復(fù)方藜芍片通過阻斷JAK2/STAT3通路抑制皮層神經(jīng)炎癥改善硝酸甘油致大鼠慢性偏頭痛＊

楊建梅，鄧海燕，李 坤，王星禹，陳 雷，李佳維，汝 蕓，顧政平，徐 穎＊＊

（1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院 上海 200031；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 上海 201203;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室 上海 201203;4.中國科學(xué)院科學(xué)出版社 北京 100864）

1 前言

慢性偏頭痛（chronicmigraine）是臨床常見的原發(fā)性頭痛，根據(jù)國際頭痛協(xié)會最新發(fā)布的國際頭痛分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ試用版（ICHD-3beta版）慢性偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)：頭痛≥15天/月，至少持續(xù)3個(gè)月，頭痛持續(xù)時(shí)間≥4小時(shí)/天，其中每月至少8次的頭痛等臨床癥狀[1]。在中國慢性偏頭痛的患病率很高[2]，其發(fā)作不僅影響患者工作效率及生活質(zhì)量，還給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前臨床上偏頭痛特異性治療西藥包括麥角類制劑和曲普坦類，預(yù)防性治療西藥包括鈣離子拮抗劑、抗癲癇藥、抗抑郁藥和5-HT受體拮抗劑等。這些藥物雖然療效顯著，但是副作用較大，不能長期服用。如長期服用麥角類和曲普坦類藥物會引起惡心、嘔吐、心悸、煩躁等癥狀[4]。中醫(yī)治療頭痛有其獨(dú)特的理論和顯著的療效，且中藥方劑毒副作用也小于西藥。復(fù)方藜芍片是由上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院研制，其主要中藥包括：白芍、葛根、白蒺藜、丹參、白菊等，具有平肝潛陽、活血化瘀、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、解痙的作用，在臨床應(yīng)用多年，能明顯緩解偏頭痛疼痛程度和減少發(fā)作次數(shù)[5-6]。既往復(fù)方藜芍片曾命名為“顱痛飲”或“顱痛片”，按照《中國藥品通用名稱命名原則》，采用處方主要藥材名稱的縮寫并結(jié)合劑型命名方法，因本品為復(fù)方制劑，“藜”是取主要藥味“白蒺藜”，“芍”是取主要藥味“白芍”，劑型為片劑，故命名為“復(fù)方藜芍片”。本研究目的在于觀察復(fù)方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層炎癥、疼痛相關(guān)蛋白及JAK2/STAT3通路的調(diào)節(jié)作用，并探討復(fù)方藜芍片改善慢性偏頭痛的藥理作用靶點(diǎn)，為其臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料

2.1 實(shí)驗(yàn)動物

60只SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠，體重200-220 g左右，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（滬）2014-0008。動物自由攝食飲水，飼養(yǎng)在室溫（21±2℃），濕度（45%-65%）和明暗交替（12 h：12 h）環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)則進(jìn)行，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：SZY 201707015）。

2.2 主要試劑和儀器

復(fù)方藜芍片（批號：1703）由上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院研制，上海百歲行藥業(yè)有限公司生成；西比靈（批號：170313373）購自西安楊森制藥有限公司；硝酸甘油注射液（批號：20161016）購自北京益民藥業(yè)有限公司；anti-iNOS鼠單克隆抗體（批號：I0117）、anti-COX-2鼠單克隆抗體（批號：J2617）、anti-CGRP鼠單克隆抗體（批號：G1916）、anti-c-Fos鼠單克隆抗體（批號：L1916）、anti-JAK2鼠單克隆抗體（批號：D1216）、anti-STAT3鼠單克隆抗體（批號：C1317）、anti-p-STAT3鼠單克隆抗體（批號：G0816）、Anti-rabbit IgG（批號：09/2017）、Anti-mouse IgG（批號：08/2017）均購自 Santa Cruz Biotechnology公司；anti-p-JAK2兔單克隆抗體（批號：10/2017）購自Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液（批號：090717170930）購自碧云天生物技術(shù)公司；BSA（批號：6531010160）購自Geenview公司；Rat IL-1β ELISA KIT（批號：201710）購自美國RD公司；ECL顯影液（批號：SD246946）購自Thermo Scientific公司；Rat TNF-α ELISA Set（批號：7192819EU）購自BD Pharmingen公司；電泳儀（美國BIO RAD，型號：BR90518）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司，型號：Tanon-2500）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek，型號：Synergy2）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 藥物備制

