(dá) 100 g/L[2]。里氏木霉的基因組只有33.9 Mb,比其他絲狀真菌的要小得多[3]。而且其安全無毒易于培養(yǎng),因此,里氏木霉是重組蛋白表達(dá)和生產(chǎn)的優(yōu)良宿主,通過基因工程等手段可以高效調(diào)控里氏木霉纖維素酶基因以提高纖維素酶產(chǎn)量。里氏木霉纖維素酶基因的表達(dá)存在葡萄糖效應(yīng),當(dāng)存在快速利用碳源如葡萄糖時纖維素酶基因的表達(dá)會受抑制,這是因?yàn)槠咸烟钦T導(dǎo)了里氏木霉中碳源阻遏調(diào)控因子的表達(dá),目前公開發(fā)表的兩個阻遏蛋白是CRE1和ACE1。CRE1蛋白是Cys2-His2型轉(zhuǎn)錄因子[4],是一個廣域轉(zhuǎn)錄抑制因子,能調(diào)節(jié)纖維素酶和木聚糖酶基因的表達(dá),參與脯氨酸代謝、乙醇代謝、多糖水解等過程中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]。研究表明,敲除或抑制里氏木霉野生型菌株中的cre1基因,可顯著提高纖維素酶的表達(dá)[6-7]。但是完全敲除cre1會引起纖維素酶以外的其他基因的表達(dá)變化,所以直接敲除cre1基因不是提高纖維素酶表達(dá)的最佳方法[8],而采用RNAi對cre1基因進(jìn)行抑制的方法可以抑制cre1的表達(dá)同時對其他無關(guān)基因不產(chǎn)生影響。ACE1是一個含有3個Cys2-His2類鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白,ACE1為轉(zhuǎn)錄抑制因子,在里氏木霉中敲除基因ace1后,在纖維素和槐糖的培養(yǎng)條件下能夠提高主要的纖維素酶基因和半纖維素酶基因表達(dá)量[9]。目前,RNA干擾技術(shù)(RNA Interference, RNAi)在真菌中應(yīng)用廣泛,應(yīng)用RNAi技術(shù)對絲狀真菌如康氏木霉、里氏木霉和嗜熱毀絲霉的cre1基因的調(diào)控作用已有較多的研究發(fā)表[7,10-11]。大部分使用的是長鏈RNAi干擾技術(shù)以及誘導(dǎo)型干擾載體,對cre1使用短鏈siRNA組成型干擾載體未見報(bào)道。本文將利用Wang等[12]從里氏木霉糖代謝基因中篩選出了丙酮酸脫羧酶基因(pyruvate decarboxylase,pdc)的組成型強(qiáng)啟動子Ppdc和終止子Tpdc構(gòu)建里該氏木霉組成型表達(dá)載體。李潔璇等[13]已經(jīng)在里氏木霉中應(yīng)用該啟動子和終止子構(gòu)建了紅色熒光蛋白的siRNA干擾載體,并且成功地在里氏木霉中干擾了紅色熒光蛋白的表達(dá),但其使用組成型siRNA干擾載體仍然需要和PAN7-1共轉(zhuǎn)化以獲得真菌的潮霉素抗性。本研究通過構(gòu)建里氏木霉cre1組成型siRNA干擾載體,使用組成型啟動子和終止子同時包含潮霉素抗性基因,可高效便捷地干擾里氏木霉cer1基因的表達(dá),探討里氏木霉cre1基因沉默后,對纖維素酶基因的表達(dá)會如何變化,為里氏木霉纖維素酶基因的多靶向表達(dá)調(diào)控提供新的思路和實(shí)驗(yàn)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸埃希菌JM107由本實(shí)驗(yàn)室保存,里氏木霉QM9414購自美國模式菌種收藏中心(ATCC);質(zhì)粒pLXT帶有真菌篩選標(biāo)記潮霉素B抗性基因(Hph)和大腸埃希菌篩選標(biāo)記氨芐青霉素抗性基因(Amp),由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

    1.1.2 培養(yǎng)基 里氏木霉液體基本培養(yǎng)基:KH2PO42 g/L,(NH4)2SO41.4 g/L,尿素0.3 g/L,CaCl2·2H2O 0.4 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L,MnSO4·H2O 0.001 6 g/L,ZnSO4·7H2O 0.001 7 g/L,CoCl2·6H2O 0.003 7 g/L,蛋白胨2 g/L,吐溫-80 1 g/L,葡萄糖20 g/L。

    1.1.3 試劑 各種DNA工具酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和RNase Free H2O等均購自TaKaRa 公司;DNA膠回收純化試劑盒、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;真菌總RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;qPCR試劑盒(Bestar?SybrGreen qPCR mastermix)購自DBI Bioscience公司;溶壁酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum)購自Sigma公司;潮霉素和氨芐青霉購自Invitrogen公司;其他試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

