廣州市生鮮雞中腸炎沙門菌的監(jiān)測及耐藥基因的分子鑒定

孫朋浩，邱榮超，李書寧，鄭雙雙，楊偉聰，張麗娜，符 穎，詹澤強(qiáng)，張建民，廖 明，瞿孝云*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物科技學(xué)院，鄭州 450011； 3.云南省西雙版納州動物疫病預(yù)防控制中心，景洪 666100)

沙門菌(Salmonella)是一種重要的人獸共患病原菌，也是重要的食源性病原菌[1]，據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)，在美國每年大約有120萬人感染沙門菌而患病，造成約450人死亡[2-3]。在我國每年大約有3億人因沙門菌感染而患病，占我國病原菌型食源性疾病總數(shù)的70%～80%[4]。沙門菌暴發(fā)和隨機(jī)感染的病例中大部分是由于攝入受污染的食物造成的，這些食物主要包括肉類食品、牛奶、雞蛋、水果和蔬菜等，其中雞肉被認(rèn)為是沙門菌的主要載體，是人類感染沙門菌的一個重要源頭[5]。廣東省是雞肉的生產(chǎn)和消費(fèi)大省[6]，關(guān)于廣東省雞肉中沙門菌的相關(guān)報(bào)道較少，缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)和信息。

腸炎沙門菌是造成食品污染和人源感染的沙門菌中最常見的血清型[7-8]，近年來，食源中沙門菌的耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重[9]，人們通過食用雞肉感染腸炎沙門菌的概率遠(yuǎn)高于其他肉類產(chǎn)品[5]，氟喹諾酮類藥物和頭孢類藥物是目前臨床治療沙門菌感染的一線藥物[9]，密切關(guān)注腸炎沙門菌對β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類藥物的耐藥情況，對合理使用抗生素和保障廣州市雞肉食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 2016年3—12月，每月從廣州市白云區(qū)、越秀區(qū)、天河區(qū)、海珠區(qū)、荔灣區(qū)的農(nóng)貿(mào)市場隨機(jī)采集現(xiàn)屠宰生鮮雞樣品，采樣對象主要是雞腿、雞翅、雞胸脯肉，每次在各個區(qū)采集樣品約10份，使采樣點(diǎn)盡可能的分布在不同檔口，最后共采集了316份雞肉樣品。藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SalmonellaTyphimuriumLT2，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉(XLT4)瓊脂、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、沙門菌顯色板、LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、無菌采樣袋均購自青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司。沙門菌屬診斷血清購自S&A公司。MH瓊脂購自廣州環(huán)凱微生物有限公司。16種藥敏紙片：氨芐西林(ampicillin, AMP)、奧格門丁(amoxicillin-clavulanic acid, AMC)、頭孢噻肟(cefotaxime, CTX)、頭孢他啶(ceftazidime, CAZ)、頭孢吡肟(cefepime, FEP)、慶大霉素(gentamicin, CEN)、鏈霉素(streptomycin, STR)、阿米卡星(amikacin, AMK)、復(fù)方新諾明(paediatric compound sulfamethoxazole tablets, SXT)、磺胺復(fù)合物(peptidylsulfanilamide, S3)、萘啶酸(nalidixic acid, NAL)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、氯霉素(chloramphenicol, CHL)、亞胺培南(imipenem, IPM)、多黏菌素B(polymyxin B sulfate, PB)、四環(huán)素(tetracycline, TET)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。TaqDNA聚合酶和1 000 bp Marker購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌的分離鑒定 沙門菌分離的方法主要參考國家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.4-2016)。培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)平板上菌落的形態(tài)，挑取典型菌落用麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行純化，取純化后的沙門菌疑似菌落分別穿刺接種三糖鐵和尿素斜面，37 ℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)結(jié)果H2S陽性、尿酶陰性者即被認(rèn)定為沙門菌，最后用沙門菌屬診斷血清進(jìn)行最終確定。