復(fù)方藜芍片根據(jù)藥品說明書顯示：60 kg體重的成人每日用藥8.4 g。根據(jù)“人體/動物體表面積計(jì)算法”換算，分別設(shè)低劑量（420mg·kg-1）、中劑量（840mg·kg-1），和高劑量（1680 mg·kg-1）。相同方法計(jì)算大鼠西比靈用量為1 mg·kg-1。復(fù)方藜芍片和西比靈分別用生理鹽水溶解，配置好后冷藏于4℃冰箱備用。

3.2 動物分組及給藥治療

60只SD雄性大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常組（Control,n=10）、偏頭痛組（Migraine,n=10）、復(fù)方藜芍片低劑量組（FFLSP-L，n=10）、中劑量組（FFLSPM,n=10）、高劑量組（FFLSP-H,n=10）和西比靈組（FH,n=10）。FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H組大鼠分別給予不同劑量的復(fù)方藜芍片溶液灌胃；FH組給予西比靈溶液灌胃；Control組、Migraine組分別給予等量生理鹽水灌胃。各組灌胃均為每日1次，連續(xù)30天，灌胃容積均為0.1 mL·kg-1。

3.3 模型制備及標(biāo)本處理

慢性偏頭痛模型制作依據(jù)文獻(xiàn)[7]，采用大鼠頸部皮下注射硝酸甘油溶液（10 mg·kg-1），每3日1次，共5次，造模時(shí)間為分別在各組大鼠給藥治療后的第18、21、24、27、30天，Migraine、FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSPH組均需制備偏頭痛模型，Control組大鼠頸部皮下注射等體積的生理鹽水。造模成功的標(biāo)志為注射硝酸甘油后的5 min左右，大鼠開始出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數(shù)增多、煩躁不安等現(xiàn)象。最后一次造模24 h后處死大鼠，斷頭取腦后于冰上分離皮層并置于凍存管中，在液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 Western blot檢測皮層蛋白表達(dá)

圖1 復(fù)方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層c-Fos、CGRP蛋白表達(dá)的影響

將皮層從凍存管中取出，加入裂解液（RIPA、PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，按100∶1∶1∶1的比例混合）于組織研磨儀中勻漿，4℃低溫離心后取上清進(jìn)行蛋白定量，將樣品蛋白含量定為40 μg?μL-1進(jìn)行上樣。具體步驟如下：①配置10%SDS-PAGE凝膠（濃縮膠：超純水2.1 mL；30%丙烯酰胺0.5 mL；pH 8.8 0.38 mL；10%SDS 0.03 mL；10%Aps 0.03 mL；TEMED 5 μL。分離膠：超純水4.1mL；30%丙烯酰胺3.3mL；PH8.82.5mL；10%SDS 0.1 mL；10%Aps 0.1 mL；TEMED 10 μL）。②每孔上樣10 μL。③60V電壓電泳30 min，再80 V電壓電泳30 min，110 V電壓電泳直至結(jié)束。④110 V電壓，4℃，轉(zhuǎn)膜120 min。⑤5%脫脂奶粉或者5%BSA室溫封閉1 h。⑥4℃孵育一抗過夜（分別孵育iNOS、COX-2、CGRP、c-Fos、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 抗體）。⑦TBST洗膜（10 min×3次，室溫）。室溫孵育二抗1 h。再次TBST洗膜（10 min×3次，室溫）后均勻涂抹ECL顯色劑進(jìn)行曝光。

3.5 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測皮層IL-1β、TNF-α含量

將皮層從凍存管中取出，加入200 mL 9%NaCl于組織研磨儀中勻漿，4℃低溫離心后取上清進(jìn)行蛋白定量。①1∶250稀釋一抗后，100 μL/孔上樣，4℃靜置過夜（≥16 h）。②洗板，300 μL/孔×5次。③室溫封閉1 h，洗板。④100 μL/孔的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加樣后，室溫靜置2 h，洗板。⑤1‥250稀釋detection antibody后，100 μL/孔上樣，室溫靜置1 h，洗板。⑥1∶250稀釋Enzyme Reagent，100 μL/孔上樣，室溫靜置 30 min，洗板。⑦100 μL/孔底物緩沖液，室溫避光反應(yīng)30 min。100 μL/孔終止液終止反應(yīng)后，450 nm波長測OD值。

3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件分析。多組間相比較采用One-way ANOVA分析方法，多重比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 復(fù)方藜芍片降低慢性偏頭痛大鼠皮層c-Fos、CGRP的蛋白表達(dá)

