戊糖乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源條件的優(yōu)化

安慧瑩， 白鳳武,2， 任劍剛*

(1.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

乳酸應(yīng)用十分廣泛，已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準為GRAS[1](大眾安全健康食品)；由于乳酸具有抗氧化、保濕、殺菌[2]等功效，也備受化妝品行業(yè)的青睞；尤其是生物可降解材料聚乳酸[3-4]的需求更是大力推動了乳酸的生產(chǎn)。近年來乳酸的需求量不斷增長，預(yù)計在2020年將超過百萬噸[5]。目前乳酸發(fā)酵還在大量使用淀粉和精制的糖類為碳源，這些原料與人類所需食品供應(yīng)鏈形成競爭且成本高昂[6]，以農(nóng)業(yè)秸稈為主的木質(zhì)纖維素為原料的生產(chǎn)已經(jīng)被提上日程。木質(zhì)纖維素經(jīng)水解可以得到大量的葡萄糖、木糖等[7]碳源，但能直接利用木糖進行代謝的微生物還比較少，因此選擇能夠利用木糖生產(chǎn)乳酸的菌株具有十分重要的意義。乳酸菌通常需要在含有豐富營養(yǎng)物成分的培養(yǎng)基中才能生長[8-9]。乳酸菌發(fā)酵常用的MRS培養(yǎng)基[10]成分非常復(fù)雜，僅氮源就有4種，而氮源又是培養(yǎng)基成本中占比最高的成分[11]，尤其更適合細菌生長的酪蛋白胨，價格甚至比其他有機氮源都高得多。簡化氮源成分，減少氮源用量，選擇廉價的氮源[12]都是改善乳酸生產(chǎn)的重要方面。玉米漿是玉米淀粉加工工業(yè)的副產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸、多肽和維生素[13]，適合于大多數(shù)微生物生長。Rivas等[14]、Liu等[15]都曾把玉米漿作為替代的有機氮源進行乳酸發(fā)酵，并得到了良好效果。本研究以實驗室前期自行篩選得到的一株能利用木糖為碳源生產(chǎn)乳酸的戊糖乳桿菌為出發(fā)菌株，通過單因素實驗比較不同氮源對戊糖乳酸桿菌的發(fā)酵影響，利用響應(yīng)面方法優(yōu)化所選有機氮源與檸檬酸氫二銨的比例，來代替原來培養(yǎng)基配方中的氮源組成，以期優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，簡化氮源種類，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種 戊糖乳桿菌(LactobacilluspentosusDLL8)，為大連理工大學(xué)生物過程工程課題組從酸菜中分離，經(jīng)誘變并保存的一株可代謝木糖的乳酸發(fā)酵菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基，g/L) 種子培養(yǎng)基：木糖20，牛肉膏10，酵母粉5，酪蛋白胨10，檸檬酸氫二銨2，磷酸氫二鉀2，乙酸鈉5，硫酸鎂 0.1，一水合硫酸錳0.05，吐溫-80 1；發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖50，牛肉膏10，酵母粉5，酪蛋白胨10，檸檬酸氫二銨2，磷酸氫二鉀2，乙酸鈉5，硫酸鎂0.1，一水合硫酸錳0.05，吐溫-80 1，碳酸鈣50。

1.1.3 主要試劑 木糖、牛肉膏、酪蛋白胨、酵母粉、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、吐溫-80、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、一水合硫酸錳、碳酸鈣均購自大連博諾生物化學(xué)試劑工廠。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將-80 ℃保存的戊糖乳桿菌接種于種子培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，將種子液以體積分數(shù)1%的接種量接到裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃靜置培養(yǎng)。

