槲皮素對(duì)大鼠肝和空腸P-糖蛋白表達(dá)及外排功能的影響

何 方，Bhutto Zohaib，郭 荔，王麗平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)家族(ATP-binding cassette transporter)的重要成員，含有12個(gè)跨膜區(qū)，每6個(gè)形成1個(gè)疏水性跨膜域，另外還含有2個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核苷酸結(jié)合域，可借助ATP水解提供的能量將外源化合物泵出胞外[1]。P-gp不僅可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，而且在人和動(dòng)物的肝、腎和小腸等組織中均有表達(dá)，分布廣泛，限制了外源化合物的吸收和體內(nèi)分布[2]。因其對(duì)部分藥物的體內(nèi)過(guò)程產(chǎn)生作用，可導(dǎo)致藥物的生物利用度發(fā)生變化或介導(dǎo)藥物間的相互作用，故近年來(lái)引起了眾多藥劑學(xué)研究者的關(guān)注，相關(guān)研究也已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3]。P-gp的表達(dá)和功能可受眾多外源化合物的影響，如L. Jetté等[4]研究發(fā)現(xiàn)SDZ-PSC 833 (PSC)可以通過(guò)改變藥物結(jié)合位點(diǎn)的方式消除環(huán)孢霉素A和維拉帕米對(duì)小鼠組織P-gp功能的影響。T. Chen 等[5]在乳腺癌MCF-7細(xì)胞的研究上發(fā)現(xiàn)，達(dá)沙替尼可以通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路，下調(diào)P-gp表達(dá)，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果。近年來(lái)還有些結(jié)果顯示一些中草藥或植物成分對(duì)P-gp的表達(dá)和功能也有顯著影響。如薩礎(chǔ)拉等[6]采用大鼠外翻腸囊模型研究了三七皂苷有效組分中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的P-gp底物轉(zhuǎn)運(yùn)特性并可競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp底物外排。安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚對(duì)P-gp的外排功能有明顯抑制作用，可顯著促進(jìn)Caco-2細(xì)胞對(duì)Rho-123的攝取[7]。

槲皮素，又名櫟精，廣泛存在于眾多植物的花、葉和果實(shí)中，是一種具有生物活性的多羥基黃酮類(lèi)化合物[8]。研究顯示槲皮素具有較多的生物功能，不僅具有抗腫瘤活性[9]，還具有防輻射、保護(hù)心血管[10]和抗病毒[11-12]等直接作用。尤其近年來(lái)一系列的試驗(yàn)證實(shí)槲皮素對(duì)腫瘤細(xì)胞P-gp的表達(dá)和功能產(chǎn)生影響，如鐘華等[13]證實(shí)較高濃度的槲皮素(100 μmol·L-1)可下調(diào)K562/A02細(xì)胞mdr1基因的表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。單保恩等[14]的研究顯示槲皮素能通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因mdr1及其編碼蛋白P-gp的表達(dá)，增加人子宮內(nèi)膜癌耐藥細(xì)胞B-MD-C1(ADR+/+)內(nèi)ADM的濃度，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的效果。但也有研究結(jié)果顯示低劑量的槲皮素可顯著誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)從而影響P-gp底物藥物的體內(nèi)過(guò)程[15]上述體外細(xì)胞研究結(jié)果提示槲皮素可以影響P-gp的表達(dá)和功能，但是與處理劑量相關(guān)，表現(xiàn)出雙相作用。自然界多種植物中均含有槲皮素，故當(dāng)植物性飼料用于動(dòng)物時(shí)，是否會(huì)對(duì)動(dòng)物的代謝和吸收器官(肝和小腸)中的P-gp產(chǎn)生作用從而影響P-gp底物藥物的生物利用度或介導(dǎo)藥物間相互作用的發(fā)生尚不清楚?；诖?，本試驗(yàn)首先以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠為研究模型，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步探討槲皮素對(duì)動(dòng)物組織中P-gp表達(dá)和功能的影響，進(jìn)一步挖掘其介導(dǎo)藥物間相互作用的理論基礎(chǔ)，該研究結(jié)果可為獸醫(yī)臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物

RNAisoTMPlus，Prime ScriptTMKit，SYBR Premix(TaKaRa)；乙腈(TEDIA，色譜純)、三乙胺(Enox，分析純)，伊維菌素(SIGMA)，槲皮素(上海紫一試劑廠， ZY140216)，ATPase試劑盒(南京建成A070-1)，ATP含量測(cè)定試劑盒(碧云天，S0026)。Kreb-Ringer′s灌流液制備：7.8 g NaCl，0.35 g KCl，1.37 g NaHCO3，0.02 g MgCl2，0.22 g NaH2PO4和1.48 g葡萄糖溶解1 000 mL三蒸水中，用1 mol·L-1HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH至6.5。伊維菌素腸道灌流液：用Kreb-Ringer′s配制濃度5 μg·mL-1進(jìn)行灌流。