    1.1.4 儀器 高壓自動滅菌鍋(Hirayama,HVE-50);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備總廠,SW-CJID);熒光定量PCR儀(analytik jena, qTOWER3);PCR儀(ABI,2720);冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific,Multifuge XIR);NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific,ND2000);小型離心機(jī)(Eppendorf,Minispin);pH計(jì)(Mettler-Toledo,320-S);電泳儀(Amersham Pharmacia,EPS-601);水平電泳槽(北京六一,DYCP-31D);高純水儀(力新儀器有限公司,Heal force ROP3);核酸成像系統(tǒng)(Bio-Rad,GEL DOX XR+);低溫?fù)u床(上海蘇坤,SKY-200B);低溫培養(yǎng)箱(上海愛朗,LTI-700);奧林匹斯BX51TRF System (東京,日本)。

    1.2 方法

    1.2.1cre1干擾片段的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的CRE1的Protein ID:120117,在里氏木霉基因組網(wǎng)站(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)查找到cre1基因全序列。cre1位于scaffold 2中785 322~788 378 bp,包含1個外顯子,基因長度為3 075 bp。將cre1基因的mRNA序列,輸入網(wǎng)站(Invitrogen Block-iT RNAi Designer)進(jìn)行siRNA靶序列設(shè)計(jì),選擇其中3條作用于不同位點(diǎn)的siRNA干擾片段進(jìn)行實(shí)驗(yàn),根據(jù)靶序列的位置順序命名為cre1-T4、cre1-T7和cre1-T10。再另選一條將其序列順序打亂,作為陰性對照,命名為cre1-Neg。設(shè)計(jì)合成干擾片段的序列見表1。cre1的siRNA干擾片段分別由正、反義siRNA序列構(gòu)成,中間使用9 nt(TTCAAGAGA)的穩(wěn)定loop作為莖環(huán)連接siRNA,同時在該片段兩端5′端加入一個突出dA,便于與所構(gòu)建的T載體pLXT連接。分別設(shè)計(jì)好siRNA的正義鏈和反義鏈,由Invitrogen公司合成寡核苷酸鏈。然后把待退火的DNA oligos分別用雙蒸水配制成50 μmol/L濃度,退火后獲得的雙鏈DNA長度為54 bp。

    表1 cre1的siRNA干擾片段

    1.2.2 干擾表達(dá)盒的構(gòu)建 該載體的一個特征是含有潮霉素抗性基因,只需轉(zhuǎn)化一個DNA片段即可獲得含有抗性基因的陽性轉(zhuǎn)化子,減少篩選的工作量。含潮霉素抗性基因的干擾載體pLXT(載體圖譜見圖1),通過限制性內(nèi)切酶AhdI酶切后,載體DNA雙鏈的3′端都懸掛一個胸腺嘧啶殘基dT,設(shè)計(jì)的干擾片段5′端都帶有一個dA,所以載體可直接連接干擾片段,以期實(shí)現(xiàn)對表達(dá)宿主里氏木霉高效轉(zhuǎn)化和對靶基因的干擾表達(dá)。構(gòu)建成功的含有干擾cre1基因的重組體,提取質(zhì)粒分別命名為Ppdc-T4-Tpdc、Ppdc-T7-Tpdc、Ppdc-T10-Tpdc和Ppdc-Neg-Tpdc。由于載體上有潮霉素抗性基因hph,質(zhì)粒可直接進(jìn)行里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

    圖1 載體pLXT圖譜Fig.1 A plasmid map of pLXT vector

    1.2.4 基因組DNA提取 將PCR篩選出來的轉(zhuǎn)化子接種于PDA平板上,28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后,制備適量孢子懸液接種于液體基本培養(yǎng)基中,28 ℃、250 r/min培養(yǎng)2 d。抽濾菌液,得到菌絲體,液氮研磨成粉后使用omega的E.Z.N.A? Fungal DNA Kit提取基因組DNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的濃度和質(zhì)量。

    1.2.5 RNA提取 為分析siRNA干擾片段對纖維素酶活力的影響,將重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10、T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414分別接種于10 mL基本培養(yǎng)基中,每個菌株分別做3個平行樣品,28 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h后,每種重組菌取1.5 mL菌液接種到30 mL含有0.1%微晶纖維素(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h和144 h后,利用omega的E.Z.N.A?. Fungal RNA Kit試劑盒,按照說明書的方法將菌絲使用液氮研磨成粉后提取總RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的濃度和質(zhì)量。

    1.2.6 RNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,以Random Primer為引物,將約100 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光定量 PCR 儀進(jìn)行熒光定量PCR。每個反應(yīng)20 μL體積,包括2 μL模板(1∶ 60稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物),10 μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix,8 μmol/L 正反向引物(表2)各0.5 μL和7 μL nuclease-free水。程序設(shè)置:預(yù)變性95 ℃ 30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸31 s,運(yùn)行40個循環(huán)。運(yùn)行結(jié)束后得到融解曲線,用以核對PCR產(chǎn)物的特異性。所有PCR反應(yīng)每個樣品做3個復(fù)孔。目的基因的表達(dá)量通過內(nèi)參基因sar1校正。以對照菌株的表達(dá)量為1,其他轉(zhuǎn)化子的表達(dá)量與對照樣品的比值作為數(shù)據(jù)分析。

