厚樸總酚對金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抗溶血作用

劉桂蘭，周永林，李文華，謝玲玲，劉愛玲，鄧旭明*

(1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062； 2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300300)

厚樸為木蘭科木蘭屬植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮和枝皮。為常用中藥，列為中品，味辛、性溫，具有行氣化濕、溫中止痛、降逆平喘等功效。厚樸在許多藥方中都有出現(xiàn)，可見其在我國傳統(tǒng)中藥中的重要地位[1]。同時現(xiàn)代藥理試驗也證明了厚樸具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗?jié)儭⒖鼓?、保護(hù)心腦血管及抑制嗎啡戒斷反應(yīng)等重要作用。厚樸中的酚類為有效成分，厚樸總酚由9種酚類組成，其中以厚樸酚及和厚樸酚為主要成分[2-3]。在基于其眾多藥理功效的基礎(chǔ)上，本次試驗著重研究其在抗細(xì)菌感染方面的一些基礎(chǔ)研究，并致力于厚樸總酚的藥物產(chǎn)品轉(zhuǎn)化。

近幾年研究表明奶牛乳房炎的發(fā)病范圍逐漸變廣，發(fā)病率呈上升趨勢，尤其以沒有明顯臨床癥狀的隱形乳房炎最為嚴(yán)重[4]。乳房炎主要是由金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等病原菌感染所導(dǎo)致的，主要包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌，動物中最先發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)感染是在患乳房炎的奶牛中。目前，國內(nèi)外針對乳房炎主要是通過抗生素療法，但隨著乳房炎病原菌的耐藥性產(chǎn)生(如MRSA)，抗生素在肉品和奶制品中的殘留等問題的出現(xiàn)，抗生素治療已經(jīng)不能作為唯一有效的治療方法[5-7]。世界衛(wèi)生組織也在特別強調(diào)藥物使用的安全性，提倡回歸自然，這都為非傳統(tǒng)療法，尤其是中草藥療法的制劑開發(fā)提供了良好的機(jī)遇[8]。

研究表明，多種中藥制成的乳房灌注劑具有良好的抗金黃色葡萄球菌活性，在治療臨床型乳房炎過程中具有良好的效果[9]。此外，許多天然化合物可濃度依賴性地降低金黃色葡萄球菌α-溶血素的表達(dá)[10]。α-溶血素是一種攻擊因子，若將α-溶血素注入皮內(nèi)，能引起皮膚壞死，靜脈注射則導(dǎo)致動物的迅速死亡。其作為金黃色葡萄球菌感染動物機(jī)體的主要毒力因子，金黃色葡萄球菌造成的乳房炎在發(fā)病過程中，α-溶血素起到主要的致病致炎作用。本試驗研究了厚樸總酚對金黃色葡萄球菌的抗菌活性及其對金黃色葡萄球菌α-溶血素分泌的影響，通過直接抑制α-溶血素的最終表達(dá)量，降低金黃色葡萄球菌入侵乳房造成的毒性，再結(jié)合機(jī)體本身的免疫功能，最終成功地預(yù)防金黃色葡萄球菌感染造成的奶牛乳房炎發(fā)生，這從抗毒力策略角度去解決了實際問題。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株USA300、ATCC 29213、ATCC 25923和BAA1707購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏管理中心(ATCC)，保存于-80 ℃。

1.2 試劑

厚樸總酚為本實驗室制備(瑞普天津生物藥業(yè)有限公司)，抗α-溶血素多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、ECL發(fā)光液和溶葡萄球菌素均購自美國Sigma-Aldrich公司；RNA提取試劑盒(Qiagen RNeasy Maxi column)購自德國Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa RNA PCR kit)和熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix ExTaqTM)購自TaKaRa公司。厚樸總酚溶解于DMSO中，制備成40 960 μg·mL-1的母液備用。

1.3 最小抑菌濃度的測定

最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)試驗用于驗證金黃色葡萄球菌是否對厚樸總酚具有一定的敏感性，確定其是否具有抗菌活性。采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的肉湯微量稀釋法測定厚樸總酚對金黃色葡萄球菌的MIC，苯唑西林作對照。

