口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫增強(qiáng)牛呼吸道黏膜免疫應(yīng)答

李乙江，朱明旺，普仕華，郭云然，楊永幸，李世鈺，創(chuàng)向輝，楊 倩

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095； 2. 云南德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，德宏 678400；3. 云南省獸醫(yī)生物制品研制中心，保山 678000； 4. 云南德宏風(fēng)平鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，德宏 678400；5. 云南隴川縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，德宏 678700； 6. 云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明 650500)

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染偶蹄動(dòng)物引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。口蹄疫已給我國(guó)乃至全世界養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FMDV主要通過呼吸道傳播[2-3]。目前，我國(guó)預(yù)防FMD以皮下或肌肉注射口蹄疫滅活疫苗為主，但這種傳統(tǒng)的免疫方式只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫，對(duì)FMDV的入侵部位(黏膜)不產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。FMDV主要通過氣溶膠的形式經(jīng)呼吸道和消化道等黏膜途徑感染動(dòng)物。如果切斷FMDV進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的途徑，這將能更有效地預(yù)防FMDV的感染和傳播。

呼吸道黏膜下分布有較多的淋巴組織[4]。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)黃牛呼吸道分布有IgA分泌細(xì)胞，其中鼻腔黏膜中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量最多，IgA在抵抗病毒的入侵中發(fā)揮重要的作用[5]。IgA分泌細(xì)胞的數(shù)量可代表鼻腔局部黏膜免疫力的水平。鼻腔免疫可誘導(dǎo)鼻腔黏膜產(chǎn)生較多的IgA分泌細(xì)胞以及其他重要的免疫活性細(xì)胞。此外，鼻腔免疫具有抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)閾值低、抗原用量少、不引起免疫耐受等諸多優(yōu)點(diǎn)，在其他小動(dòng)物上已獲得很好的免疫效果[6-8]。然而作為我國(guó)一類動(dòng)物疫病的FMD只能應(yīng)用滅活病毒進(jìn)行免疫接種，滅活病毒不能誘導(dǎo)鼻腔黏膜免疫。

最近研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis, B.s)是一種良好的免疫增強(qiáng)劑[9]。其有效成分表面活性素(surfactin)具有更好的免疫效果[10]?？莶菅堪麠U菌主要通過誘導(dǎo)黏膜下樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)成熟，釋放細(xì)胞因子，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[11-12]。因而，本研究應(yīng)用一株高表達(dá)表面活性素的枯草芽胞桿菌(B.subtilisOKB105)配合O型口蹄疫滅活病毒噴鼻氣霧免疫牛，檢測(cè)其牛呼吸道局部IgA分泌細(xì)胞的數(shù)量、鼻液、唾液中口蹄疫特異性SIgA水平、細(xì)胞因子IL-12和TNF-α水平以及血清中O型口蹄疫病毒特異性抗體的變化，探討該方法對(duì)牛呼吸道黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答的影響。為口蹄疫全滅活病毒鼻腔免疫提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

通過臨床檢查與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查相結(jié)合，運(yùn)用ELISA方法篩選出25頭O型口蹄疫抗體陰性7歲健康婆羅門牛(由云南德宏州盈瑞肉牛養(yǎng)殖有限公司及芒市天龍街屠宰場(chǎng)提供)。

1.2 試驗(yàn)材料

滅活的牛O型口蹄疫病毒(OS/99株)(由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供)，高表達(dá)表面活性素的枯草芽胞桿菌(B.subtilisOKB105)(本實(shí)驗(yàn)室保存)?？谔阋逴型滅活油乳苗(購(gòu)于云南保山疫苗廠，批號(hào)：201503001)。兔抗牛IgA(購(gòu)于Abcam公司，批號(hào)：ab112755)，SABC試劑盒(購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：10K10A)，山羊血清(實(shí)驗(yàn)室自制)，Triton[購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司]，切片石蠟(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，RIPA裂解液(購(gòu)于天根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：20160317)，口蹄疫病毒O型抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(韓國(guó)金諾，購(gòu)于云南省牧康動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，批號(hào)：107H5436)，牛O型口蹄疫病毒抗體SIgA ELISA試劑盒(購(gòu)于上海勁馬生物科技有限公司，批號(hào)：201508)，牛IL-6、IL-12 ELISA試劑盒(購(gòu)于上海勁馬生物科技有限公司，批號(hào)：201508)、牛TNF-α ELISA試劑盒(購(gòu)于上海勁馬生物科技有限公司，批號(hào)：201508)。壓電式霧化器(購(gòu)于捷銳企業(yè)有限公司，型號(hào)：GUN-200型)，球磨震動(dòng)儀(購(gòu)于天隆科技有限公司，型號(hào)：GT200)。