    表2 熒光定量PCR使用的引物

    1.2.7 酶活測定 為分析siRNA干擾片段對纖維素酶活力的影響,將重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10、T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414分別接種于30 mL基本培養(yǎng)基中,每個菌株分別做3個平行樣品,28 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h后,每種重組菌取1.5 mL菌液接種到30 mL含有0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))微晶纖維素的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28 ℃、250 r/min培養(yǎng),一般來說,里氏木霉的濾紙酶活性在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中會隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加,并將在誘導(dǎo)約144 h達(dá)到最大[15]。所以在48 h和144 h分別收集酶液,將粗酶液稀釋一定倍數(shù)后測定其濾紙酶活和CMC酶活。濾紙酶活(FPA)和羧甲基纖維素(CMC)酶活測定方法參考Ghose[16]。以CMC和Whatman No.1濾紙為底物,分別加酶液0.5 mL, 50 ℃孵育30 min和1 h,加DNS沸水浴5 min。測定OD540值,每個樣品做3個重復(fù),結(jié)果取平均值。以1 h內(nèi)水解50 mg濾紙釋放出2.0 mg葡萄糖或30 min內(nèi)水解2%羧甲基纖維素釋放出0.5 mg葡萄糖的酶液稀釋倍數(shù)來計(jì)算FPU和CMCase活性單位,單位為IU/mL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 里氏木霉siRNAW干擾表達(dá)盒完整性檢測

    將重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10、T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414分別提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定,使用引物1:5′-CCTGCAAGTCTCCATCACAAG-3′,引物2:5′-TTCATAGTCCCATTGTCAGCA-3′,結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示在1 000 bp處有明顯條帶,該條帶的大小與siRNA干擾表達(dá)盒的大小基本一致,進(jìn)一步對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行測序分析,表明DNA序列與siRNA干擾表達(dá)盒的序列一致,進(jìn)一步證明了干擾表達(dá)盒成功整合到里氏木霉QM9414基因組中。

    圖2 PCR鑒定里氏木霉基因組中的 siRNA干擾表達(dá)盒Fig.2 PCR amplified siRNA disruption cassettes from recombinant strains M:Takara DL 2 000 DNA Marker;1~4:分別從重組菌T. reesei-cre1-T4、T. reesei-cre1-T7、T. reesei-cre1-T10和T. reesei-cre1-Neg的基因組中擴(kuò)增出來的siRNA干擾表達(dá)盒 M: Takara DL 2 000 DNA Marker;1-4:The PCR amplified siRNA disruption cassettes from recombinant strains T.reesei-cre1-T4,T.reesei-cre1-T7,T.reesei-cre1-T10 and T.reesei-cre1-Neg

    2.2 干擾重組菌的纖維素酶酶活的測定

    濾紙酶活代表的是纖維素酶三種酶組分,即內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶協(xié)同作用后的總酶活,是菌株整個纖維素酶系酶活力水平的綜合體現(xiàn)。重組菌在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中48 h和144 h的濾紙酶活如圖3所示,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所有菌株在誘導(dǎo)培養(yǎng)約144 h時濾紙酶活均比48 h時高。其中,含有siRNA干擾片段的重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7和T.reesei-cre1-T10的濾紙酶活均是T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的1倍以上,而陰性對照和出發(fā)菌株的酶活力相近。

    外切葡聚糖酶對纖維素鏈具有高度的專一性,而內(nèi)切葡聚糖酶的專一性較低,所以以羥甲基纖維素為底物時測得的酶活(CMCase)主要反映內(nèi)切β-1,4-葡聚糖苷酶的活力,結(jié)果見圖 4。其中,含有siRNA干擾片段的重組菌株T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7和T.reesei-cre1-T10的CMC酶活都是出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的1.8倍以上。T.reesei-cre1-T10的CMC酶活力最高可達(dá)7.2 IU/mL。出發(fā)菌株T.reeseiQM9414和陰性對照菌株T.reesei-cre4-Neg的酶活也在144 h有明顯增長趨勢,但兩者的酶活力均低于干擾重組菌。

    圖3 重組菌在48 h和144 h時產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分泌 的濾紙酶活Fig.3 The FPA produced by recombinant strains in induction medium of 48 h and 144 h T. reesei-cre1-T4、T. reesei-cre1-T7和T. reesei-cre1-T10:cre1的siRNA干擾重組菌;T. reesei-cre1-Neg:干擾重組菌的陰性對照菌株;T. reesei QM9414:里氏木霉原菌。*P<0.05, **P<0.01,圖4~9同 T. reesei-cre1-T4, T. reesei-cre1-T7 and T. reesei-cre1-T10:The siRNA recombinant strain of cre1; T. reesei-cre1-Neg:The negative control of the recombinant strain; T. reesei QM9414:The starting strain. *P<0.05, **P<0.01,the same as figure 4-9