1.2.2 沙門菌血清型鑒定 鑒定方法按照泰國S&A 公司提供的沙門菌血清診斷操作步驟進(jìn)行，查閱S&A公司沙門菌抗血清診斷附錄，根據(jù)測定得到的抗原式確定沙門菌的血清型。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 選取16種抗菌藥物藥敏紙片，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的Kirby-Bauer法，對分離菌株進(jìn)行操作，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，結(jié)果參照賽默飛世爾科技公司提供的藥敏試驗(yàn)參照表和CLSI制定的藥敏試驗(yàn)抑菌環(huán)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1.2.4 基因檢測 本試驗(yàn)選擇喹諾酮耐藥決定區(qū)基因(quinolone resistance determining regions, QRDRs)gyrA、gyrB、parC、parE和質(zhì)粒介導(dǎo)的諾酮類耐藥基因(plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR)qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、qepA為擴(kuò)增對象，引物合成參照文獻(xiàn)記載[10-16]；選擇β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCTX-M、blaCMY、blaOXA、blaPSE、blaSHV為擴(kuò)增對象，引物合成參考相關(guān)研究[17-18]；選擇Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類整合子基因盒插入?yún)^(qū)(可變區(qū))的基因?yàn)閿U(kuò)增對象，引物合成參考文獻(xiàn)[19]，通過PCR方法和基因序列測定方法進(jìn)行檢測。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及序列測定 不同目的基因的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件略有差異，具體參照文獻(xiàn)方法[10-15,17-19]。序列測定由廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌分離鑒定及血清型

316份雞肉樣品中,陽性樣品為243份，陽性率為76.9%。共鑒定23種血清型，主要血清型為阿貢納(19.8%)、科瓦利斯(14.0%)、姆班達(dá)卡(11.9%)、肯塔基(10.3%)、腸炎(7.8%)、布倫登盧普(7.4%)(表1)。

2.2 藥敏試驗(yàn)

腸炎沙門菌對萘啶酸(100.0%)、磺胺復(fù)合物(79.0%)、氨芐西林(57.9%)耐藥嚴(yán)重，對鏈霉素(36.8%)、四環(huán)素(21.0%)、慶大霉素(21.0%)、頭孢噻肟(15.8%)、頭孢他啶(5.3%)耐藥水平較低，對奧格門丁、頭孢吡肟、阿米卡星、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、氯霉素、亞胺培南、多黏菌素B完全敏感，多重耐藥率為68.4%(耐3類及其以上的抗生素)(表2～4)。19株腸炎沙門菌的耐藥譜中，以AMP+STR+S3+NAL+TET、S3+NAL、NAL最多(15.8%)，其次是AMP+STR+S3+NAL、AMP+CEN+S3+NAL+TET(10.5%)；最長耐藥譜為AMP+CTX+STR+S3+NAL+TET(5.3%)(表3)。

表1 243株沙門菌血清型分布

Table 1 243 strains ofSalmonellaserotype distribution

編號Number血清型Serotype分布Distribution越秀Yuexiu海珠Haizhu白云Baiyun天河Tianhe荔灣Liwan總計(jì)Total比率/%Rate1阿貢納(S.Agona)61514584819.82科瓦利斯(S.Kottbus)998353414.03姆班達(dá)卡(S.Mbandaka)1239232911.94肯塔基(S.Kentucky)716562510.35腸炎(S.enteritidis)36334197.86布倫登盧普(S.Braenderup)25245187.47其他Others10221311147028.8總計(jì)Total4961553345243

表2 19株腸炎沙門菌耐藥情況

Table 2 19 strains ofSalmonellaenteritidis antibiotic resistance

%

表3 19株腸炎沙門菌多重耐藥譜

Table 3 Multiple antibiotic resistance profiles of 19 strains ofSalmonellaenteritidis

耐藥型Resistancemode耐藥數(shù)Number多重耐藥譜Resistancespectrum耐藥菌株數(shù)Strans耐藥率/%RateR11NAL315.8R22S3+NAL315.8R33AMP+S3+NALAMP+CEN+NAL115.35.3R44CTX+CAZ+S3+NAL15.3AMP+CEN+S3+NAL15.3AMP+STR+S3+NAL210.5R55CTX+STR+S3+NAL+TET15.3AMP+CEN+S3+NAL+TET210.5AMP+STR+S3+NAL+TET315.8R66AMP+CTX+STR+S3+NAL+TET15.3