1.2 細(xì)胞及其處理分組

Caco-2 細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)條件為 37 ℃，5% CO2，95% 濕度，于本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)保存。

Caco-2細(xì)胞復(fù)蘇，經(jīng)傳代培養(yǎng)長(zhǎng)至致密單層時(shí)，分為對(duì)照組和處理組共7組。其中處理組細(xì)胞分為用低濃度槲皮素(5 μmol·L-1)和高濃度槲皮素(25 μmol·L-1)分別處理6、12和24 h。于各時(shí)間點(diǎn)收集樣品后用于后續(xù)ATPase活性分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠，40日齡，體重(280±20)g，購(gòu)自江蘇南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖基地，適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后用于試驗(yàn)。動(dòng)物分組及處理見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組與處理方法

Table 1 The groups and treatment of the animals in this study

組別Group動(dòng)物數(shù)/只Animalnumber處理Treatment生理鹽水對(duì)照組Normalsalinegroup6早、晚兩次灌服,連續(xù)15d15mg·kg-1槲皮素處理組115mg·kg-1quercetintreatmentgroup16早、晚兩次灌服,連續(xù)5d15mg·kg-1槲皮素處理組215mg·kg-1quercetintreatmentgroup26早、晚兩次灌服,連續(xù)15d60mg·kg-1槲皮素處理組160mg·kg-1quercetintreatmentgroup16早、晚兩次灌服,連續(xù)5d60mg·kg-1槲皮素處理組260mg·kg-1quercetintreatmentgroup26早、晚兩次灌服,連續(xù)15d

1.4 槲皮素處理對(duì)大鼠肝和空腸mdr1、PXR和CAR mRNA及P-gp表達(dá)的影響

1.4.1 Real-time RT-PCR檢測(cè)大鼠空腸和肝中mdr1a、mdr1b、PXR和CARmRNA表達(dá)量 槲皮素處理組大鼠分別處理5和15 d后斷頭處死。取空腸和肝組織置于-80 ℃保存。取100 mg組織用組織破碎儀進(jìn)行破碎，按照說(shuō)明書(shū)用Trizol法提取組織總RNA。測(cè)定樣品OD260 nm/OD280 nm比值，確定RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＠胮remier 5.0軟件設(shè)計(jì)大鼠mdr1a、mdr1b、PXR、CAR和看家基因Gapdh引物序列(由上海捷瑞生物公司合成)。參照SYBR Premix ExTaqTM說(shuō)明書(shū)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)上述基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果采用相對(duì)定量分析，用ΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表2。

表2 熒光定量 PCR基因引物序列

Table 2 Primers used in real-time RT-PCR

基因Gene引物(5'-3')Primer引物(3'-5')Primermdr1aAGGCAATGGCAACATTTTTTGGTGGGATAAGCAGAAAAGCTGCACCCATGmdr1bAGTCCATAACGACATTTTCAGCCGGGACCAACAGGTAGGCAATACCTATGGapdhCAGTATGATTCTACCCACGGCAGATCCACAACGGATACATCARCAGCCTGCAGGTTGCAGAAGTTCCACAGCCGCTCCCTTGAPXRTCCACTGCATGCTGAAGAAGAACCTGTGTGCAGGATAGGG

1.4.2 Western blot法檢測(cè)肝和空腸P-gp蛋白表達(dá)水平 取100 mg肝和空腸組織剪碎，加入RIPA裂解液，用組織勻漿器勻漿至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)組織塊。4 ℃，10 000 r·min-1條件下離心15 min。將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，得到組織總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，加入Loading Buffer煮沸5 min，得到蛋白質(zhì)樣品并保存。按照不同蛋白質(zhì)濃度上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉2 h，4 ℃ 一抗孵育過(guò)夜，然后室溫二抗孵育1 h，曝光。Image J軟件分析蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.4.3 SABC免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝和空腸P-gp的定位和蛋白質(zhì)表達(dá) 各組大鼠處死后迅速采集肝和空腸組織。用生理鹽水沖洗血液及腸道內(nèi)容物后，放入4%多聚甲醛中固定超過(guò)48 h。常規(guī)制備5 μm厚石蠟切片(載玻片預(yù)先用APES 處理)，37 ℃恒溫箱中過(guò)夜烘干，冰箱中保存。按照試劑盒步驟進(jìn)行SABC免疫組織化學(xué)方法染色，將切片常規(guī)脫蠟至水，用3% H2O2于室溫作用15 min，進(jìn)行抗原熱修復(fù)后用5% BSA封閉。用稀釋過(guò)的P-gp抗體于4 ℃孵育過(guò)夜，用PBS洗滌，二抗繼續(xù)孵育45 min，用PBS洗滌干凈。滴加SABC 于37 ℃作用30 min 后進(jìn)行DAB顯色，用蘇木素輕度復(fù)染。保存切片并用顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.5 槲皮素對(duì)伊維菌素的大鼠空腸滲透性的影響