1.4 溶血試驗

溶血試驗是為確定厚樸總酚是否降低金黃色葡萄球菌α-溶血素的活性和作為進(jìn)一步研究厚樸總酚保護(hù)由細(xì)菌感染造成細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。挑取金黃色葡萄球菌USA300單菌落于2 mL MHB培養(yǎng)基中，200 r·min-1、37 ℃過夜培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)至250 mL MHB培養(yǎng)基中至OD600 nm=0.3，加入不同亞抑菌濃度的厚樸總酚，于恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)(37 ℃，200 r·min-1)至平臺期，每個處理組吸取1 mL樣品，12 000 r·min-1離心1 min后收集上清。配制溶血體系，875 μL PBS緩沖液、100 μL培養(yǎng)物上清以及25 μL脫纖維兔血混合均勻后于37 ℃孵育15 min，離心收集上清并檢測其吸光值(OD=543 nm)。

1.5 免疫印跡試驗

為更直觀地從蛋白質(zhì)水平說明厚樸總酚可以降低α-溶血素的表達(dá)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗來進(jìn)一步說明。取上述細(xì)菌培養(yǎng)物上清與上樣緩沖液按照4∶1混勻后煮沸10 min。經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后，按照金黃色葡萄球菌α-溶血素蛋白的大小切取膠，通過轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉常溫封閉2 h，用抗α-溶血素多克隆抗體孵育2 h和HPR標(biāo)記的二抗孵育1 h，經(jīng)ECL發(fā)光液處理后進(jìn)行顯影及膠片曝光。

1.6 熒光定量PCR試驗

若蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生改變，很大程度上是影響了蛋白表達(dá)的某個過程，或影響α-溶血素蛋白表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)。熒光定量PCR試驗可以在基因水平驗證是否影響蛋白的表達(dá)[11]。金黃色葡萄球菌USA300在加入不同亞抑菌濃度厚樸總酚的MHB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 nm=2.5。離心收集細(xì)菌(10 000 r·min-12 min，4 ℃)，用含100 μg·mL-1溶葡萄球菌素的TES緩沖液重懸細(xì)菌，37 ℃水浴10 min，此后，按照試劑盒提取RNA，用TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver.3.0試劑盒反轉(zhuǎn)錄得cDNA；熒光定量PCR引物如表1所示；用SYBR Premix ExTaqTM試劑盒在定量PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃變性30 s，95 ℃ 5 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，反應(yīng)體系為25 μL運行35個循環(huán)。以16S rRNA作為內(nèi)參。結(jié)果分析采用ΔΔCt法。

表1 熒光定量PCR引物

Table 1 Primers used for RT-PCR

引物Primer基因Gene序列Sequence16SrRNA-F16SrRNA5'-GCTGCCCTTTGTATTGTC-3'16SrRNA-R16SrRNA5'-AGATGTTGGGTTAAGTCC-3'hla-Fhla5'-TTGGTGCAAATGTTTC-3'hla-Rhla5'-TCACTTTCCAGCCTACT-3'agrA-FagrA5'-TTCACTGTGTCGATAATCCA-3'agrA-RagrA5'-GGAAGGAGTGATTTCAATGG-3'

1.7 LDH釋放試驗

金黃色葡萄球菌感染動物可造成肺炎、偽膜性腸炎、心包炎和乳房炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染，乳腺上皮細(xì)胞用于細(xì)胞水平驗證金黃色葡萄球菌的致病性和藥物的保護(hù)效果。取生長狀態(tài)良好的乳腺上皮細(xì)胞(本實驗室保存)，胰酶消化后重懸至1 mL的完全培養(yǎng)基中并稀釋至1.5×105·mL-1，加入96孔板中，每孔100 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。后加入重懸細(xì)菌和厚樸總酚，共培養(yǎng)5 h，離心收集細(xì)胞上清。配制并按照說明加入LDH試劑，避光反應(yīng)30 min，酶標(biāo)儀490 nm處測吸光值，計算LDH釋放率。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 厚樸總酚對金黃色葡萄球菌的抗菌作用