2.3 QRDRs的突變與PMQR的檢測

19株腸炎沙門菌中，喹諾酮耐藥決定區(qū)基因(QRDRs)的突變結(jié)果：gyrA、gyrB、parC基因中共檢測出49個突變位點(diǎn)，parE未檢測到突變。94.7%的菌株發(fā)生gyrA突變，突變類型有天冬氨酸-87→甘氨酸(42.1%)、天冬氨酸-87→色氨酸(31.6%)、絲氨酸-83→色氨酸(21.1%)；73.7%的菌株發(fā)生gyrB突變，突變類型均為AAC-410→A-C(堿基位點(diǎn)缺失)和苯丙氨酸-414→絲氨酸(73.7%)；15.8%的菌株發(fā)生parC突變，突變類型有AAC-25→A-C(堿基位點(diǎn)缺失，5.3%)、GAA-140→-AA(堿基位點(diǎn)缺失，10.5%)；5.3%的菌株同時(shí)發(fā)生gyrA、parC突變，68.4%的菌株同時(shí)發(fā)生gyrA、gyrB突變，10.5%的菌株同時(shí)發(fā)生gyrA、gyrB、parC突變。19株腸炎沙門菌中，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因(PMQR)檢測結(jié)果：5.3%的菌株攜帶qepA，qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、qnrD均未檢測到；攜帶qepA的菌株同時(shí)發(fā)生gyrA、gyrB基因突變(表4)。

表4 19株腸炎沙門菌耐藥情況與基因檢測情況

Table 4 Drug resistance and gene detection of 19 strains ofSalmonellaenteritidis

編號Number所耐藥物ResistancetoantibioticsPMQR耐藥基因PMQRmutationsQRDRs突變基因QRDRsmutationsβ-內(nèi)酰胺類耐藥基因β-lactamresistancegens1AMP+STR+S3+NAL+TETgyrA,gyrBblaTEM2AMP+S3+NALgyrBblaTEM3AMP+STR+S3+NAL+TETgyrA4AMP+STR+S3+NALgyrA,gyrBblaTEM5S3+NALqepAgyrA,gyrB6AMP+CEN+S3+NAL+TETgyrA,gyrBblaCTX-M,blaTEM7AMP+CEN+S3+NAL+TETgyrA,gyrB,parCblaTEM8CTX+STR+S3+NAL+TETgyrA9S3+NALgyrA,gyrB10AMP+CEN+S3+NALgyrA,gyrBblaTEM11NALgyrA,gyrB12AMP+STR+S3+NALgyrA,gyrBblaTEM13CTX+CAZ+S3+NALgyrA14S3+NALgyrA,gyrB15NALgyrA,gyrB,parC16AMP+STR+S3+NAL+TETgyrA17NALgyrA,gyrB18AMP+CEN+NALgyrA,parCblaCTX-M,blaTEM19AMP+CTX+STR+S3+NAL+TETgyrA,gyrB

1～19分別為19株腸炎沙門菌編號

The number that from 1 to 19 is the number ofSalmonellaenteritidisstrains

2.4 β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢測

19株腸炎沙門菌中，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測結(jié)果：blaTEM、blaCTX-M的檢出率分別為42.1%、10.5%，blaTEM和blaCTX-M的共同檢出率為10.5%；blaCMY、blaOXA、blaPSE、blaSHV均未檢測到。

2.5 Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類整合子的檢測

Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類整合子均未檢測到。

3 討 論

沙門菌作為食源性疾病的頭號致病菌而備受關(guān)注，世界衛(wèi)生組織、美國和丹麥等國家相繼建立沙門菌監(jiān)測系統(tǒng)，近年來，我國也日益重視對沙門菌的監(jiān)測和研究工作。本次試驗(yàn)中，雞肉中沙門菌檢出率為76.9%，此前，楊保偉(B.W.Yang)等[20]報(bào)道的在陜西省雞肉中沙門菌的檢出率為54%，林蘭等[21]報(bào)道北京市生鮮整雞中沙門菌的檢出率為49.9%，通過比較不同地區(qū)間雞肉中沙門菌的檢出率，可以發(fā)現(xiàn)廣州市雞肉中沙門菌的污染率遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，原因可能在于廣州地處華南地區(qū)，常年溫度偏高，氣候濕潤，沙門菌易于生存，同時(shí)華南地區(qū)是鳥類遷徙的集散地，鳥類的遷徙活動促進(jìn)了沙門菌的傳播，這要求我們應(yīng)密切監(jiān)控華南地區(qū)沙門菌在食源中的流行情況。據(jù)報(bào)道，日、美等發(fā)達(dá)國家發(fā)生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙門菌引起的，其中主要病原為腸炎沙門菌。1989年3月世界衛(wèi)生組織專門召開了一次有關(guān)家禽及禽蛋中腸炎沙門菌污染問題的緊急國際會議。許少洪等[22]對廣州海珠地區(qū)2002—2011年人源感染沙門菌的血清型分布的研究表明，廣州市臨床人源感染的沙門菌中，腸炎沙門菌占據(jù)相當(dāng)大的比例。人源沙門菌感染的病例中大部分是由于攝入受污染的食物造成的，其中雞肉被認(rèn)為是沙門菌的主要載體[5]，因此密切關(guān)注廣州市雞肉中腸炎沙門菌的流行情況和耐藥情況，為保障廣州市的公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