Western blot檢測各組大鼠皮層疼痛相關(guān)蛋白c-Fos和CGRP蛋白表達(dá)。與Control組比較，Migraine組大鼠皮層c-Fos和CGRP蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.01）。與Migraine組比較，F(xiàn)FLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組c-Fos蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜ 0.01）；與Migraine組比較，F(xiàn)FLSP-M、FFLSP-H、FH各組CGRP蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.01）；FFLSP-L組CGRP蛋白表達(dá)與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

4.2 復(fù)方藜芍片降低慢性偏頭痛大鼠皮層iNOS、COX-2的蛋白表達(dá)

Western blot檢測大鼠皮層炎癥因子iNOS、COX-2蛋白表達(dá)。與Control組比較，Migraine組大鼠皮層iNOS和COX-2蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.01）。與Migraine組比較，F(xiàn)FLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組iNOS和COX-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.01）（圖2）。

4.3 復(fù)方藜芍片減少慢性偏頭痛大鼠皮層IL-1β、TNF-α的水平

ELISA檢測各組大鼠皮層IL-1β和TNF-α的水平，與Control組比較，Migraine組大鼠皮層IL-1β和TNF-α水平明顯增高（P＜ 0.05）。與Migraine組比較，F(xiàn)FLSP-M、FFLSP-H、FH各組IL-1β水平均明顯降低（P ＜ 0.01），F(xiàn)FLSP-L組IL-1β水平無明顯差異；與Migraine組比較，F(xiàn)FLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05;P＜0.01）（圖3）。

圖2 復(fù)方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的影響

圖3 復(fù)方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層IL-1β、TNF-α含量的影響

圖4 復(fù)方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層JAK2/STAT3信號通路的影響

4.4 復(fù)方藜芍片阻斷偏頭痛大鼠皮層JAK2/STAT3信號通路

Western blot檢測各組大鼠皮層p-STAT3和p-JAK2蛋白的磷酸化水平。與Contral組比較，Migraine組大鼠皮層p-STAT3和p-JAK2蛋白表達(dá)水平明顯增高（P ＜ 0.01）。與Migraine組比較，F(xiàn)FLSP-L、FFLSPM、FFLSP-H、FH各組p-STAT3和p-JAK2蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P ＜ 0.01）（圖4）。

5 討論

偏頭痛是臨床常見的原發(fā)性頭痛，表現(xiàn)為發(fā)作性、搏動樣頭痛，常伴有惡心、嘔吐、畏光或畏聲，安靜環(huán)境或休息后可緩解[8]。偏頭痛病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制，主要存在以下幾種學(xué)說：神經(jīng)源學(xué)說、血管源學(xué)說、三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說、皮層擴(kuò)散性抑制學(xué)說、腦的興奮性假說及免疫因素等。其中較為公認(rèn)的學(xué)說是三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說和皮層擴(kuò)散性抑制學(xué)說。皮下或腹腔注射硝酸甘油溶液（10 mg·kg-1）已成為公認(rèn)的偏頭痛模型，硝酸甘油作為脂溶性分子可通過血腦屏障后產(chǎn)生大量的NO，NO具有強(qiáng)烈的擴(kuò)張腦血管作用，并具有神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，從而誘發(fā)偏頭痛。我們采用大鼠頸部皮下注射間斷多次注射硝酸甘油制作慢性偏頭痛模型，類似臨床的慢性偏頭痛癥狀[7]。