由表2可知，厚樸總酚對金黃色葡萄球菌USA300的MIC為8 μg·mL-1，且其對甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)(USA300和BAA1707)和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)(ATCC25923和29213)的MIC沒有顯著差異。

表2 厚樸總酚對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

Table 2 The MIC values of total magnolol againstS.aurues

菌株Strain來源OriginMIC/(μg·mL-1)苯唑西林厚樸總酚ATCC29213ATCC0.2516ATCC25923ATCC0.2516BAA1707ATCC1288USA300ATCC1288

2.2 亞抑菌濃度厚樸總酚抑制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清對兔紅細(xì)胞的溶血活性和降低金黃色葡萄球菌α-溶血素的表達(dá)

如圖1、表3所示，亞抑菌濃度的厚樸總酚能夠抑制金黃色葡萄球菌溶血作用，且抑制呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)厚樸總酚的濃度為4 μg·mL-1時，對ATCC 25923和USA300菌液上清抑制溶血活性效果非常明顯，其溶血性僅為不加藥對照組的3.47%和2.36%。厚樸總酚對金黃色葡萄球菌溶血素分泌的抑制作用與溶血活性試驗結(jié)果相符合。在測試濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)厚樸總酚的濃度達(dá)到4 μg·mL-1時，溶血素的分泌顯著降低，兩株標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物上清幾乎檢測不到α-溶血素(圖2)。

圖1 厚樸總酚對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清溶血活性的影響Fig.1 Impact of total magnolol on the hemolysis of S. aurues culture supernatants

2.3 厚樸總酚對金黃色葡萄球菌調(diào)控α-溶血素表達(dá)的hla和agrA基因轉(zhuǎn)錄的影響

熒光定量PCR實驗考察厚樸總酚對hla和agrA轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果如圖3所示，加入不同濃度的厚樸總酚后，hla和agrA基因轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)劑量依賴性降低。

表3 亞抑菌濃度厚樸總酚對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清溶血活性的影響

Table 3 Impact of total magnolol on the hemolysis ofS.auruesculture supernatants

%

不加厚樸總酚的菌液上清溶血活性視為100%。*.P<0.05，**.P<0.01

The hemolytic activity of theS.auruesculture supernatant without total magnolol was considered as 100%.*.P<0.05，**.P<0.01

圖2 厚樸總酚作用后ATCC 29213(A)和USA300(B)培養(yǎng)物上清中α-溶血素的免疫印跡分析Fig.2 Western blot analysis of α-hemolysin contents in the culture supernatants

圖3 金黃色葡萄球菌USA300 hla和agrA基因轉(zhuǎn)錄量Fig.3 Relative gene transcription of hla and agrA treated with total magnolol

2.4 厚樸總酚緩解金黃色葡萄球菌α-溶血素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用

如圖4所示，厚樸總酚(4 μg·mL-1)對乳腺上皮細(xì)胞無細(xì)胞毒性，在細(xì)菌與細(xì)胞共感染體系內(nèi)加入厚樸總酚可極顯著降低金黃色葡萄球菌α-溶血素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，且這一抑制作用呈明顯劑量依賴性。

加入不同濃度厚樸總酚的金黃色葡萄球菌與乳腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系LDH釋放率與細(xì)胞毒性，其中為厚樸總酚對乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性；*.P<0.05，**.P<0.01LDH release rate and cytotoxicity in co culture system of Staphylococcus aureus and mammary epithelial cells with different concentrations of total magnolol, indicates the cytotoxicity of total magnolon on mammary epithelial cells; *.P<0.05，**.P<0.01圖4 LDH釋放與細(xì)胞毒性Fig.4 LDH release and cell toxicity