1.5.1 大鼠空腸單向在體灌流模型的建立 參考I. Lozoya-Agullo等[16]的質(zhì)量差法略作修改，建立大鼠空腸單向在體灌流方法。對(duì)照組和槲皮素預(yù)處理15 d組的大鼠，腹腔注射40%的烏拉坦溶液(0.5 mL·kg-1，按體重給藥)進(jìn)行麻醉。待大鼠麻醉后將其固定于手術(shù)臺(tái)上。于左側(cè)后腹部打開(kāi)腹腔2～3 cm，精確量取10 cm空腸腸段作為灌流腸段。沿空腸腸生理蠕動(dòng)方向插入并結(jié)扎供液和收液灌流管。用K-R緩沖液(37 ℃)以0.2 mL·min-1沖洗腸段約30 min后，更換含有伊維菌素的K-R灌流液平衡30 min。平衡后，每隔15 min更換一次已知質(zhì)量的供液管和集液管，試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為105 min。最后，將大鼠處死，剪下灌流腸段，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑，同時(shí)精確稱(chēng)量供液瓶和集液管的質(zhì)量，迅速將收集的灌流樣品于-20 ℃保存至待測(cè)。

1.5.2 樣品處理 將樣品在4 ℃融化，渦旋混勻，取200 μL 12 000 r·min-1離心20 min過(guò)濾后，取100 μL上清加入樣品瓶中待測(cè)。

1.5.3 伊維菌素HPLC方法建立 參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010版[17]方法，采用高壓液相方法測(cè)定伊維菌素濃度。色譜條件如下，色譜柱：XDB-C18柱(5 μm，25 cm × 4.6 mm，Agilent)；檢測(cè)波長(zhǎng)：紫外檢測(cè) 254 nm；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=50∶41∶9；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.5.4 伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢測(cè)限和定量限的測(cè)定 將空白K-R灌流液12 000 r·min-1，離心20 min后，取上清。配制濃度為2、2.5、5、10、12.5、20、25、50、100 μg·mL-1的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度設(shè)有5個(gè)平行重復(fù)。以伊維菌素濃度(X)對(duì)峰面積(Y)計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及回歸方程。以信噪比S/N>3時(shí)伊維菌素的濃度為檢測(cè)限，以信噪比S/N>10時(shí)伊維菌素的濃度為定量限。

1.5.5 計(jì)算伊維菌素吸收速率常數(shù)(Ka)和藥物表觀滲透系數(shù)(Papp)Ka和Papp分別采用下述公式進(jìn)行計(jì)算：

式中Qin和Qout分別為空腸進(jìn)出口灌流液的體積(mL)；Cin和Cout分別為空腸進(jìn)出口灌流液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；Q為灌流速度(0.2 mL·min-1)；V為灌流腸段的容積；r和l分別為腸段的半徑和長(zhǎng)度(cm)；計(jì)算藥物Ka和Papp。

1.6 槲皮素對(duì) Caco-2細(xì)胞ATPase活性的影響

按“1.2”中所示方法處理細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS洗3遍。用細(xì)胞刮直接將細(xì)胞刮下，然后細(xì)胞懸液冰水浴超聲破碎：功率300 W，3～5 s·次-1，間隔30 s，重復(fù)3～5次。取制備好的勻漿液按照ATPase試劑盒(南京建成)說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和ATP酶活性。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對(duì)大鼠組織mdr1a、mdr1b、PXR和CAR mRNA表達(dá)量的影響

2.1.1 槲皮素對(duì)大鼠肝組織mdr1a、mdr1b、PXR和CARmRNA表達(dá)量影響 結(jié)果如圖1所示。大鼠經(jīng)60 mg·kg-1槲皮素處理5和15 d后，肝中mdr1a和mdr1b mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高；經(jīng)15 mg·kg-1的槲皮素處理15 d后，mdr1a和mdr1b mRNA表達(dá)量極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)升高，但處理5 d時(shí)mdr1a和mdr1b mRNA表達(dá)量均未見(jiàn)顯著變化(P>0.05)。槲皮素處理大鼠的PXRmRNA表達(dá)量比對(duì)照組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高，高劑量槲皮素長(zhǎng)時(shí)間處理后，CARmRNA表達(dá)量較對(duì)照組變化則更為顯著。經(jīng)相關(guān)性分析，肝mdr1a、mdr1b和CARmRNA表達(dá)量之間存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)。