1.2.2 木糖及乳酸含量測定[16]取發(fā)酵液離心后的上清液稀釋，利用高效液相色譜分析發(fā)酵液中木糖及乳酸的含量。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 計算發(fā)酵培養(yǎng)基中所有氮源的總氮量，分別換算成單一的牛肉膏、酵母粉、酪蛋白胨、檸檬酸氫二銨和玉米漿，在其他條件不變的前提下進行發(fā)酵。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 選用單因素試驗中效果最好的有機氮源與檸檬酸氫二銨進行優(yōu)化，由于玉米漿是比較廉價的有機氮源，所以根據(jù)單一玉米漿發(fā)酵的效果，把玉米漿作為一個優(yōu)化因素并選擇合適的復(fù)合條件進行優(yōu)化。利用Expert-Design軟件進行實驗設(shè)計，以乳酸產(chǎn)量作為響應(yīng)值建立響應(yīng)面模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對乳酸發(fā)酵的影響

不同氮源的含氮量有著較大差別，乳酸菌發(fā)酵所用的MRS培養(yǎng)基中包括3種有機氮源和1種無機氮源，本研究選用這4種氮源加上廉價易得的玉米漿按照MRS培養(yǎng)基中的總氮量3.198 g/L 進行相應(yīng)比例的換算，具體氮源的含氮量[17]及單一氮源的用量見表1。

表1 不同氮源的含氮量及單一氮源的用量

用不同的氮源進行乳酸發(fā)酵，菌體對不同氮源表現(xiàn)出較高的選擇性。如圖1所示，以牛肉膏為氮源時乳酸的產(chǎn)量最高，甚至高于正常MRS培養(yǎng)基(37.58 g/L)；酵母粉為氮源的乳酸產(chǎn)量基本與MRS培養(yǎng)基一致，沒有牛肉膏高，但是對木糖的利用速率很快，在第2天木糖就幾乎消耗完全；酪蛋白胨為氮源時乳酸產(chǎn)量較低；玉米漿為氮源時代謝速率過慢，當其他氮源都已經(jīng)發(fā)酵結(jié)束，玉米漿仍在緩慢的發(fā)酵中；以檸檬酸氫二銨作為唯一氮源時，菌體無法利用單一的無機氮源，不能代謝木糖也沒有乳酸產(chǎn)生。

圖1 不同氮源條件下對木糖消耗(A)及乳酸產(chǎn)量(B)的影響Fig.1 Effect of different nitrogen source on xylose consumption (A) and lactic acid production (B)

2.2 牛肉膏與檸檬酸氫二銨復(fù)合條件的優(yōu)化

雖然單一的無機氮源無法進行乳酸生產(chǎn)，但一般復(fù)合氮源能夠為微生物提高充足營養(yǎng)，更有利于微生物生長[18]。況且檸檬酸氫二銨本身用量不多且價格不高，所以實驗中將其保留。選擇檸檬酸氫二銨與單因素實驗中效果最好的牛肉膏兩個變量，利用Design-Expert軟件采用中心組合法進行設(shè)計，每個因素取5個水平(表2)。

表2 中心組合實驗因素及編碼水平

實驗設(shè)計及結(jié)果見表3，以乳酸產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，對實驗結(jié)果進行方差分析，得到的回歸方程為Y=41.83-0.63A+0.93B-3.19AB-1.47A2-3.81B2。對該模型進行方差分析(表4)，B對乳酸產(chǎn)量有直接影響(P<0.05)，雖然A對乳酸產(chǎn)量的影響不十分明顯(P=0.089 4)，但A、B有著顯著的交互作用(P=0.000 2)，且A、B二次項上的顯著性表明二者均為乳酸發(fā)酵的限制性因素?；貧w模型在99.99%的水平上極顯著(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.142 2)，說明實驗數(shù)據(jù)與模型相符，可信度高。復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.965 2,說明96.52%乳酸產(chǎn)量的變化可以用該模型解釋。

表3 中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 響應(yīng)面模型的方差分析

回歸方程可以提供分析圖，兩個因素檸檬酸氫二銨和牛肉膏相擬合的等高線圖和響應(yīng)面圖如圖2所示。凸形的響應(yīng)面表明存在明確的最佳變量，而等高線可以推斷出因素之間的交互作用，橢圓形等高線證明因素之間存在交互作用[19]。從圖2中可以看出模型存在穩(wěn)定的極大值點，對模型進行分析，得到最高的乳酸產(chǎn)量所對應(yīng)的因素水平為檸檬酸氫二銨1.91 g/L，牛肉膏17.72 g/L，預(yù)測最大乳酸產(chǎn)量為42.21 g/L。

