缺氧誘導(dǎo)因子-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1和碳酸酐酶-Ⅸ在子宮內(nèi)膜癌患者中的作用

(安陽市婦幼保健院婦產(chǎn)科，河南 安陽 455000)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)達(dá)國家女性最常見的生殖器惡性腫瘤，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為2%～3%[1]。子宮內(nèi)膜癌自然病程緩慢，預(yù)后較好，臨床癥狀的早期出現(xiàn)使我們能夠在疾病的早期進(jìn)行診斷。子宮內(nèi)膜癌患者的5 a總生存率很高，在所有階段占80%以上，其中在第一階段占90%以上[2]。預(yù)后不良的患者，會受益于進(jìn)一步的輔助化療或放療。因此更多了解預(yù)測復(fù)發(fā)和(或)死亡的重要風(fēng)險(xiǎn)因素是非常有意義的。

目前公認(rèn)的子宮內(nèi)膜癌預(yù)后較差的因素是：臨床分期晚期、非子宮內(nèi)膜組織學(xué)亞型、高級別病變(G3)、子宮肌層深部侵犯(>50%)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮頸受累和淋巴血管間隔侵犯[2]。盡管近年來我們對腫瘤細(xì)胞的認(rèn)識有了很大的提高，但控制腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移形成過程的確切機(jī)制仍不清楚。

缺氧在癌變中起著重要作用。代謝重編程和基因表達(dá)的變化對于適應(yīng)氧可用性下降是必要的。腫瘤微環(huán)境中的缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)是能夠適應(yīng)缺氧環(huán)境的氧敏感轉(zhuǎn)錄因子。HIF是細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)的重要介質(zhì)，如代謝性、缺氧性和炎癥性。腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生代謝改變，部分是在缺氧和HIF調(diào)節(jié)下發(fā)生的。此外，低氧是繼發(fā)于低氧的炎癥信號和過濾清除了腫瘤進(jìn)展的驅(qū)動因素[3]。然而，盡管低氧在腫瘤微環(huán)境中的作用已被證實(shí)，但其在子宮內(nèi)膜癌中的意義還不完全清楚。HIF-1是哺乳動物幾乎所有核細(xì)胞氧平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3-4]。免疫組織化學(xué)研究[5]表明，許多惡性腫瘤的特征是與正常組織相比，HIF-1出現(xiàn)過度表達(dá)。對細(xì)胞氧水平變化的適應(yīng)主要由HIF-1的α亞單位決定。低氧條件下，活性因子HIF-1參與葡萄糖代謝、pH值、血管生成、細(xì)胞分化、遷移和轉(zhuǎn)移形成的調(diào)節(jié)[6]，腫瘤微環(huán)境中葡萄糖代謝由氧線粒體過程轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?Warburg效應(yīng))。HIF-1調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter，GLUT)中GLUT-1和GLUT-3的活性，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)葡萄糖的攝取[7]。GLUT-1的表達(dá)被缺氧以一種依賴于HIF-1α的方式調(diào)節(jié)[8]。碳酸酐酶-Ⅸ(carbonic anhydrase-Ⅸ，CA-Ⅸ)是另一個(gè)與HIF-1α活性相關(guān)的因素[9]。CA-Ⅸ對腫瘤微環(huán)境的影響以調(diào)節(jié)pH為特征。CA-Ⅸ的過度表達(dá)在許多腫瘤組織中觀察到，但在正常組織中沒有觀察到[10]。本研究的目的是驗(yàn)證HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ免疫組化測定蛋白作為子宮內(nèi)膜癌患者不良臨床病理特征預(yù)測因子的有效性，以及分析蛋白表達(dá)與患者生存的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料入組2013年1月至2017年12月期間我院收治的經(jīng)病理學(xué)確診的92例子宮內(nèi)膜癌患者，年齡37～84(65.1±9.5)歲，根據(jù)刮宮標(biāo)本對子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行診斷后，所有患者均行腹部子宮切除術(shù)、雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)，患者的基本臨床資料見表1。根據(jù)上述的風(fēng)險(xiǎn)因素，所有患者分為3組：低風(fēng)險(xiǎn)組：Ⅰa期、G1或G2期、子宮內(nèi)膜組織病理亞型；中風(fēng)險(xiǎn)組：Ⅰa期G3級、Ⅱ期和非子宮內(nèi)膜樣組織病理亞型；高風(fēng)險(xiǎn)組：非子宮內(nèi)膜樣組織病理亞型、Ⅰb期G3級、Ⅱ期和更高分型及分期。低風(fēng)險(xiǎn)組的患者術(shù)后不再接受任何進(jìn)一步的治療；中風(fēng)險(xiǎn)組術(shù)后5周接受近距離放療；高風(fēng)險(xiǎn)組接受遠(yuǎn)程放療和近距離放療；對10例非子宮內(nèi)膜組織病理亞型(化療包括卡鉑和紫杉醇)患者進(jìn)行輔助化療。