與對(duì)照組比較，*. P<0.05; **.P<0.01Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01圖1 槲皮素對(duì)大鼠肝組織mdr1a、mdr1b、PXR和CAR mRNA表達(dá)量影響Fig.1 mdr1a，mdr1b，PXR and CAR mRNA expression in rats liver after treated by quercetin

2.1.2 槲皮素對(duì)大鼠空腸組織mdr1a、mdr1b、PXR和CARmRNA表達(dá)量影響 60 mg·kg-1槲皮素預(yù)處理大鼠，空腸組織的mdr1a、mdr1b和CARmRNA表達(dá)量均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高。而當(dāng)槲皮素處理濃度高達(dá)60 mg·kg-1處理15 d后，空腸中PXRmRNA表達(dá)量才會(huì)顯著上升(P<0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析，空腸mdr1a、mdr1b和CARmRNA表達(dá)量之間存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)果如圖2所示。

2.2 槲皮素對(duì)大鼠肝和空腸組織P-gp蛋白表達(dá)量影響

上述結(jié)果顯示60 mg·kg-1的槲皮素對(duì)各基因的mRNA表達(dá)量影響較大，故研究蛋白質(zhì)水平變化時(shí)采用該劑量進(jìn)行分析。結(jié)果表明槲皮素處理大鼠5 d后，肝和空腸P-gp蛋白表達(dá)量就會(huì)顯著上升(P<0.05)，處理時(shí)間延長(zhǎng)至15 d時(shí)，肝和空腸P-gp蛋白表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)。蛋白質(zhì)水平的變化與上述mRNA水平變化一致。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 槲皮素對(duì)P-gp在大鼠肝和空腸中定位的影響

免疫組化結(jié)果顯示，槲皮素處理并未改變P-gp 在肝和空腸中的定位，但對(duì)其蛋白的表達(dá)量產(chǎn)生顯著影響。如圖4A～C所示，P-gp在肝主要定位于肝細(xì)胞間的膽小管膜上；如圖4D～F所示，在大鼠空腸主要分布于小腸絨毛上皮細(xì)胞頂端和小腸腺靠近腔面細(xì)胞的頂端。

用Imagepro-plus 軟件，以Area 和IOD作為衡量表達(dá)量的指標(biāo)，對(duì)對(duì)照組和槲皮素處理組的肝和空腸P-gp表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。結(jié)果如圖4G、H所示。與對(duì)照組相比，15 mg·kg-1槲皮素處理大鼠15 d后，可極顯著增加肝中P-gp的表達(dá)量(P<0.01)，且作用強(qiáng)于高劑量的槲皮素；60 mg·kg-1槲皮素處理組可極顯著增加P-gp在空腸的表達(dá)量(P<0.01)，作用較15 mg·kg-1的槲皮素更強(qiáng)，結(jié)果與肝存在一定差異?？傮w來(lái)講，免疫組化方法檢測(cè)的肝和空腸組織中P-gp表達(dá)變化與Western blot的結(jié)果相一致，再次證實(shí)一定劑量的槲皮素可誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)。

與對(duì)照組比較，*. P<0.05; **.P<0.01Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01圖2 槲皮素對(duì)大鼠空腸組織mdr1a、mdr1b、PXR和CAR mRNA表達(dá)量影響Fig.2 mdr1a，mdr1b，PXR and CAR mRNA expression in rats jejunum after treated by quercetin

與對(duì)照組比較，*. P<0.05; **.P<0.01Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01圖3 60 mg·mL-1槲皮素對(duì)大鼠肝和空腸組織P-gp蛋白表達(dá)量影響Fig.3 P-gp expression in rat liver and jejunum after treated by 60 mg·mL-1 quercetin

2.4 槲皮素對(duì)伊維菌素在大鼠小腸滲透性的影響

2.4.1 伊維菌素的色譜行為和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 采用上述方法中色譜條件，測(cè)定空白K-R灌流液，在0～20 min內(nèi)基線(xiàn)平穩(wěn)且無(wú)干擾峰出現(xiàn)，添加20 μg·mL-1伊維菌素后，可檢測(cè)到目標(biāo)峰，峰形良好，無(wú)干擾峰，平均保留時(shí)間約為16.18 min。以峰面積(A)對(duì)藥物濃度(C, μg·mL-1)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到伊維菌素的線(xiàn)性回歸方程：y= 0.357 3x+ 0.128 9。在該檢測(cè)條件下，濃度與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，R2=0.999。檢測(cè)限為2 μg·mL-1，定量限為2.5 μg·mL-1。