復(fù)方藜芍片是徐匯區(qū)中心醫(yī)院經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐中總結(jié)后擬出的治療偏頭痛（尤其是肝陽上亢型）的方藥，經(jīng)過大量的臨床驗(yàn)證證明復(fù)方藜芍片在縮短頭痛時(shí)間、預(yù)防頭痛發(fā)作方面優(yōu)于其他中藥及西藥，而且無明顯毒副作用。復(fù)方藜芍片具有平肝潛陽、活血通絡(luò)之功。其組成包括：白芍、葛根、白蒺藜、生丹參、白菊花、鉤藤、珍珠母、蔓荊子、白芷、薄荷。方中白芍、葛根為君藥，白芍柔肝止痛、平肝潛陽；葛根解肌退熱，活血化淤，升引諸藥上達(dá)頭目。白蒺藜、丹參、珍珠母、鉤藤、白菊花為臣藥。白蒺藜平肝潛陽、舒肝解郁；丹參活血祛瘀；珍珠平肝潛陽，安神明目；鉤藤清肝熱，平熄肝風(fēng)，有解痙之功；菊花疏散風(fēng)熱，清熱解毒，平肝潛陽。佐以蔓荊子、白芷，蔓荊子散風(fēng)熱，清頭目；白芷祛風(fēng)散寒，通竅止痛。使藥薄荷疏風(fēng)清熱，清利頭目，善治頭風(fēng)頭痛。諸藥配合，具平肝潛陽、活血通絡(luò)之功，有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙、擴(kuò)張血管之效。有研究發(fā)現(xiàn)葛根主要成分葛根總黃酮能夠明顯改善利血平所致偏頭痛癥狀[9]。其他研究發(fā)現(xiàn)白芍能夠通過降低IL-1β、TNF-α，發(fā)揮抗炎作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)菊花可以抑制環(huán)氧酶代謝途徑，減少PGE2炎癥介質(zhì)的釋放達(dá)到抗炎的目的[11]。這些研究都為復(fù)方藜芍片治療偏頭痛提供了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

c-Fos原癌基因（cellular oncogene fos，c-Fos）屬于即刻早基因。生理狀態(tài)下，c-fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)很低，不易檢測。當(dāng)受到刺激的時(shí)候，在數(shù)分鐘內(nèi)會高水平表達(dá)，參與疼痛的控制[12]。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptid，CGRP）是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的血管舒張肽，CGRP在三叉神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，三叉神經(jīng)系統(tǒng)興奮時(shí)會釋放大量CGRP，進(jìn)而活化CGRP受體，擴(kuò)張顱內(nèi)血管，特別是硬腦膜血管，引起神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生，產(chǎn)生頭痛[13]。Deepak Kumar Bhatt等[14]通過在大鼠側(cè)腦室注射CGRP以觀察c-fos活化情況，發(fā)現(xiàn)在CGRP注射后的2 h，大鼠腦干外層，即神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和軟腦膜中的c-fos表達(dá)增加，表明CGRP的高表達(dá)可能會激活c-fos基因。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌等細(xì)胞中表達(dá)，IFN-γ、IL-6、NK-KB等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，催化產(chǎn)生NO引起炎癥和疼痛反應(yīng)。環(huán)氧合酶2（cycloxygenase 2，COX 2）是炎癥過程中重要的誘導(dǎo)酶，可以被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)，能夠促進(jìn)前列腺素的生成[15]。JAK2/STAT3信號通路是多種細(xì)胞因子和生長因子在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的途徑，在生長發(fā)育過程中必不可少，但JAK2/STAT3通路的激活在炎癥性疾病過程中也起著重要的調(diào)控作用。JAK2/STAT3的基本傳遞過程如下：細(xì)胞因子與受體結(jié)合后形成同型二聚體復(fù)合物，這種受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成使得JAK2家族激酶相互接近發(fā)生反式磷酸化，并隨后活化受體上的特定酪氨酸殘基作為STAT3的?？奎c(diǎn)，活化后的STAT3在胞質(zhì)中形成同型二聚體，隨后移位至細(xì)胞核促進(jìn)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[16,17]。

本次研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠皮層的促炎因子iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α，以及疼痛相關(guān)蛋白CGRP、c-Fos明顯高于正常組，這與既往研究相一致，證明硝酸甘油一方面能刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的IL-1β、TNF-α，誘導(dǎo)iNOS、COX-2表達(dá)引起炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)頭痛的發(fā)生；另一方面，硝酸甘油能夠直接刺激皮層CGRP高表達(dá)，CGRP作為一種強(qiáng)大的內(nèi)源性血管神經(jīng)肽，能夠刺激血管擴(kuò)張，使頭痛產(chǎn)生。與模型組比較，復(fù)方藜芍片中、高劑量能明顯減少iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α、CGRP、c-Fos、p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)。推測復(fù)方藜芍片的治療作用可能從以下兩個(gè)方面減輕頭痛：①復(fù)方藜芍片能通過抑制JAK2/STAT3信號通路，減少IL-1β、TNF-α等炎癥因子，降低iNOS、COX-2的表達(dá)，減輕由炎癥所致的頭痛。②復(fù)方藜芍片可以降低CGRP、c-Fos，抑制血管擴(kuò)張，直接或間接減輕疼痛反應(yīng)。綜上所述，復(fù)方藜芍片中、高劑量能夠明顯減緩偏頭痛，其機(jī)制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療慢性偏頭痛的目的。