2.3 玉米漿、酵母粉與檸檬酸氫二銨復(fù)合條件優(yōu)化

玉米漿作為一種廉價的氮源可以降低發(fā)酵成本，但以其作為氮源時發(fā)酵速度較慢，而酵母粉對木糖的代謝速率很快，所以將它們組合以期得到更好的效果。Box-Behnken設(shè)計方法只能針對三因素以上的實驗設(shè)計，兩因素的實驗設(shè)計采用中心組合法，但Box-Behnken法設(shè)計的實驗次數(shù)較中心組合法少[20-21]，更加簡單方便，故此實驗采用Box-Behnken設(shè)計方法，各因素水平如表5所示。

實驗設(shè)計及結(jié)果見表6，以乳酸產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，對實驗結(jié)果進行方差分析，得到回歸方程：Y=41.27+2.20A-0.18B+0.39C+0.19AB+0.59AC-0.97BC-2.35A2-1.19B2-2.03C2。

圖2 檸檬酸氫二銨和牛肉膏交互作用 對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of interaction between ammonium hydrogen citrate and beef extract on lactic acid production

因素代碼編碼水平-101檸檬酸氫二銨/(g·L-1)A4812玉米漿/(g·L-1)B205080酵母粉/(g·L-1)C102030

對該模型進行方差分析，表7表明各因素對乳酸產(chǎn)量的影響極顯著(P<0.000 1)。一次項、平方項、交叉項均對響應(yīng)值有顯著影響，其中檸檬酸氫二銨和酵母粉的顯著性高于玉米漿，且檸檬酸氫二銨與玉米漿的交互作用(P=0.333 4)弱于其他二者。失擬項不顯著(P=0.079 8)，說明實驗數(shù)據(jù)與模型相符，可信度高。復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.989 9說明98.99%乳酸產(chǎn)量的變化可以用該模型解釋。

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

表7 響應(yīng)面模型的方差分析

續(xù)表7

通過回歸方程得到的等高線圖和響應(yīng)面立體分析圖見圖3、圖4、圖5。每個不同的響應(yīng)面和等高線圖都代表著不同的兩個因素之間的相互作用。橢圓的等高線表明每兩個因素間都存在交互作用，響應(yīng)面呈凸形表明存在穩(wěn)定的極大值點。對模型進行分析，得到最高的乳酸產(chǎn)量所對應(yīng)的因素水平：檸檬酸氫二銨9.95 g/L，玉米漿46.54 g/L，酵母粉21.95 g/L，預(yù)測最大乳酸產(chǎn)量為41.86 g/L。

圖3 檸檬酸氫二銨和玉米漿交互作用對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of interaction between ammonium hydrogen citrate and corn steep liquor on lactic acid production

圖4 檸檬酸氫二銨和酵母粉交互作用對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of interaction between ammonium hydrogen citrate and yeast extract on lactic acid production

圖5 玉米漿和酵母粉交互作用對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of interaction between corn steep liquor and yeast extract on lactic acid production

2.4 優(yōu)化條件下乳酸產(chǎn)量的驗證

按照優(yōu)化好的氮源組成配制培養(yǎng)基進行乳酸發(fā)酵實驗，得到的結(jié)果如圖6、圖7所示。牛肉膏和檸檬酸氫二銨的組合最終得到乳酸42.37 g/L，與預(yù)測結(jié)果基本一致，表明該組合可以用于培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化。未經(jīng)優(yōu)化的MRS培養(yǎng)基三種有機氮源總量為25 g/L，得到乳酸產(chǎn)量37.58 g/L，代謝副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)量16.47 g/L。經(jīng)過優(yōu)化后的乳酸產(chǎn)量比優(yōu)化前高12.7%，有機氮源種類及用量大大減少，只有單一有機氮源牛肉膏用量為17.71 g/L，氮源絕對質(zhì)量減少了29.16%，不僅提高了乳酸產(chǎn)量，而且簡化了操作，節(jié)約了成本。