表1 子宮內(nèi)膜癌患者的一般資料

1.2方法檢測指標(biāo)應(yīng)用免疫組化S-P法，蠟塊均由病理科專業(yè)技術(shù)人員處理制備。實(shí)驗(yàn)操作步驟均按照操作說明嚴(yán)格進(jìn)行。主要試劑：鼠抗HIF-1α單克隆抗體(1100)；兔抗GLUT-1多克隆抗體(1200)和兔抗CA-Ⅸ多克隆抗體(11 500)。石蠟切片脫蠟水化，過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)中洗滌。滴加一抗，GLUT-1和CA-IX抗體在室溫下孵育30 min，HIF-1α在4 ℃條件過夜；以DAB(3-3-二氨基聯(lián)苯胺)為顯色劑，將抗原抗體復(fù)合物定位為棕色反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3免疫組化染色判斷蛋白的表達(dá)量根據(jù)2個(gè)參考進(jìn)行：1)根據(jù)細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，0分：陰性；1分：低染色；2分：適度染色；3分：強(qiáng)染色；2)陽性細(xì)胞或組織面積的百分比，0分：陰性；1分：<10%；2分：10%～<50%；3分：50%～<80%；4分：≥80%。

2 結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ蛋白表達(dá)子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α陽性表達(dá)率為96.74%，GLUT-1為100.00%，CA-Ⅸ為89.13%。不同臨床分期子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ的蛋白表達(dá)情況見圖1。

圖1 不同臨床分期子宮內(nèi)膜癌

2.2子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-IX蛋白表達(dá)量與其臨床病理特征之間的關(guān)系HIF-1α的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌的組織學(xué)亞型之間存在高度差異，HIF-1α的表達(dá)越高，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)越高(P<0.05)。見表2～4。

表2 子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α蛋白表達(dá)與其臨床病理特征之間的關(guān)系

表3 子宮內(nèi)膜癌組織中GLUT-1蛋白表達(dá)與其臨床病理特征之間的關(guān)系

表4 子宮內(nèi)膜癌組織中CA-Ⅸ蛋白表達(dá)與其臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ蛋白表達(dá)與其生存之間的關(guān)系的COX回歸分析結(jié)果單變量COX回歸分析顯示，組織學(xué)分級(G3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和侵犯子宮肌層>50%是子宮內(nèi)膜癌生存危險(xiǎn)因素；多變量COX回歸分析顯示，僅侵犯子宮肌層>50%是子宮內(nèi)膜癌生存危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5、6。