通過對19株腸炎沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌對萘啶酸(100.0%)、磺胺復(fù)合物(79.0%)、氨芐西林(57.9%)嚴(yán)重耐藥，這與國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道基本一致[23-24]，原因可能在于這些傳統(tǒng)抗菌藥物長期以來被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中，加之不規(guī)范的用藥方法，抗菌藥物的選擇壓力使細(xì)菌產(chǎn)生了較高的耐藥性；對頭孢噻肟(15.8%)、頭孢他啶(5.3%)較為敏感，對頭孢吡肟、環(huán)丙沙星表現(xiàn)為完全敏感，這表明三代頭孢和氟喹諾酮類藥物對腸炎沙門菌仍具有較好的抑制殺滅效果，我們在選擇用藥時(shí)可以參考。

抗生素靶位編碼基因突變導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的空間構(gòu)型與理化性質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而致使藥物的結(jié)合作用下降或消失而產(chǎn)生耐藥性是常見的耐藥機(jī)制[25]。沙門菌對喹諾酮類藥物的耐藥性主要與其細(xì)胞中QRDRs基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的突變有關(guān)[26]。本試驗(yàn)中，通過對QRDRs基因檢測發(fā)現(xiàn)，100%腸炎沙門菌至少有一個QRDRs亞單位發(fā)生基因位點(diǎn)突變，值得注意的是，本試驗(yàn)中腸炎沙門菌對萘啶酸的耐藥率為100%，QRDRs的突變結(jié)果與沙門菌對喹諾酮類藥物的耐藥結(jié)果具有高度的一致性。細(xì)菌對喹諾酮類的敏感性主要由作用靶位決定，主要靶位的點(diǎn)突變可引起細(xì)菌對喹諾酮類敏感性的降低，多個點(diǎn)突變或同時(shí)存在次要靶位的突變使耐藥程度進(jìn)一步上升[25]。與此同時(shí)，耐藥質(zhì)粒也是導(dǎo)致沙門菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制[27-28]，它們可以通過接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在不同的細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生低水平耐藥。本試驗(yàn)中qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD均未被檢出，qepA的檢出率為5.3%，qepA基因被認(rèn)為是新的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥的分子機(jī)制，可通過外排泵機(jī)制介導(dǎo)細(xì)菌對親水性喹諾酮類藥物的耐藥性[29]，為腸炎沙門菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性創(chuàng)造了潛在的條件。分析QRDRs和PMQR的檢測結(jié)果，可以推測：QRDRs位點(diǎn)突變導(dǎo)致細(xì)菌合成氨基酸的改變進(jìn)而引起合成蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型與理化性質(zhì)發(fā)生變化是本試驗(yàn)中腸炎沙門菌對萘啶酸完全耐藥的重要原因。

沙門菌通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，水解β內(nèi)酰胺環(huán)使藥物失活，是沙門菌對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。本試驗(yàn)中，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出率為42.1%，這與馮彩峰[30]之前報(bào)道的結(jié)果基本一致。結(jié)合表4分析發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因的檢出結(jié)果與腸炎沙門菌對氨芐西林的耐藥結(jié)果高度一致(100%)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的攜帶為菌株耐受三代頭孢類藥物創(chuàng)造了潛在條件，這給我們在生產(chǎn)用藥中以警示。整合子在整合酶的催化下，通過特異性結(jié)合位點(diǎn)捕獲外源基因(特別是耐藥基因)并使之表達(dá)，同時(shí)整合子又可整合到質(zhì)?；蛉旧w上，或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個組成部分而參與轉(zhuǎn)移，使耐藥基因在同種和不同種屬細(xì)菌間廣泛傳播[31]。本試驗(yàn)中，Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類整合子的檢測結(jié)果均為陰性，這與前面所介紹的喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的低檢出率相互印證。

4 結(jié) 論

廣州地區(qū)雞肉中沙門菌的污染率高，血清型類型復(fù)雜。腸炎沙門菌仍是目前重要的血清型，對傳統(tǒng)抗生素的耐藥情況較為嚴(yán)重，對頭孢吡肟、環(huán)丙沙星等藥物完全敏感，喹諾酮耐藥決定區(qū)基因(QRDRs)突變結(jié)果和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出結(jié)果與腸炎沙門菌的耐藥結(jié)果高度一致。

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