    圖4 重組菌在48 h和144 h時產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分泌的CMC酶活Fig.4 The CMCase produced by recombinant strains in induction medium of 48 h and 144 h

    2.3 干擾重組菌轉(zhuǎn)錄水平的cre1和ace1相對表達(dá)量分析

    對所有樣品進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng),使用qPCR Software 3.2軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參基因sar1定量值校正后,分別以出發(fā)菌株T.reeseiQM9414中cre1和ace1的表達(dá)量為1,計(jì)算出培養(yǎng)48 h和144 h的干擾重組菌中cre1和ace1的相對表達(dá)量,結(jié)果見圖5、圖6。

    圖5 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h 和144 h cre1的相對表達(dá)量Fig.5 cre1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

    圖6 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h 和144 h ace1的相對表達(dá)量Fig.6 ace1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

    結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h時,干擾重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的cre1 mRNA表達(dá)量與出發(fā)菌株T.reeseiQM9414相比,分別約為出發(fā)菌株的1.3、1.2和1.5倍。然而,在誘導(dǎo)培養(yǎng)144 h后,T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的cre1 mRNA表達(dá)量是出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的0.5、0.6和0.4倍。而含有無同源序列的陰性對照菌株T.reesei-cre1-Neg中cre1的表達(dá)量與出發(fā)菌相近,結(jié)果表明對cre1基因進(jìn)行siRNA干擾的效果明顯。ACE1 和CRE1同樣是阻遏蛋白,研究表明,ACE1是負(fù)調(diào)節(jié)因子,ace1基因的缺失會導(dǎo)致cbh1、cbh2、egl1和egl2基因的轉(zhuǎn)錄增加2~30倍,其與cre1基因的調(diào)節(jié)機(jī)制是不相關(guān)的,是相互獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)制[9]。本研究對ace1基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證,結(jié)果見圖6,結(jié)果表明對cre1的siRNA干擾沒有引起ace1的表達(dá)變化,證實(shí)了cre1的干擾表達(dá)不影響ace1的表達(dá),纖維素酶活力變化的原因不是由于ace1基因的影響。

    纖維素酶是起協(xié)同作用的多組分酶系,不僅具有內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性,還有很高活力的木聚糖酶。cbh1是纖維二糖水解酶CBH1的編碼基因,egl1是內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶EGL1的編碼基因[17]。文獻(xiàn)報(bào)道,XYR1是主要纖維素酶和半纖維素酶基因包括cbh1、cbh2、egl1、bgl1、xyn1和xyn2等轉(zhuǎn)錄所必須的激活因子[18]。作為上述基因的轉(zhuǎn)錄激活因子,研究顯示xyr1自身的轉(zhuǎn)錄受到cre1和ace1的調(diào)控[17-19]。為驗(yàn)證干擾cre1是否會有效解除對纖維素酶基因或其激活因子的抑制作用,分別使用熒光定量PCR分析干擾重組菌中纖維素酶基因cbh1、egl1和木聚糖酶激活因子XRY1的相對表達(dá)量。

    cbh1主要編碼纖維二糖水解酶CBH1。對干擾重組菌進(jìn)行熒光定量PCR分析,結(jié)果見圖7。在誘導(dǎo)48 h時,重組菌cbh1的表達(dá)量與出發(fā)菌株相差不大,但是在誘導(dǎo)144 h后分別是同時段出發(fā)菌QM9414的1.9、2.5和2.5倍。說明cre1對激活蛋白CBH1編碼基因的轉(zhuǎn)錄具有激活作用。

    egl1是內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶Egl1的編碼基因。通過熒光定量PCR手段,分析重組菌中egl1的相對表達(dá)量,結(jié)果見圖8。在誘導(dǎo)144 h時,重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10中egl1的相對表達(dá)量分別是QM9414的2.7、2.5和2.9倍。由此可知,在cre1受到有效干擾的菌株中,內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶的表達(dá)可能由于解除了抑制而高效表達(dá)。說明抑制cre1的表達(dá)不僅部分解除纖維素酶合成受葡萄糖分解代謝物阻遏作用,而且激活纖維素酶中egl1基因的轉(zhuǎn)錄。

    圖7 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h和 144 h cbh1的相對表達(dá)量Fig.7 cbh1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

    圖8 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h和 144 h egl1的相對表達(dá)量Fig.8 egl1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

    圖9 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h和 144 h xyr1的相對表達(dá)量Fig.9 Gene xyr1 relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

    xry1是木聚糖酶激活因子XRY1的編碼基因。因此通過熒光定量PCR手段,分析重組菌中xyr1的相對表達(dá)量,結(jié)果見圖9。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h時,干擾重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的xyr1表達(dá)量分別與原菌相差不大,但在誘導(dǎo)144 h后發(fā)現(xiàn),此時干擾重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的xyr1相對表達(dá)量分別是同時期T.reeseiQM9414中xyr1基因表達(dá)量的2.4、2.7和2.8倍,陰性對照菌株和T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株中xyr1表達(dá)量均變化不大。這說明xyr1基因在干擾cre1基因的轉(zhuǎn)錄后獲得高效轉(zhuǎn)錄。