1.3 滅活的牛O型口蹄疫病毒準(zhǔn)備

1.4 動(dòng)物分組與處理

設(shè)O型口蹄疫滅活病毒配合免疫增強(qiáng)劑試驗(yàn)組、免疫增強(qiáng)劑對(duì)照組、O型口蹄疫滅活病毒對(duì)照組、常規(guī)疫苗對(duì)照組、空白對(duì)照組5個(gè)試驗(yàn)組。將1×107O型口蹄疫滅活病毒與B.subtilisOKB105菌液按1∶1體積比例直接混合使用，使用劑量為10 mL·頭-1，通過呼吸道黏膜氣霧噴鼻免疫給藥(氣霧儀所設(shè)定的氣霧顆粒直徑≤2 μm)，每隔3 d噴鼻1次，連續(xù)2次。常規(guī)疫苗組按疫苗使用說明書使用，即肌肉注射1次，3 mL·頭-1?？谔阋邷缁畈《緦?duì)照組與免疫增強(qiáng)劑對(duì)照組，免疫程序方法與試驗(yàn)組一樣，其中口蹄疫滅活病毒含量為1×107，5 mL·頭-1，免疫增強(qiáng)劑枯草芽胞桿菌含量為5 mL·頭-1?？瞻讓?duì)照組未做任何處理。

1.5 樣品采集與處理

為了觀察抗體隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，分別在免疫后第3、7、14、21、28、35天清晨牛進(jìn)食前，使用一次性注射器分別吸取牛鼻液和唾液，保存于-20 ℃，通過ELISA方法檢測(cè)口蹄疫特異性SIgA，同時(shí)使用真空管采血器從牛的頸靜脈采集血樣，分離血清，保存于-20 ℃。

結(jié)合屠宰場(chǎng)條件于免疫3個(gè)月后屠宰實(shí)驗(yàn)用牛，頸部放血處死后，將頭部分解出來，用電鋸鋸開牛鼻部橫斷面，取鼻腔黏膜；剖開腹腔取氣管(距離會(huì)厭部10 cm)、肺內(nèi)支氣管(右肺尖段支氣管2 cm處部位)、肺(含有細(xì)支氣管)。用于免疫組化的樣品取后立即置于4%多聚甲醛液中固定48 h，而后常規(guī)制備石蠟切片(8 μm)；用于ELISA檢測(cè)組織中細(xì)胞因子的樣品，取后立即置于液氮中。

1.6 免疫組織化學(xué)方法顯示IgA分泌細(xì)胞

石蠟切片(8 μm)常規(guī)脫蠟至水，PBS(pH7.6)洗滌10 min；0.8%H2O2處理30 min，0.4%Triton-PBS(pH 7.4) 洗滌3次，5 min·次-1；10%山羊血清室溫封閉20 min, 棄山羊血清后直接加1∶100稀釋的兔抗牛IgA，4 ℃過夜; 洗滌同上，加入適當(dāng)稀釋的 SABC(1∶100)37 ℃孵育60 min; 棄SPA-HRP后入PBS(pH 7.6)中洗滌1次,Tris-HCl 緩沖液(0.05 mol·mL-1,pH 7.4)洗滌3次，5 min·次-1；適量的DAB-H2O2顯色，晾干，透明，封固。陰性對(duì)照組用PBS 代替兔抗牛IgA，此后步驟同上。

用Olympus BH-2 顯微鏡觀察組織切片并拍照。每個(gè)組織樣品隨機(jī)取5張切片，每張切片隨機(jī)選10個(gè)視野，利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量單位視野內(nèi)IgA分泌細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 ELISA檢測(cè)鼻液和唾液中口蹄疫特異性SIgA

將鼻液和唾液樣品取出融化，加于牛O型口蹄疫病毒抗體SIgA ELISA試劑盒提供的抗原包被板中，50 μL·孔-1，同時(shí)分別設(shè)置空白孔(空白對(duì)照空不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μL·孔-1，待測(cè)樣品孔加樣50 μL·孔-1。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，拍干，每孔加滿洗液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。溫育、洗滌同前。每孔加入顯示劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)黃色)。以空白孔調(diào)零，在加終止液后15 min以內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的OD值。