2.4.2 大鼠空腸中伊維菌素濃度變化 取經(jīng)60 mg·kg-1槲皮素處理15 d的大鼠進(jìn)行空腸單向在體灌流試驗(yàn)。結(jié)果可見(jiàn)處理組收集液中伊維菌素濃度較對(duì)照組有增加趨勢(shì)，如圖5所示。伊維菌素的吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)見(jiàn)表3。與空白對(duì)照組相比，伊維菌素的Ka未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，但Papp顯著下降(P<0.05)。

A. 對(duì)照組大鼠肝；B. 15 mg·kg-1 槲皮素處理組大鼠肝；C. 60 mg·kg-1槲皮素處理組大鼠肝；D. 對(duì)照組大鼠空腸；E. 15 mg·kg-1槲皮素處理組大鼠空腸；F. 60 mg·kg-1槲皮素處理組大鼠空腸；G、H. 大鼠肝和空腸組織中P-gp的半定量分析。與對(duì)照組比較，*. P<0.05; **. P<0.01A. Liver of control rats；B. Liver of rats treated by 15 mg·kg-1 quercetin；C. Liver of rats treated by 60 mg·kg-1 quercetin; D. Jejunum of control rats；E. Jejunum of rats treated by 15 mg·kg-1 quercetin；F. Jejunum of rats treated by 60 mg·kg-1 quercetin; G and H. Semi-quantification of P-gp in rats liver and jejunum, respectively. Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01 圖4 大鼠肝和空腸中P-gp的定位及表達(dá)量分析Fig.4 Immunohistochemical staining for P-gp in the rats liver and jejunum

圖5 大鼠空腸灌流液中伊維菌素的濃度變化曲線(xiàn)Fig.5 Effect of quercetin on ivermectin concentration in rats jejunum

參數(shù)Parameters對(duì)照組Control槲皮素組(60mg·kg-1,15d)Quercetingroup吸收速率常數(shù)/(min-1)Ka0.0294±0.02560.0233±0.0256表觀滲透系數(shù)/(cm·min-1)Papp0.0275±0.04400.0184±0.0680*

與對(duì)照組相比，*.P<0.05差異顯著

Compared with control，*.P<0.05

2.5 槲皮素對(duì)Caco-2細(xì)胞ATP酶活性的影響

按“1.2”中所述方法對(duì)Caco-2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，檢測(cè)槲皮素對(duì)Caco-2細(xì)胞ATP酶活性的影響。結(jié)果如圖6所示，不同濃度的槲皮素處理6、12和24 h 后均可極顯著增加Caco-2細(xì)胞的ATP酶活性(P<0.01)，且存在一定的劑量依賴(lài)性。

**. P<0.01圖6 槲皮素對(duì)Caco-2細(xì)胞ATP酶活性影響Fig.6 Effect of quercetin on Caco-2 ATPase

3 討 論

槲皮素是一種來(lái)源廣泛的黃酮類(lèi)化合物，常被用于食品中的抗氧化劑。研究顯示，槲皮素具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化的作用[18-19]。對(duì)MCF-7細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素還具有阻滯細(xì)胞周期的作用，并可通過(guò)線(xiàn)粒體通路激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡等[20]。有研究顯示槲皮素可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，若通過(guò)抑制MDR1 mRNA的表達(dá)而抑制P-gp的表達(dá)，可以提高細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物濃度，改善化療療效[21]。但有研究稱(chēng)槲皮素對(duì)P-gp的調(diào)節(jié)有雙向作用，表現(xiàn)為高劑量抑制作用，而低劑量為誘導(dǎo)作用，可能與其不同的作用位點(diǎn)、底物及濃度有關(guān)[22]。但上述研究?jī)H限于體外細(xì)胞，且主要探討其在腫瘤細(xì)胞耐藥方面的作用及其機(jī)制，未涉及其在口服藥物吸收和藥物間相互作用方面的影響。因槲皮素在植物中存在廣泛，故植物源性飼料中存在的槲皮素若長(zhǎng)期給予動(dòng)物后是否會(huì)引起動(dòng)物不同組織中P-gp的表達(dá)和功能發(fā)生變化，并進(jìn)一步影響到口服藥物的吸收和藥物間相互作用發(fā)生，仍未進(jìn)行系統(tǒng)研究。故本試驗(yàn)首先以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠為研究對(duì)象，初步探討了槲皮素對(duì)大鼠肝和空腸中P-gp表達(dá)和功能的影響，為臨床合理用藥提高口服藥物的生物利用度和避免藥物間相互作用提供一定參考，并為后續(xù)在養(yǎng)殖動(dòng)物中開(kāi)展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，故具有較好的理論和臨床實(shí)踐指導(dǎo)意義。