    3 討 論

    里氏木霉是工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的重要菌種。由于其存在的“碳抑制效應(yīng)”,所以在碳源豐富的條件下,纖維素酶的合成受到分解代謝阻遏物的抑制[20-21]。為提高里氏木霉中纖維素酶的產(chǎn)量,需要從纖維素酶表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)入手進(jìn)行研究。至今對里氏木霉纖維素酶表達(dá)機(jī)制的研究尚不深入。本研究就里氏木霉碳阻遏抑制因子cre1對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響進(jìn)行了研究。目前使用siRNA對里氏木霉進(jìn)行干擾研究的報(bào)道較少,一些基因如果直接被敲除會引發(fā)一系列的反應(yīng)甚至致死[22],而通過RNA干擾技術(shù)則可以降低基因表達(dá)量的同時避免這些問題。本研究構(gòu)建siRNA干擾載體,使用特異性小片段連接組成型啟動子和終止子,不受誘導(dǎo)物的影響,可高效穩(wěn)定地表達(dá)干擾基因,直接合成的小片段還可以隨時更換為其他基因,為里氏木霉其他基因甚至多基因的干擾研究提供極大的便利。該載體還包含潮霉素B抗性基因,而且原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中省略了包含潮霉素B抗性基因的載體pAN7-1的提取和共轉(zhuǎn)化步驟,不僅大大減少了工作量,并可提高轉(zhuǎn)化效率。

    通過表達(dá)siRNA干擾載體,實(shí)現(xiàn)了對cre1基因的干擾抑制,而其他阻遏因子ace1的基因表達(dá)則不受影響。兩種酶活性測定的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入不同干擾片段重組菌中的濾紙酶活和CMC酶活均高于出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的酶活性水平,說明酶活性的提高與干擾cre1有關(guān),酶活性提高的原因可能是由于cre1的干擾導(dǎo)致分解代謝阻遏總體效應(yīng)的下降,從而解除了阻遏物對纖維素酶基因合成的抑制,菌株在短期內(nèi)大量分泌纖維素酶。酶活性從一定程度上證明了通過RNA干擾cre1基因,降低了cre1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控,進(jìn)一步對纖維素酶基因cbh1、egl1及木聚糖酶激活因子XYR1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示,與出發(fā)菌相比,cre1干擾重組菌中的cbh1、egl1和xyr1的表達(dá)均有明顯提高,說明干擾cre1可以解除阻遏物對部分纖維素酶基因表達(dá)的抑制,解除cre1的抑制對纖維素酶及其相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控都具有重要意義。

    本研究通過纖維素酶酶活和mRNA水平等分析,進(jìn)一步確定了沉默cre1基因可提高里氏木霉中相關(guān)纖維素酶的產(chǎn)量。從而也證實(shí)了通過組成型siRNA干擾載體可以對里氏木霉進(jìn)行方便、高效和快捷的基因調(diào)控,為進(jìn)一步對里氏木霉多靶向基因調(diào)控等提供參考。

    [1] Mach RL, Strauss J, Zeilinger S, et al. Carbon catabolite repression of xylanase I (xyn1) gene expression inTrichodermareesei[J].Molecular Microbiology,1996,21(6):1273-1281.

    [2] Zhang GT, Hartl L, Schuster A, et al. Gene targeting in a nonhomologous end joining deficientHypocreajecorinai[J]. Journal of Biotechnology, 2009, 139(2): 146-151.

    [3] Martinez D, Berka R M, Henrissat B, et al. Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungusTrichodermareesei(syn.Hypocreajecorina)[J].Nature Biotechnology, 2008, 26(5): 553-560.

    [5] Strauss J, Mach RL, Zeilinger S, et al. CRE1, the carbon catabolite repressor protein fromTrichodermareesei[J]. FEBS Letters, 1995, 376 (1-2): 103-107.

    [7] Wang SW, Liu G, Yu J, et al. RNA interference with carbon catabolite repression inTrichodermakoningiifor enhancing cellulase production[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2013, 53(2):104-109.

    [8] Portnoy T, Margeot A, Seidl-Seiboth V, et al. Differential regulation of the cellulase transcription factors XYR1, ACE2, and ACE1 in Trichoderma reesei strains producing high and low levels of cellulase[J]. Eukaryotic Cell, 2011, 10(2):262-271.

    [9] Aro N, Ilmén M, Saloheimo A, et al. ACEI ofTrichodermareeseiis a repressor of cellulase and xylanase expression[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2003, 69(1):56-65.

    [10] 王榕,宮莉,姚斌,等.利用RNAi抑制cre1基因轉(zhuǎn)錄提高里氏木霉表達(dá)纖維素酶[J].食品工業(yè)科技, 2016,11:189-194.