1.8 ELISA檢測(cè)血清中O型口蹄疫病毒抗體

將血清取出待融化后進(jìn)行ELISA操作，待檢樣品孔、陰性對(duì)照孔、陽性對(duì)照孔加入樣品稀釋液80 μL，然后再加入樣品、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各20 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，室溫孵育60 min；洗板，棄洗液，拍干，如此重復(fù)3次；每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體，室溫孵育60 min；洗板，棄洗液，拍干，如此重復(fù)3次；每孔加入100 μL TMB底物，室溫暗處放置15 min；每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)黃色)。以空白孔調(diào)零，在加終止液后15 min以內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的OD值。

2013年，陜西水利工作深入貫徹落實(shí)黨的十八大精神和科學(xué)發(fā)展觀，圍繞服務(wù)“三個(gè)陜西”建設(shè)，遵循群眾意愿，以江河之治為核心、以水資源管理為根本、以體制機(jī)制建設(shè)為保障，優(yōu)化部署水資源配置重點(diǎn)工程，奮力實(shí)施項(xiàng)目帶動(dòng)戰(zhàn)略，統(tǒng)籌推進(jìn)各項(xiàng)工作扎實(shí)有效開展，年度完成水利投資224億元，較上年增長(zhǎng)19%。

1.9 ELISA方法檢測(cè)組織中細(xì)胞因子

將鼻黏膜、氣管、肺、肺內(nèi)支氣管組織樣品從液氮中取出，用電子天平各稱取2 mg，置于5 mL離心管中，加入500 μL生理鹽水和200 μL組織蛋白裂解液，置于球磨震動(dòng)儀中批量研磨樣品后，室溫放置10 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，用ELISA檢測(cè)組織中的IL-6、IL-12、TNF-α，其操作步驟同“1.7”中操作。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

的影響均用單因素方差分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鼻黏膜中IgA分泌細(xì)胞的變化

通過對(duì)牛鼻黏膜的IgA免疫組化染色，在牛鼻黏膜中IgA分泌細(xì)胞呈棕色圓形或橢圓形，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)為陽性反應(yīng)，細(xì)胞核為陰性反應(yīng)。口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌氣霧噴鼻免疫后IgA分泌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，尤其在鼻黏膜基底膜下方較為明顯(圖1)。單獨(dú)使用口蹄疫滅活病毒、單獨(dú)使用枯草芽胞桿菌、單獨(dú)使用常規(guī)口蹄疫滅活苗和空白對(duì)照組，均未觀察到牛鼻腔黏膜中IgA分泌細(xì)胞明顯增多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單位視野中，口蹄疫滅活病毒噴鼻免疫后IgA分泌細(xì)胞數(shù)量呈極顯著增加(P<0.01)；其他對(duì)照組之間無明顯差異(P>0.05)(圖2)。

A.口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌組；B.常規(guī)疫苗組；C.枯草芽胞桿菌組；D.滅活病毒組；E.空白對(duì)照組；★.黏膜上皮；☆.固有層；.IgA分泌細(xì)胞A. Intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis; B. Vaccine control group; C. Bacillus subtilis control group; D. Inactivated virus control group; E. Negative control group; ★.Mucosal epithelium; ☆.Lamina propria; .IgA secreting cells圖1 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后對(duì)牛鼻黏膜中IgA分泌細(xì)胞的影響(400×)Fig.1 Effect of the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis on IgA secreting cells in cattle nasal mucosa(400×)

2.2 肺內(nèi)支氣管中IgA分泌細(xì)胞的變化

通過對(duì)牛肺內(nèi)支氣管IgA免疫組化染色，從圖3中可見，牛肺內(nèi)支氣管黏膜IgA分泌細(xì)胞呈棕色圓形或橢圓形，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)為陽性反應(yīng)，細(xì)胞核為陰性反應(yīng)?？谔阋邷缁畈《九c枯草芽胞桿菌聯(lián)合使用氣霧噴鼻免疫牛后，肺內(nèi)支氣管黏膜中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，尤其在肺內(nèi)支氣管黏膜基底層下