嚙齒動(dòng)物中，P-糖蛋白由mdr1的兩個(gè)亞型mdr1a和mdr1b編碼[23]。核受體——孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)和組成型雄甾烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)是調(diào)節(jié)P-gp表達(dá)的重要因子[24-25]。研究表明mdr1的啟動(dòng)子上含有DR4/ER6應(yīng)答元件，可以被PXR/RXR二聚體識(shí)別結(jié)合，從而調(diào)控mdr1基因的表達(dá)[26-27]。還有研究顯示與PXR類(lèi)似的CAR也可與mdr1基因增強(qiáng)子上不同核受體反應(yīng)元件相結(jié)合進(jìn)而激活mdr1的轉(zhuǎn)錄，而外源性化合物即可通過(guò)激活PXR或CAR通路調(diào)控mdr1的轉(zhuǎn)錄[28]。本研究采用real-time RT-PCR、免疫組化和Western blot方法證實(shí)槲皮素會(huì)導(dǎo)致大鼠肝和空腸P-gp在mRNA和蛋白質(zhì)水平均發(fā)生顯著上調(diào)的現(xiàn)象，并且其在mRNA水平的變化與CARmRNA的上調(diào)表達(dá)存在較為顯著的相關(guān)作用，佐證了前人的研究結(jié)果，即外源性化合物可以通過(guò)激活核受體調(diào)控mdr1的表達(dá)。但因本試驗(yàn)中未篩選到有效的CAR和PXR抗體，故對(duì)大鼠肝和空腸中PXR和CAR蛋白表達(dá)水平未能進(jìn)行檢測(cè)。后續(xù)研究中，將繼續(xù)選擇有效抗體或利用PXR和CAR抑制劑在此方面進(jìn)行深入研究。

P-gp蛋白為ATP依賴(lài)性外排蛋白，其外排功能的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于ATP水解提供的能量，所以本試驗(yàn)又進(jìn)一步探究了槲皮素對(duì)ATP酶活性的影響。本試驗(yàn)初期擬檢測(cè)槲皮素對(duì)大鼠腸組織中ATP酶活性的影響，但在測(cè)定中發(fā)現(xiàn)體內(nèi)影響因素較多，未能取得較好的試驗(yàn)結(jié)果，而Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)條件下，能分化形成致密的單分子細(xì)胞層，與小腸上皮的結(jié)構(gòu)和生化作用相似，不僅具有微絨毛結(jié)構(gòu)，還能表達(dá)多種蛋白載體和酶，也是FDA推薦用于研究P-gp外排功能及藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的優(yōu)秀細(xì)胞之一[29]，故本試驗(yàn)選擇了Caco-2細(xì)胞研究了槲皮素對(duì)其ATP酶活性的影響。結(jié)果也顯示不同濃度的槲皮素處理Caco-2細(xì)胞后，ATP酶活性均極顯著升高，由此提示槲皮素不僅可通過(guò)增加P-gp的表達(dá)，而且可通過(guò)提高ATP酶活性促進(jìn)ATP水解提供更多能量來(lái)協(xié)同增加P-gp對(duì)底物的外排功能，該現(xiàn)象也會(huì)通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

槲皮素可增加大鼠空腸P-gp的表達(dá)，但P-gp的外排功能是否也隨表達(dá)量增加而增強(qiáng)？為證實(shí)該假設(shè)，本研究又進(jìn)一步采用大鼠空腸單向在體灌流方法驗(yàn)證槲皮素處理大鼠對(duì)P-gp底物藥物滲透性的影響。已有研究顯示伊維菌素為P-gp的底物，如J. Griffin等[29]證實(shí)伊維菌素是人和犬P-gp的底物，M. B. Molento等[30]發(fā)現(xiàn)當(dāng)伊維菌素與P-gp抑制劑維拉帕米聯(lián)合用藥后，伊維菌素在山羊體內(nèi)的峰濃度Cmax顯著升高。故本試驗(yàn)選用伊維菌素作為P-gp底物進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示伊維菌素在空腸的Papp顯著下降，與槲皮素顯著增加空腸P-gp表達(dá)的結(jié)果非常一致，因此證實(shí)一定劑量的槲皮素不僅可增加P-gp的表達(dá)水平，同時(shí)可增加其外排功能。

4 結(jié) 論

采用real-time RT-PCR、免疫組化和Western blot方法證實(shí)槲皮素會(huì)導(dǎo)致大鼠肝和空腸P-gp在mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào)，并且其在mRNA水平的變化與CARmRNA的上調(diào)表達(dá)存在顯著的相關(guān)作用。槲皮素處理Caco-2細(xì)胞后，ATP酶活性均極顯著升高，單向在體腸灌流試驗(yàn)表明槲皮素處理大鼠對(duì)伊維菌素的腸滲透性顯著降低，提示槲皮素可通過(guò)提高ATP酶活性促進(jìn)ATP水解提供更多能量來(lái)協(xié)同增加P-gp對(duì)底物的外排功能。

[1] HENNESSY M, SPIERS J P. A primer on the mechanics of P-glycoprotein the multidrug transporter[J].PharmacolRes, 2007, 55(1): 1-15.