    [11] Yang F, Gong YF, Liu G, et al. Enhancing cellulase production in thermophilic fungusMyceliophthorathermophilaATCC42464 by RNA interference ofcre1 gene expression[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2015,25(7): 1101-1107.

    [12] Wang SW, Liu G, Wang J, et al. Enhancing cellulase production inTrichodermareeseiRUT C30 through combined manipulation of activating and repressing genes[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2013, 40(6): 633-641.

    [13] 李潔璇,劉雯莉,梁智成,等. 絲狀真菌里氏木霉中shRNA沉默紅色熒光基因[J]. 微生物學(xué)雜志,2016,36(4):7-15.

    [15] Sternberg D, Mandels GR. Regulation of the cellulolytic system inTrichodermareeseiby sophorose: induction of cellulase and repression of β-glucosidase[J]. Journal of Bacteriology, 1981, 144 (3): 1197-1199.

    [16] Ghose TK. Measurement of cellulase activities[J]. Pure and Applied Chemistry, 1987,59(2):257-268.

    [17] Aro N, Saloheimo A, Ilmén M, et al. ACEII, a novel transcriptional activator involved in regulation of cellulase and xylanase genes ofTrichodermareesei[J].Journal of Biological Chemistry, 2001, 276 (26): 24309-24314.

    [18] Stricker AR, Mach RL, de Graaff L H. Regulation of transcription of cellulases- and hemicellulases-encoding genes inAspergillusnigerandHypocreajecorina(Trichodermareesei) [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78 (2): 211-220.

    [19] Saloheimo A, Aro N, Ilmén M, et al. Isolation of theace1 gene encoding a Cys2-His2transcription factor involved in regulation of activity of the cellulase promotercbh1 ofTrichodermareesei[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(8): 5817-5825.

    [20] Portnoy T, Margeot A, Linke R, et al. The CRE1 carbon catabolite repressor of the fungusTrichodermareesei: a master regulator of carbon assimilation[J]. BioMed Central Genomics, 2011, 12(1): 1-12.

    [21] Lockington RA, Kelly JM. The WD40-repeat protein CREC interacts with and stabilizes the deubiquitinating enzyme CREB in vivo inAspergillusnidulans[J]. Molecular Microbiology, 2002,43(5):1173-1182.

    [22] Goldoni M, Azzalin G, Macino G, et al. Efficient gene silencing by expression of double stranded RNA in Neurospora crassa[J].Fungal Genet Biol, 2004, 41(11):1016-1024.