方較為明顯，并且在黏膜上皮中存在明顯的IgA分泌細(xì)胞(圖3)，可清晰地看到IgA分泌到黏膜表面的生理過程。單獨(dú)使用口蹄疫滅活病毒、單獨(dú)使用枯草芽胞桿菌、單獨(dú)使用常規(guī)口蹄疫滅活苗和空白對(duì)照組，均未觀察到牛肺內(nèi)支氣管黏膜中IgA分泌細(xì)胞明顯增多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單位視野中，口蹄疫滅活病毒與枯草芽胞桿菌聯(lián)合使用氣霧噴鼻免疫后IgA分泌細(xì)胞在肺內(nèi)支氣管黏膜中分布數(shù)量極顯著高于其他試驗(yàn)對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)對(duì)照組之間無明顯差異(P>0.05) (圖4)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different superscript lowercase and capital letters respectively show significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), the same letters show no significant difference (P>0.05)圖2 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后牛鼻黏膜中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.2 Changes of IgA secreting cells in cattle nasal mucosa after the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis

2.3 鼻液和唾液中O型口蹄疫病毒抗體SIgA的變化

免疫后第3、7、14、21、28、35天采集牛鼻液和唾液，經(jīng)牛O型口蹄疫病毒特異性SIgAELISA檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌氣霧噴鼻免疫免疫牛后，在第3天分別于鼻液和唾液中檢測(cè)到特異性SIgA，且維持直至試驗(yàn)結(jié)束。其中，口蹄疫滅活病毒與枯草芽胞桿菌配合免疫后，在第3、7、14天檢測(cè)到牛鼻液中特異性SIgA與空白對(duì)照組和單獨(dú)使用常規(guī)疫苗組呈差異極顯著(P<0.01)；在第21天與空白對(duì)照組和單獨(dú)使用常規(guī)疫苗組呈差異顯著(P<0.05)；在第28、35天與空白對(duì)照組和單獨(dú)使用常規(guī)疫苗組呈差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)對(duì)照組之間無明顯差異(P>0.05)?？谔阋邷缁畈《九浜峡莶菅堪麠U菌氣霧噴鼻免疫后，在第3、7、21天牛唾液中檢測(cè)到的特異性SIgA與空白對(duì)照組呈差異極顯著(P<0.01)；在第14、35天與空白對(duì)照組呈差異顯著(P<0.05)，其余對(duì)照組之間差異趨勢(shì)不明顯(圖5、6)。

A.口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌組；B.常規(guī)疫苗組；C.枯草芽胞桿菌組；D.滅活病毒組;E.空白對(duì)照組；★.黏膜上皮；☆.固有層；.IgA分泌細(xì)胞A. Intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis; B. Vaccine control group; C. Bacillus subtilis control group; D. Inactivated virus control group; E. Negative control group; ★.Mucosal epithelium; ☆.Lamina propria; .IgA secreting cells圖3 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后對(duì)牛肺內(nèi)支氣管黏膜中IgA分泌細(xì)胞的影響(400×)Fig.3 Effect of the intranasal immunized with inactivated FMDV combine with Bacillus subtilison on IgA secreting cells in cattle pulmonary bronchial mucosa(400×)

2.4 血清中O型口蹄疫總抗體的變化

經(jīng)ELISA檢測(cè)血清中牛O型口蹄疫病毒特異性抗體(圖7)與空白對(duì)照組、滅活病毒組、單獨(dú)使用枯草芽胞桿菌組相比，口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌氣霧噴鼻免疫后第3天檢測(cè)到特異性抗體，且在整個(gè)試驗(yàn)過程中呈差異極顯著(P<0.01)，依據(jù)試劑盒說明書常規(guī)疫苗組在免疫第14天后產(chǎn)生較好抗體。口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌氣霧噴鼻免疫牛所產(chǎn)生的特異性抗體水平較常規(guī)疫苗組高，且在免疫3個(gè)月后抗體水平回落較常規(guī)疫苗組慢。其余對(duì)照組間差異趨勢(shì)不明顯(P>0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different superscript lowercase and capital letters respectively show significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), the same letters show no significant difference (P>0.05)圖4 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后牛肺內(nèi)支氣管黏膜中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.4 Changes of IgA secreting cells in cattle pulmonary bronchial mucosa after the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis

2.5 呼吸道組織中IL-6、IL-12和TNF-α的變化

結(jié)合屠宰場(chǎng)實(shí)際條件，在免疫3個(gè)月后屠宰牛，分別采集了這些牛的鼻黏膜、氣管、肺、肺內(nèi)支氣管，運(yùn)用ELISA檢測(cè)其IL-6、IL-12和TNF-α的水平。結(jié)果顯示(圖8～10)，口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌免疫后，鼻、氣管、肺、肺內(nèi)支氣管中IL-6無明顯差異(P>0.05)；IL-12和TNF-α呈差異極顯著表達(dá)(P<0.01)，在單獨(dú)使用枯草芽胞桿菌組中也呈差異顯著表達(dá)(P<0.01或P<0.05)；而單獨(dú)使用疫苗組中與其余對(duì)照組一樣，IL-12表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，但在鼻和氣管中TNF-α呈差異極顯著(P<0.01)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different superscript lowercase and capital letters respectively show significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), the same letters show no significant difference (P>0.05)圖5 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后對(duì)牛鼻液O型口蹄疫病毒特異性SIgA的變化Fig.5 Changes of O type FMDV specific SIgA in nasal discharge from cattle after the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different superscript lowercase and capital letters respectively show significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), the same letters show no significant difference (P>0.05)圖6 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后牛唾液中O型口蹄疫病毒特異性SIgA的變化Fig.6 Changes of O type FMDV specific SIgA in saliva from cattle after the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different superscript lowercase and capital letters respectively show significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), the same letters show no significant difference (P>0.05)圖7 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后牛血清中O型口蹄疫病毒特異性抗體的變化Fig.7 Changes of O type FMDV specific antibodies in serum from cattle after the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis

相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)The same letters show no significant difference (P>0.05)圖8 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后對(duì)牛呼吸道組織中IL-6表達(dá)的影響Fig.8 Effect of the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis on expression of IL-6 in cattle respiratory tissues

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different superscript lowercase and capital letters respectively show significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), the same letters show no significant difference (P>0.05)圖9 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后對(duì)牛呼吸道組織中IL-12表達(dá)的影響Fig.9 Effect of the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis on expression of IL-12 in cattle respiratory tissues

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Different superscript lowercase and capital letters respectively show significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), the same letters show no significant difference (P>0.05)圖10 口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后對(duì)牛呼吸道組織中TNF-α表達(dá)的影響Fig.10 Effect of the intranasal immunized with inactivated FMDV along with Bacillus subtilis on expression of TNF-α in cattle respiratory tissues

3 討 論

由于口蹄疫是我國(guó)的A類動(dòng)物疫病，目前預(yù)防口蹄疫主要用滅活病毒疫苗。而單獨(dú)應(yīng)用滅活病毒通過鼻腔免疫不能有效的刺激局部黏膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答。有研究表明滅活病毒與免疫增強(qiáng)劑配合經(jīng)鼻腔免疫則會(huì)誘導(dǎo)有效的呼吸道免疫應(yīng)答[13-15]。

口蹄疫病毒最初是通過呼吸道或消化道黏膜進(jìn)入機(jī)體。如果在局部黏膜建立免疫屏障，則能在感染初期阻止病毒的進(jìn)入減少病毒的定植和擴(kuò)散。SIgA是黏膜免疫的主要效應(yīng)因子，具有防止病毒黏附和入侵等重要功能。黏膜固有層中IgA分泌細(xì)胞先合成IgA，在通過黏膜上皮的過程中與上皮細(xì)胞合成的分泌片段形成SIgA，后者在黏膜表面形成一層保護(hù)層，構(gòu)成防御病原微生物入侵機(jī)體極其重要的屏障[14]。呼吸道黏膜下分布較多IgA分泌細(xì)胞，可及時(shí)補(bǔ)充黏膜表面的SIgA。牛IgA應(yīng)答在防御不同傳染性病原體中發(fā)揮重要作用[16]。IgA分泌細(xì)胞分泌的SIgA在黏膜表面可阻斷病原體入侵，并能中和進(jìn)入黏膜中的病毒，是預(yù)防病毒感染的一個(gè)重要標(biāo)志[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用O型口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌鼻腔免疫后能明顯增加牛呼吸道IgA分泌細(xì)胞數(shù)量和鼻液中口蹄疫特異性SIgA水平，同時(shí)發(fā)現(xiàn)全身血清中O型口蹄疫病毒特異性抗體水平也顯著增加，這就為口蹄疫滅活病毒鼻腔免疫奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究運(yùn)用O型口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌噴鼻氣霧免疫牛后，鼻黏膜、肺內(nèi)支氣管黏膜下IgA分泌細(xì)胞明顯增多，同時(shí)鼻液和唾液中O型口蹄疫SIgA抗體也增加。由于鼻后孔與口腔相通，噴鼻過程中一部分抗原和枯草芽胞桿菌進(jìn)入口腔后部，刺激周圍扁桃體中IgA分泌細(xì)胞的形成和分泌，所以唾液中SIgA也隨之增加。同時(shí)，在免疫后早期口蹄疫病毒特異性抗體出現(xiàn)在血清中，中和抗體在清除體內(nèi)病毒中起重要作用[11]。表明口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌氣霧噴鼻免疫不僅可刺激局部呼吸道體液免疫，還能誘導(dǎo)牛的全身體液免疫應(yīng)答。