3 討 論

隨著我國人民生活水平的提高，牛奶已經(jīng)成為日常生活中不可或缺的一部分，但乳房炎已成為制約奶牛業(yè)發(fā)展的主要因素[12]。隱性乳房炎是奶牛乳房炎中發(fā)病率最高的一種，在我國隱性乳房炎的發(fā)病率高達(dá)20%～40%，甚至高達(dá)50%～80%，其臨床不出現(xiàn)明顯的癥狀，乳汁也無肉眼可見的異常，然而乳汁在理化性質(zhì)及細(xì)菌學(xué)上已經(jīng)發(fā)生變化，嚴(yán)重影響牛乳的質(zhì)量[13]。隱性乳房炎較難及時發(fā)現(xiàn)和治療，其中細(xì)菌，尤其是金黃色葡萄球菌感染是奶牛乳房炎的主要發(fā)病因素[14]。目前，國內(nèi)外治療奶牛乳房炎主要是應(yīng)用傳統(tǒng)的抗生素療法，但隨著乳房炎病原菌的耐藥性產(chǎn)生，尤其是以金黃色葡萄球菌為主，抗生素治療已經(jīng)不能滿足或不適宜防控乳房炎的發(fā)生[15]。

3.1 厚樸總酚對金黃色葡萄球菌抑菌作用

由厚樸總酚對金黃色葡萄球菌USA300的MIC結(jié)果可知，厚樸總酚具有一定的抗菌活性。相比與其他化學(xué)合成藥物和抗生素，中藥具有毒副作用低、吸收良好和藥效廣等優(yōu)點[16-19]。這一結(jié)論提示，厚樸總酚可作為一種潛在的輔助性抗菌藥物，在高劑量條件下可明顯的起到抗菌活性。

3.2 厚樸總酚對金黃色葡萄球菌α-溶血素表達(dá)及其調(diào)控基因表達(dá)的影響

由溶血活性試驗結(jié)果可知，當(dāng)厚樸總酚的濃度為4 μg·mL-1時，厚樸總酚可抑制α-溶血素的溶血活性，進(jìn)一步的熒光定量PCR試驗結(jié)果表明厚樸總酚對hla和agrA基因的轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)劑量依賴性降低，α-溶血素表達(dá)基因和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平受到厚樸總酚的抑制[20-24]。綜上所述，厚樸總酚可抑制α-溶血素編碼基因hla及其上游調(diào)控系統(tǒng)agrA基因的轉(zhuǎn)錄而降低α-溶血素的表達(dá)。

3.3 厚樸總酚對金黃色葡萄球菌α-溶血素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用的干預(yù)效果

近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展使得人們對于細(xì)菌的致病特性以及相關(guān)毒力因子結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識的不斷加深，毒力因子已成為新型抗感染藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)之一[25-27]。而各種細(xì)菌性毒力因子對于病原菌致病力的貢獻(xiàn)不一，因此選擇對致病菌致病機(jī)制不可或缺的毒力因子成為抗毒力策略的首選。金黃色葡萄球菌作為奶牛乳房炎的主要病原菌，其致病性主要依賴于一些分泌的毒力因子，如α-溶血素等[28]。本研究還發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度厚樸總酚處理可顯著降低α-溶血素編碼基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，并明顯緩解金黃色葡萄球菌α-溶血素介導(dǎo)的宿主細(xì)胞的細(xì)胞損傷作用，這一結(jié)果提示較低濃度厚樸總酚可通過抑制金黃色葡萄球菌毒力因子而發(fā)揮抗感染作用。

厚樸總酚可作為一種潛在的抗奶牛乳房炎的先導(dǎo)復(fù)合物，較高濃度可直接發(fā)揮抑菌或殺菌作用，較低濃度可通過抗毒力作用而發(fā)揮抗感染作用[29-31]。

4 結(jié) 論

厚樸總酚在高劑量和低劑量條件下均可發(fā)揮不同程度的抗金黃色葡萄球菌感染作用，可作為一種前景良好的藥物更深層次去研究，本研究為后續(xù)厚樸總酚制成成品藥的臨床前期試驗奠定了有價值的基礎(chǔ)。

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