圖6 牛肉膏和檸檬酸氫二銨為氮源時 最優(yōu)條件下的發(fā)酵曲線Fig.6 Fermentation curve of nitrogen source of beef extract and ammonium hydrogen citrate under optimum conditions

玉米漿、酵母粉和檸檬酸氫二銨的組合最終得到乳酸41.06 g/L，比預(yù)測結(jié)果低1.67%，與預(yù)測結(jié)果基本一致，表明此法用于優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源是可行的。優(yōu)化后的乳酸產(chǎn)量比MRS培養(yǎng)基37.58 g/L的乳酸產(chǎn)量提高了9.26%，且發(fā)酵速率比單一玉米漿顯著提高，解決了玉米漿代謝速率過慢的問題。雖然與上一組合相比剩余的殘?zhí)橇柯愿?，但代謝副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)量僅為7.76 g/L，比上一組合的12.92 g/L顯著降低。玉米漿的使用代替了一部分高成本的有機氮源，減少了生產(chǎn)成本，也為以后更好地利用玉米漿進行乳酸發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。 但氮源絕對總量大量增加，會增加培養(yǎng)基中的多肽、蛋白等大分子物質(zhì)，對一些常用的乳酸分離方法如吸附法、膜分離法等造成一定影響，是此種組合方法的弊端，也是以后有待改進的地方。

圖7 玉米漿、酵母粉和檸檬酸氫二銨為 氮源時最優(yōu)條件下的發(fā)酵曲線Fig.7 Fermentation curve of nitrogen source of corn steep liquor, yeast extract and ammonium hydrogen citrate under optimum conditions

3 討 論

隨著以乳酸為基質(zhì)的生物材料代替化工合成產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用，提高乳酸的產(chǎn)量日益成為研究的熱點。目前研究學(xué)者主要通過改善氮源、分子改造、優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高乳酸產(chǎn)量[22-24]。乳酸的生產(chǎn)過程中優(yōu)化培養(yǎng)條件的方法被廣泛應(yīng)用，而利用響應(yīng)面方法優(yōu)化培養(yǎng)條件是目前比較流行的一種微生物發(fā)酵優(yōu)化手段[25]。孫駿飛等[26]利用麩皮的蛋白酶水解液和纖維素酶水解液替代葡萄糖和酵母粉發(fā)酵制備D-乳酸，不僅提高乳酸產(chǎn)量，同時還降低了發(fā)酵的生產(chǎn)成本。李秀康等[27]利用響應(yīng)面優(yōu)化方法對L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基氮源和碳源為葡萄糖148 g/L、酵母膏12.4 g/L條件下L-乳酸產(chǎn)量達到134.7 g/L，比優(yōu)化前提高24.3%。

本研究通過單因素實驗比較不同氮源對戊糖乳酸桿菌的發(fā)酵影響，利用響應(yīng)面方法優(yōu)化所選有機氮源與檸檬酸氫二銨的比例，得到兩組優(yōu)化的氮源組合。牛肉膏和檸檬酸氫二銨的組合能夠使乳酸產(chǎn)量最高，達到42.37 g/L，比優(yōu)化前乳酸產(chǎn)量提高12.7%，與MRS培養(yǎng)基比較明顯減少了氮源的物質(zhì)種類，簡化了培養(yǎng)基的配方。玉米漿、酵母粉和檸檬酸氫二銨組合比牛肉膏和檸檬酸氫二銨組合乳酸產(chǎn)量略低，達到41.06 g/L，但代謝副產(chǎn)物較少。這兩個組合都在一定程度上減少了昂貴有機氮源的用量，極大地降低了乳酸生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟可行性，為以后該戊糖乳桿菌大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)提供參考。

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