口蹄疫滅活病毒免疫原性較差，很多學(xué)者應(yīng)用多種方法試圖提高口蹄疫的免疫效率。2008年C. Cubillos等[18]運(yùn)用新型樹枝聚合肽聯(lián)合口蹄疫病毒T細(xì)胞表位、B細(xì)胞表位表達(dá)產(chǎn)物肌肉注射豬，增強(qiáng)黏膜IgA應(yīng)答和抵抗口蹄疫病毒。2013年D. M. Alejo等[19]運(yùn)用缺陷型腺病毒載體編碼大腸桿菌熱穩(wěn)定性外毒素經(jīng)鼻腔免疫小鼠，可提高口蹄疫病毒亞單位疫苗局部黏膜免疫力。2014年C. ?ok?alkan等[20]應(yīng)用殼聚糖配合口蹄疫滅活病毒經(jīng)鼻腔免疫豚鼠，可促進(jìn)全身和局部黏膜的免疫應(yīng)答。2016年Y. L. Xie等[21]將表達(dá)O型口蹄疫病毒P12A和3C蛋白重組慢病毒經(jīng)鼻腔、口腔免疫可刺激小鼠產(chǎn)生局部黏膜和全身免疫應(yīng)答。盡管上述研究均能產(chǎn)生較好黏膜免疫應(yīng)答，但仍然存在一些問題，如大腸桿菌熱穩(wěn)定性外毒素具有一定的毒副作用；慢病毒載體存在病毒毒力返祖的風(fēng)險(xiǎn)；殼聚糖和新型樹枝肽價(jià)格昂貴，不合適用于大動(dòng)物。

有研究表明枯草芽胞桿菌能提高機(jī)體免疫力[11-12,19]。本研究中所用的高表達(dá)表面活性素的枯草芽胞桿菌，能被黏膜下DC通過上皮細(xì)胞間伸出樹突攝取，誘導(dǎo)DC成熟且釋放TNF-α等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)抗感染的非特異性免疫應(yīng)答，增加抗體產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Th1和Th2平衡[10]；另外，表面活性素也能誘導(dǎo)DC的成熟，使其高表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子CD40，產(chǎn)生IL-6和TNF-α細(xì)胞因子，增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[12]。P. Zanvit等[22]應(yīng)用堅(jiān)硬芽胞桿菌配合H1N1滅活流感病毒鼻腔免疫小鼠可誘導(dǎo)局部細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。牟春曉(C.X.Mou)等[11]用重組構(gòu)建表達(dá)豬傳染性胃腸炎spike蛋白的枯草芽胞桿菌免疫豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能募集DC遷移至腸系膜淋巴結(jié)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

細(xì)胞免疫在抵抗口蹄疫病毒感染清除病毒中也起重要作用。本研究結(jié)果顯示，鼻腔免疫后牛鼻、氣管、肺、肺內(nèi)支氣管中IL-12、TNF-α水平均顯著增加。與牟春曉(C.X.Mou)等[11]、徐文雯(W.W.Xu)等[12]報(bào)道的枯草芽胞桿菌和表面活性素能促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的免疫機(jī)制結(jié)果相一致。IL-12是Th1細(xì)胞活化所必需的細(xì)胞因子，在發(fā)揮抗病原微生物感染的適應(yīng)性保護(hù)免疫中起重要作[23-25]。I. V. Lyadova等[26]用卡介苗鼻腔免疫小鼠5周后，肺部總T淋巴細(xì)胞數(shù)和CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著增加，且產(chǎn)生IL-5、IL-12、IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)也明顯增加，我們?cè)诒驹囼?yàn)中觀察到呼吸道中IL-12水平顯著增加與之相一致。B. Clapp等[27]用布氏桿菌突變株ΔznuAB鼻腔接種免疫小鼠4周后，發(fā)現(xiàn)活化的效應(yīng)記憶T細(xì)胞能夠產(chǎn)生高水平的TNF-α、IFN-γ、穿孔素等抗病原微生物有效成分，提高機(jī)體對(duì)抵抗布氏桿菌的免疫保護(hù)作用。在本試驗(yàn)中我們也檢測(cè)到了較高水平的TNF-α，可推測(cè)口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌氣霧噴鼻免疫牛后，機(jī)體也產(chǎn)生了效應(yīng)記憶T細(xì)胞，進(jìn)而保持持久的免疫效果，表明TNF-α在抗病毒中發(fā)揮重要作用。IL-6是在免疫早期產(chǎn)生的可促進(jìn)B細(xì)胞活化增殖分化為漿細(xì)胞，增加免疫球蛋白合成與分泌的細(xì)胞因子[28]。因本試驗(yàn)于免疫3個(gè)月后屠宰牛，未能檢測(cè)到IL-6的變化。上述結(jié)果表明口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌氣霧噴鼻免疫可刺激牛呼吸道局部細(xì)胞免疫應(yīng)答，這在阻斷口蹄疫病毒向深部組織擴(kuò)散時(shí)起重要防御作用。