[2] XIE J, LI D W, CHEN X W, et al. Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1α and MDR1/P-glycoprotein in laryngeal carcinoma tissue and hypoxic Hep-2 cells[J].OncolLett, 2013, 6(1): 232-238.

[3] ZHANG Y C, ZHANG Y K, WANG Y J, et al. Esters of the marine-derived triterpene Sipholenol A reverse P-GP-mediated drug resistance[J].MarDrugs, 2015, 13(4): 2267-2286.

[4] JETTé L, MURPHY G F, BéLIVEAU R. Drug binding to P-glycoprotein is inhibited in normal tissues following SDZ-PSC 833 treatment[J].IntJCancer, 1998, 76(5): 729-737.

[5] CHEN T, WANG C Y, LIU Q, et al. Dasatinib reverses the multidrug resistance of breast cancer MCF-7 cells to doxorubicin by downregulating P-gp expression via inhibiting the activation of ERK signaling pathway[J].CancerBiolTher, 2015, 16(1): 106-114.

[6] 薩礎(chǔ)拉, 呂 航, 姜艷艷, 等. 三七皂苷在大鼠外翻腸囊中的吸收及與P-糖蛋白相互作用研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 34(12): 836-842. SA C L, LV H, JIANG Y Y, et al. Absorption of panax notoginseng saponins in rat everted gut sac and interaction between it and P-glycoprotein[J].JournalofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine, 2011, 34(12): 836-842. (in Chinese)

[7] 楊 洋, 王世祥, 房敏峰, 等. 安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚對(duì)P-糖蛋白功能的影響[J]. 中成藥, 2012, 34(7): 1364-1366. YANG Y, WANG S X, FANG M F, et al. The effects of benzoic aldehyde, vanillin and beta-siocin on P-glycoprotein function[J].ChineseTraditionalPatentMedicine, 2012, 34(7): 1364-1366. (in Chinese)

[8] BOOTS A W. Health effects of quercetin: from mechanism to nutraceutical[D]. Maastricht: Universitaire Pers Maastricht, 2006.

[9] VAN HOPPE S, SPARIDANS R W, WAGENAAR E, et al. Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) and P-glycoprotein (P-gp/ABCB1) transport afatinib and restrict its oral availability and brain accumulation[J].PharmacolRes, 2017, 120: 43-50.

[10] 林 蓉, 劉俊田, 李 旭, 等. 槲皮素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2000, 15(5): 304-305. LIN R, LIU J T, LI X, et al. Protection of vascular endothelial cells from hydrogen peroxide-induced injury by quercetin[J].ChineseCirculationJournal, 2000, 15(5): 304-305. (in Chinese)

[11] SCAMBIA G, PANICI P B, RANELLETTI F O, et al. Quercetin enhances transforming growth factor β1, secretion by human ovarian cancer cells[J].IntJCancer, 1994, 57(2): 211-215.

[12] BOERS F, DENG B L, LEMIRE G, et al. An improved synthesis of the anti-picornavirus flavone 3-O-methylquercetin [J].ArchPharm(Weinheim), 1997, 330(9-10):313-316.

[13] 鐘 華, 顧春紅, 滕 曄, 等. 槲皮素對(duì)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥基因及糖蛋白表達(dá)的影響[J]. 上海醫(yī)學(xué), 2004, 27(1): 20-21. ZHONG H, GU C H, TENG Y, et al. Study of the effect of quercetin on expression of multidrug resistant gene and protein in K562/A02 cells[J].ShanghaiMedicalJournal, 2004, 27(1): 20-21. (in Chinese)

[14] 單保恩, 楊俊玲. 槲皮素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌耐藥細(xì)胞株B-MD-C1(ADR+/+)多藥耐藥基因mdr1及P-gp蛋白表達(dá)的影響[J]. 癌變 畸變 突變, 2009, 21(5): 353-357. SHAN B E, YANG J L. Mechanisms of multidrug resistance reversal on B-MD-C1(ADR+/+)by quercetin[J].Carcinogenesis,Teratogenesis&Mutagenesis, 2009, 21(5): 353-357. (in Chinese)

[15] MITSUNAGA Y, TAKANAGA H, MATSUO H, et al. Effect of bioflavonoids on vincristine transport across blood-brain barrier[J].EurJPharmacol, 2000, 395(3): 193-201.