    猜你喜歡
    里氏木霉濾紙
    高硬度區(qū)間P91鋼的里氏-布氏硬度關(guān)系研究
    木霉和殺菌劑聯(lián)用對橡膠榕白絹病菌的抑制作用
    歐盟評估來自一種轉(zhuǎn)基因里氏木霉的α-淀粉酶的安全性
    淺析濾紙的勻度對濾芯過濾性能的影響
    高抗水水性丙烯酸酯乳液的合成、表征及其在工業(yè)濾紙中的應(yīng)用
    綠色木霉發(fā)酵制備雷竹筍渣膳食纖維的工藝研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:06
    淺析濾紙透氣度與初始壓差的關(guān)系
    汽車零部件(2014年2期)2014-03-11 17:46:34
    不同保存條件對里氏木霉孢子粉保質(zhì)期的影響
    菊花形濾紙折疊探討
    亚洲精品国产区一区二| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 一进一出好大好爽视频| 国产精品一区二区在线观看99| 午夜福利在线观看吧| 极品人妻少妇av视频| 91老司机精品| 老汉色∧v一级毛片| 精品视频人人做人人爽| 久久99一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 9191精品国产免费久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩欧美免费精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 成人精品一区二区免费| 男女午夜视频在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 一级,二级,三级黄色视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99九九在线精品视频| 超碰97精品在线观看| 在线永久观看黄色视频| 国产成人影院久久av| 国产激情久久老熟女| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 十八禁高潮呻吟视频| 久久久国产精品麻豆| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲精品久久午夜乱码| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲中文字幕日韩| 啦啦啦 在线观看视频| 香蕉国产在线看| 国产一区二区 视频在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 考比视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 女性被躁到高潮视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产91精品成人一区二区三区 | 91字幕亚洲| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲少妇的诱惑av| 91av网站免费观看| 欧美中文综合在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 午夜福利一区二区在线看| 电影成人av| 久久久精品94久久精品| 热re99久久精品国产66热6| 蜜桃在线观看..| 中国美女看黄片| 国产精品欧美亚洲77777| 手机成人av网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产有黄有色有爽视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美人与性动交α欧美软件| 在线观看免费视频网站a站| 69av精品久久久久久 | 亚洲久久久国产精品| 大香蕉久久成人网| 最新美女视频免费是黄的| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品一二三| 免费看十八禁软件| 制服人妻中文乱码| 午夜精品国产一区二区电影| 大香蕉久久网| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产亚洲精品一区二区www | 麻豆av在线久日| 一级毛片电影观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久天堂一区二区三区四区| 在线观看免费午夜福利视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线观看一区二区三区激情| 免费看十八禁软件| 真人做人爱边吃奶动态| 天天影视国产精品| 亚洲人成电影观看| 国产成人av激情在线播放| 不卡一级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品国产高清国产av | 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品一区二区三区av网在线观看 | 老鸭窝网址在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲,欧美精品.| 两性夫妻黄色片| 看免费av毛片| 少妇精品久久久久久久| 亚洲五月婷婷丁香| 成人精品一区二区免费| 国产不卡一卡二| a级毛片在线看网站| 欧美大码av| 麻豆乱淫一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| svipshipincom国产片| 一级黄色大片毛片| 午夜福利免费观看在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 女性被躁到高潮视频| 久久久欧美国产精品| 日本av免费视频播放| 国产成人免费无遮挡视频| 国产在线一区二区三区精| 精品国产乱码久久久久久男人| 午夜激情久久久久久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产男女超爽视频在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 中文亚洲av片在线观看爽 | 女警被强在线播放| 9热在线视频观看99| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国精品久久久久久国模美| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费看十八禁软件| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲第一av免费看| 中文欧美无线码| 国精品久久久久久国模美| 丁香六月天网| 又大又爽又粗| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲天堂av无毛| 亚洲av成人一区二区三| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产成人欧美| 国产免费福利视频在线观看| 脱女人内裤的视频| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩大码丰满熟妇| 精品高清国产在线一区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日本av免费视频播放| 9191精品国产免费久久| 亚洲第一青青草原| e午夜精品久久久久久久| 午夜激情av网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜视频精品福利| 交换朋友夫妻互换小说| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 电影成人av| 国产成人av激情在线播放| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 一区二区三区乱码不卡18| 成年动漫av网址| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 一进一出好大好爽视频| 两人在一起打扑克的视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 午夜91福利影院| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 麻豆乱淫一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 美女午夜性视频免费| 青草久久国产| 岛国在线观看网站| 黑丝袜美女国产一区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色 视频免费看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品成人在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲中文字幕日韩| 天天操日日干夜夜撸| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产日韩欧美在线精品| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲专区国产一区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| xxxhd国产人妻xxx| 欧美午夜高清在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品九九99| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 一级片免费观看大全| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久精品国产综合久久久| 一区福利在线观看| 99热国产这里只有精品6| 手机成人av网站| 美女高潮到喷水免费观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 999久久久国产精品视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产av国产精品国产| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 麻豆国产av国片精品| 9热在线视频观看99| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲情色 制服丝袜| 在线观看人妻少妇| 最黄视频免费看| 9热在线视频观看99| 色94色欧美一区二区| 国产片内射在线| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美精品一区二区大全| 国产亚洲精品一区二区www | 99久久国产精品久久久| 一区二区三区激情视频| 最近最新免费中文字幕在线| 女性被躁到高潮视频| 美女高潮到喷水免费观看| 夫妻午夜视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 日本黄色视频三级网站网址 | 午夜福利影视在线免费观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| e午夜精品久久久久久久| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲七黄色美女视频| 精品少妇久久久久久888优播| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜老司机福利片| 悠悠久久av| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产午夜精品久久久久久| 欧美国产精品一级二级三级| 搡老岳熟女国产| 欧美日韩福利视频一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久香蕉激情| 妹子高潮喷水视频| 午夜福利在线观看吧| 成人永久免费在线观看视频 | 高清欧美精品videossex| 91精品三级在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黑丝袜美女国产一区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美午夜高清在线| 午夜成年电影在线免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 999久久久精品免费观看国产| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美激情久久久久久爽电影 | 在线观看66精品国产| 久久人妻熟女aⅴ| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩欧美三级三区| 老司机福利观看| 国产在线一区二区三区精| 波多野结衣一区麻豆| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 激情视频va一区二区三区| 69av精品久久久久久 | 桃红色精品国产亚洲av| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品久久视频播放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 久久香蕉国产精品| 一级毛片女人18水好多| 色综合亚洲欧美另类图片| 老司机福利观看| 村上凉子中文字幕在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 成人国产一区最新在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品久久久久久久电影 | 黄色丝袜av网址大全| 美女免费视频网站| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 最近在线观看免费完整版| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美大码av| 国产主播在线观看一区二区| 成人鲁丝片一二三区免费| 男人舔奶头视频| 成人av在线播放网站| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日韩精品网址| 最近最新免费中文字幕在线| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲国产精品合色在线| 69av精品久久久久久| 日韩国内少妇激情av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 特级一级黄色大片| 两个人视频免费观看高清| 91九色精品人成在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 97超视频在线观看视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲,欧美精品.| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av美国av| 久久久精品大字幕| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲18禁久久av| 国产精品一区二区免费欧美| 免费高清视频大片| 丁香六月欧美| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 很黄的视频免费| 成人国产一区最新在线观看| 国产视频内射| 精华霜和精华液先用哪个| 精品久久蜜臀av无| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲国产精品久久男人天堂| 1024香蕉在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜免费观看网址| 亚洲在线观看片| www.999成人在线观看| 久久热在线av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 天堂网av新在线| 亚洲精品在线观看二区| 色视频www国产| 欧美日本亚洲视频在线播放| 性欧美人与动物交配| 欧美av亚洲av综合av国产av| 校园春色视频在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| svipshipincom国产片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 91麻豆av在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 精华霜和精华液先用哪个| 国产v大片淫在线免费观看| 五月伊人婷婷丁香| 成人鲁丝片一二三区免费| 成人三级黄色视频| 国产激情久久老熟女| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 午夜免费观看网址| 精品国内亚洲2022精品成人| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 香蕉久久夜色| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品1区2区在线观看.| 天天躁日日操中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲成av人片免费观看| 精品电影一区二区在线| 最新在线观看一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产视频内射| 少妇丰满av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美午夜高清在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 一个人免费在线观看电影 | 男人和女人高潮做爰伦理| 成人av一区二区三区在线看| 午夜激情欧美在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美午夜高清在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 舔av片在线| 亚洲无线观看免费| 色播亚洲综合网| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产乱人视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 啦啦啦免费观看视频1| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品,欧美在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲国产欧美网| 国产精品女同一区二区软件 | 午夜精品在线福利| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99久久综合精品五月天人人| 露出奶头的视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 黄色视频,在线免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 嫩草影院入口| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 在线观看66精品国产| 成人午夜高清在线视频| 看片在线看免费视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人18禁在线播放| 国产一区在线观看成人免费| 热99re8久久精品国产| 动漫黄色视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 91九色精品人成在线观看| 国产精品九九99| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲精品一区av在线观看| bbb黄色大片| 欧美三级亚洲精品| 久久久久国内视频| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美成人性av电影在线观看| 国产亚洲精品av在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产高清videossex| 最新中文字幕久久久久 | 欧美日韩国产亚洲二区| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲在线观看片| 国产高清视频在线观看网站| 欧美日本视频| 亚洲五月天丁香| 999精品在线视频| xxxwww97欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av五月六月丁香网| 最近在线观看免费完整版| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品美女久久av网站| 一本综合久久免费| 性色avwww在线观看| 亚洲 国产 在线| 国产v大片淫在线免费观看| 1024香蕉在线观看| 在线国产一区二区在线| 日本 欧美在线| 1000部很黄的大片| 性欧美人与动物交配| 亚洲激情在线av| 麻豆一二三区av精品| 成人午夜高清在线视频| av在线蜜桃| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久久久久久久久久久久| 变态另类丝袜制服| 一个人看视频在线观看www免费 | 怎么达到女性高潮| 黄频高清免费视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 色视频www国产| 色综合亚洲欧美另类图片| 看片在线看免费视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产毛片a区久久久久| tocl精华| 美女免费视频网站| 怎么达到女性高潮| 欧美成人性av电影在线观看| av在线蜜桃| 狂野欧美激情性xxxx| 精品乱码久久久久久99久播| 国产熟女xx| a在线观看视频网站| 精品人妻1区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久久久久国产a免费观看| 国产毛片a区久久久久| 麻豆国产av国片精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 性色av乱码一区二区三区2| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产97色在线日韩免费| 美女黄网站色视频| 欧美乱色亚洲激情| 久久久色成人| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 99热精品在线国产| 91久久精品国产一区二区成人 | www日本黄色视频网| 国内精品久久久久精免费| 精品免费久久久久久久清纯| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲欧美精品综合久久99| 五月玫瑰六月丁香| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲片人在线观看| 国产1区2区3区精品| 欧美黑人巨大hd| 此物有八面人人有两片| 中文字幕最新亚洲高清| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 又爽又黄无遮挡网站| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲国产精品合色在线| 操出白浆在线播放| 国产主播在线观看一区二区| 在线国产一区二区在线| 十八禁人妻一区二区| 色在线成人网| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产成人啪精品午夜网站| 综合色av麻豆| 全区人妻精品视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 深夜精品福利| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 在线观看舔阴道视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 色在线成人网| 看免费av毛片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲欧美98| 天堂动漫精品| 欧美日韩精品网址| 国产日本99.免费观看| 18禁国产床啪视频网站| 无限看片的www在线观看| 最近在线观看免费完整版| 在线观看一区二区三区| 中文字幕av在线有码专区| www.www免费av| 亚洲美女黄片视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲 国产 在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 男女之事视频高清在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| svipshipincom国产片| 国产精品av久久久久免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成人三级做爰电影| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产视频一区二区在线看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产亚洲欧美在线一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美黄色淫秽网站| 国产黄a三级三级三级人| 黄色成人免费大全| 成年免费大片在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 岛国在线观看网站| 精品无人区乱码1区二区| 深夜精品福利| 亚洲色图av天堂| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产av不卡久久| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 观看免费一级毛片| cao死你这个sao货|