4 結(jié) 論

應(yīng)用O型口蹄疫滅活病毒配合枯草芽胞桿菌噴鼻氣霧免疫牛后能明顯增加呼吸道IgA分泌細(xì)胞數(shù)量和鼻液中口蹄疫特異性SIgA水平，鼻、氣管、肺和肺內(nèi)支氣管中IL-12、TNF-α水平均顯著增加，同時(shí)血清中O型口蹄疫病毒特異性抗體水平也顯著增加，可見能提高呼吸道局部體液和細(xì)胞免疫，同時(shí)還可誘導(dǎo)全身系統(tǒng)免疫應(yīng)答，有利于抵抗口蹄疫病毒。

[1] FERNANDEZ-SAINZ I, MEDINA G N, RAMIREZ-MEDINA E, et al. Adenovirus-vectored foot-and-mouth disease vaccine confers early and full protection against FMDV O1 Manisa in swine[J].Virology, 2017, 502: 123-132.

[2] ARZT J, JULEFF N, ZHANG Z, et al. The pathogenesis of foot-and-mouth disease I: viral pathways in cattle[J].TransboundEmergDis, 2011, 58(4): 291-304.

[3] STENFELDT C, SEGUNDO F D S, SANTOS T, et al. The pathogenesis of foot-and-mouth disease in pigs[J].FrontVetSci, 2016, 3: 41.

[4] 李正平. 山羊呼吸道相關(guān)淋巴組織及鼻腔吸收滅活病毒的形態(tài)學(xué)研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011: 35-41. LI Z P. Morphology of the respiratory tract associated lymphoid tissue and nasal absorption of inactivated virus in goat[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2011: 35-41. (in Chinese)

[5] 李乙江, 楊晶晶, 牛自兵, 等. 黃牛呼吸道IgA分泌細(xì)胞和淋巴組織分布的研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 40(6): 1100-1104. LI Y J, YANG J J, NIU Z B, et al. Distribution of IgA secreting cells and lymphoid tissues in cattle respiratory tract[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity, 2017, 40(6): 1100-1104. (in Chinese)

[6] 楊 倩. 黏膜免疫及其疫苗設(shè)計(jì)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2016: 24-289. YANG Q. Mucosal immunization and vaccine strategies[M]. Beijing: Science Press, 2016: 24-289. (in Chinese)

[7] 申育萌, 楊 倩. 枯草芽胞桿菌芽孢對(duì)豬扁桃體內(nèi)樹突狀細(xì)胞的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2015, 64(5): 849-854. SHEN Y M, YANG Q. Effects of intranasal administration withBacillussubtilisspores on the dendritic cells in porcine tonsils[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2015, 64(5): 849-854. (in Chinese)

[8] CHALLA S, SZCZEPANEK S M, ROOD D, et al. Bacterial toxin fusion proteins elicit mucosal immunity against a foot-and-mouth disease virus antigen when administered intranasally to guinea pigs[J].AdvVirol, 2011, 2011: 713769.

[9] AMUGUNI H, TZIPORI S. Bacillus subtilis: a temperature resistant and needle free delivery system of immunogens[J].HumVaccinImmunother, 2012, 8(7): 979-986.

[10] MNIF I, GHRIBI D. Review lipopeptides biosurfactants: mean classes and new insights for industrial, biomedical, and environmental applications[J].Biopolymers, 2015, 104(3): 129-147.