[16] LOZOYA-AGULLO I, ZUR M, BEIG A, et al. Segmental-dependent permeability throughout the small intestine following oral drug administration: single-passvs. Doluisio approach toin-siturat perfusion[J].IntJPharm, 2016, 515(1-2): 201-208.

[17] 張海燕, 鄔偉魁, 宋民憲, 等. 《中國(guó)藥典》2010年版藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)探討[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(11): 289-291. ZHANG H Y, WU W K, SONG M X, et al. Standard of pharmaceutical excipients in 《Chinese Pharmacopoeia》 2010 edition[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae, 2011, 17(11): 289-291. (in Chinese)

[18] 王 旭, 張 爽. 槲皮素對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖的抑制作用及機(jī)制[J]. 山東醫(yī)藥, 2010, 50(6): 12-14. WANG X, ZHANG S. Inhibitory effect and mechanism of quercetin on ovarian cancer cells Ho-8910 proliferation[J].ShandongMedicalJournal, 2010, 50(6): 12-14. (in Chinese)

[19] 張繼紅, 梁力建, 黃潔夫. bcl-2基因表達(dá)變化在槲皮素抑制肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)中的作用[J]. 中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2009, 16(6): 455-459. ZHANG J H, LIANG L J, HUANG J F. Role of bcl-2 gene expression in inhibiting the growth of hepatocellular carcinoma of nude mice by quercetin[J].ChineseJournalofBasesandClinicsinGeneralSurgery, 2009, 16(6): 455-459. (in Chinese)

[20] CHU C C, YANG J S, LU H F, et al. Quercetin-mediated cell cycle arrest and apoptosis involving activation of a caspase cascade through the mitochondrial pathway in human breast cancer MCF-7 cells[J].ArchPharmRes, 2010, 33(8): 1181-1191.

[21] 陳 華, 鄭 軍. 槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用及對(duì)耐藥基因和P-糖蛋白的影響[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2010, 7(9): 791-794. CHEN H, ZHENG J. The effect of quercetin on the inhibition of the growth of HepG2 and the expression of MDR1and P-gp[J].LaboratoryMedicineandClinic, 2010, 7(9): 791-794. (in Chinese)

[22] 翟鶯鶯, 周 蕾, 賴(lài)永洪. 槲皮素抗腫瘤作用的研究[J]. 現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志, 2005, 11(1): 18-20. ZHAI Y Y, ZHOU L, LAI Y H. Research of quercetin on Antitumour activit[J].JournalofModernClinicalMedicalBioengineering, 2005, 11(1): 18-20. (in Chinese)

[23] 劉正清, 姚啟盛, 楊 勇, 等. 靶向mdr1b/mdr1a基因siRNA逆轉(zhuǎn)T24/ADM多藥耐藥性研究[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 18(7): 865-868. LIU Z Q, YAO Q S, YANG Y, et al. Effect of mdr1b/mdr1a siRNA on multidrug resistance of bladder carcinoma cell line T24/ADM[J].JournalofHainanMedicalUniversity, 2012, 18(7): 865-868. (in Chinese)

[24] WILLSON T M, KLIEWER S A, WILLSON T M, et al. Pxr, car and drug metabolism[J].NatRevDrugDiscov, 2002, 1(4): 259-266.

[25] YAN J, XIE W. A brief history of the discovery of PXR and CAR as xenobiotic receptors[J].ActaPharmSinB, 2016, 6(5): 450-452.

[26] SONODA J, PEI L M, EVANS R M. Nuclear receptors: decoding metabolic disease[J].FEBSLett, 2008, 582(1): 2-9.

[27] GONG H B, SINZ M W, FENG Y, et al. Animal models of xenobiotic receptors in drug metabolism and diseases[J].MethodsEnzymol, 2005, 400: 598-618.

[28] 王秀梅, 彭文興, 文曉柯. MDR1調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南, 2012, 10(30): 436-440. WANG X M, PENG W X, WEN X K. Progress in signal transduction mechanisms for transcriptional regulation of the MDR1 gene[J].GuideofChinaMedicine, 2012, 10(30): 436-440. (in Chinese)

[29] GRIFFIN J, FLETCHER N, CLEMENCE R, et al. Selamectin is a potent substrate and inhibitor of human and canine P-glycoprotein[J].JVetPharmacolTher, 2010, 28(3): 257-265.

[30] MOLENTO M B, LIFSCHITZ A, SALLOVITZ J, et al. Influence of verapamil on the pharmacokinetics of the antiparasitic drugs ivermectin and moxidectin in sheep[J].ParasitolRes, 2004, 92(2): 121-127.