[11] MOU C X, ZHU L Q, XING X P, et al. Immune responses induced by recombinantBacillussubtilisexpressing the spike protein of transmissible gastroenteritis virus in pigs[J].AntiviralRes, 2016, 131: 74-84.

[12] XU W W, LIU H F, WANG X Q, et al. Surfactin induces maturation of dendritic cellsinvitro[J].BiosciRep, 2016, 36(5): e00387.

[13] TAKADA A, MATSUSHITA S, NINOMIYA A, et al. Intranasal immunization with formalin-inactivated virus vaccine induces a broad spectrum of heterosubtypic immunity against influenza A virus infection in mice[J].Vaccine, 2003, 21(23): 3212-3218.

[14] GEERAEDTS F, BUNGENER L, POOL J, et al. Whole inactivated virus influenza vaccine is superior to subunit vaccine in inducing immune responses and secretion of proinflammatory cytokines by DCs[J].InfluenzaOtherRespirViruses, 2008, 2(2): 41-51.

[15] RENEGAR K B, SMALL P A Jr, BOYKINS L G, et al. Role of IgA versus IgG in the control of influenza viral infection in the murine respiratory tract[J].JImmunol, 2004, 173(3): 1978-1986.

[16] MUTO K, KAMEI N, YOSHIDA M, et al. Cell-penetrating peptide penetratin as a potential tool for developing effective nasal vaccination systems[J].JPharmSci, 2016, 105(6): 2014-2017.

[17] ESTES D M. Regulation of IgA responses in cattle, humans and mice[J].VetImmunolImmunopathol, 2010, 138(4): 312-317.

[18] CUBILLOS C, DE LA TORRE B G, JAKAB A, et al. Enhanced mucosal immunoglobulin A response and solid protection against foot-and-mouth disease virus challenge induced by a novel dendrimeric peptide[J].JVirol, 2008, 82(14): 7223-7230.

[19] ALEJO D M, MORAES M P, LIAO X F, et al. An adenovirus vectored mucosal adjuvant augments protection of mice immunized intranasally with an adenovirus-vectored foot-and-mouth disease virus subunit vaccine[J].Vaccine, 2013, 31(18): 2302-2309.

[21] XIE Y L, GAO P, LI Z Y. A recombinant adenovirus expressing P12A and 3C protein of the type O Foot-and-Mouth disease virus stimulates systemic and mucosal immune responses in mice[J].BiomedResInt, 2016, 2016: 7849203.

[22] ZANVIT P, TICHOPD A,M, et al. Adjuvant effect ofBacillusfirmuson the expression of cytokines and toll-like receptors in mouse nasopharynx-associated lymphoid tissue (NALT) after intranasal immunization with inactivated influenza virus type A[J].ImmunolLett, 2010, 134(1): 26-34.

[23] COOPER A M, ROBERTS A D, RHOADES E R, et al. The role of interleukin-12 in acquired immunity to Mycobacterium tuberculosis infection[J].Immunology, 1995, 84(3): 423-432.

[24] FLYNN J L, GOLDSTEIN M M, TRIEBOLD K J, et al. IL-12 increases resistance of BALB/c mice to Mycobacterium tuberculosis infection[J].JImmunol, 1995, 155(5): 2515-2524.

[25] WAKEHAM J, WANG J, MAGRAM J, et al. Lack of both types 1 and 2 cytokines, tissue inflammatory responses, and immune protection during pulmonary infection byMycobacteriumbovisBacille Calmette-Guérin in IL-12-deficient mice[J].JImmunol, 1998, 160(12): 6101-6111.

[26] LYADOVA I V, VORDERMEIER H M, ERUSLANOV E B, et al. Intranasal BCG vaccination protects BALB/c mice against virulentMycobacteriumbovisand accelerates production of IFN-γ in their lungs[J].ClinExpImmunol, 2001, 126(2): 274-279.

[27] CLAPP B, YANG X H, THORNBURG T, et al. Nasal vaccination stimulates CD8+T cells for potent protection against mucosalBrucellamelitensischallenge[J].ImmunolCellBiol, 2016, 94(5): 496-508.

[28] ROSE-JOHN S, WAETZIG G H, SCHELLER J, et al. The IL-6/sIL-6R complex as a novel target for therapeutic approaches[J].ExpertOpinTherTargets, 2007, 11(5): 613-624.