表5 COX單變量分析選擇的總生存率的預(yù)后因素

表6 COX多變量分析選擇的總生存率的預(yù)后因素

3 討論

缺氧在致癌過程中起著重要作用。然而，盡管低氧在腫瘤微環(huán)境中的作用已被證實(shí)，但其在子宮內(nèi)膜癌中的重要性還沒有得到很好的解釋。腫瘤的生長需要不斷增加的氧氣和營養(yǎng)素供應(yīng)，從而促進(jìn)新血管系統(tǒng)的發(fā)育。通常情況下，腫瘤細(xì)胞的生長往往先于血管的發(fā)育，而血管的發(fā)育是由低氧區(qū)的存在所反映出來的，這些區(qū)域位于腫瘤周圍，由于增殖增強(qiáng)，也位于其中心部位，血管的穿透不足[11]，缺氧誘導(dǎo)了HIF-1α的合成，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的改變。此外，隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞變得獨(dú)立于外部調(diào)節(jié)因子，并可遷移至供氧的不同區(qū)域，因此，假設(shè)HIF-1α的表達(dá)與抗腫瘤和治療有關(guān)，那么這種假設(shè)就會刺激對新型藥物的研究，這些藥物可以克服與HIF-1α過度表達(dá)相關(guān)的治療抵抗[12]。目前有人認(rèn)為，HIF-1α發(fā)揮救世主作用，使細(xì)胞發(fā)生缺氧。此外，研究[13]還發(fā)現(xiàn)，除缺氧外，高水平的HIF-1α也可能是由病毒癌基因刺激所致。

HIF-1α參與月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜修復(fù)，其表達(dá)增加與分泌期最相關(guān)，在其晚期有峰值表達(dá)的報(bào)道；此外，HIF-1α被發(fā)現(xiàn)是雌激素依賴性血管內(nèi)皮生長因子合成的共同激活因子[14]。

HIF-1α不僅可以調(diào)節(jié)正常子宮內(nèi)膜癌的血管生成，還可以在子宮肌層受到侵犯時(shí)釋放血管內(nèi)皮生長因子[14]。在動物模型中，低氧刺激與前列腺素受體結(jié)合，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長[15]。

HIF-1α通過調(diào)節(jié)p27kip細(xì)胞周期抑制劑參與子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展[16]。此外，HIF-1α基因多態(tài)性的存在與HIF-1α的穩(wěn)定性和持續(xù)激活有關(guān)。這種多態(tài)性在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中被記錄為一種新的突變。這種缺陷與較高的血管密度和腫瘤更大的生長潛力有關(guān)[16-17]。

激活人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路可使HIF-1α穩(wěn)定。編碼PTEN基因的突變增強(qiáng)了細(xì)胞增殖，增加了細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和復(fù)制。在正常的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，這些細(xì)胞是由自身再生引起的。相反，PTEN抑制性轉(zhuǎn)化功能的失活導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[18]。PTEN抑制基因編碼的蛋白質(zhì)是一種磷酸酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞膜脂質(zhì)的去磷酸化。此外，PTEN還作為蛋白激酶途徑的抑制劑，抑制了磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase , PI3K)的活性。約83%的子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)PTEN蛋白。PI3K/AKT/mTOR通路過度激活可導(dǎo)致肌腱損傷，導(dǎo)致腫瘤生長失控。在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)是酪氨酸激酶受體的主要失活途徑之一，如血管內(nèi)皮生長因子受體1、血小板衍生生長因子受體、表皮生長因子受體1和c-Met[19]。

目前，假設(shè)HIF-1α的表達(dá)增加，從正常子宮內(nèi)膜中觀察到的最小值到子宮內(nèi)膜增生和惡性腫瘤中記錄到的中、高水平。事實(shí)上，HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的臨床分期成比例增加同樣重要。HIF-1α表達(dá)的增加伴隨著血管緊張度的增加、血管生成的不穩(wěn)定；這意味著HIF-1α、血管生成和子宮內(nèi)膜癌之間的關(guān)系[20]。

我們的研究證實(shí)了HIF-1α在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，與子宮內(nèi)膜腫瘤相比，HIF-1α抗體在非子宮內(nèi)膜惡性腫瘤中的表達(dá)顯著增高。根據(jù)Bokhman的研究，HIF-1α的水平與Bokhman亞型 Ⅱ 型的存在顯著相關(guān)，與我們的發(fā)現(xiàn)與之前唯一一項(xiàng)分析依賴于Bokhman亞型的HIF-1α表達(dá)的研究結(jié)果相一致[21]。此外，在Bokhman亞型Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌患者中，HIF-1α的表達(dá)增加與不良預(yù)后因素的存在相關(guān)[21]。

此外，我們觀察到HIF-1α的表達(dá)與風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生率存在高度相關(guān)性，HIF-1α的高表達(dá)與中、高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系密切。單變量和多變量COX回歸分析顯示，HIF-1α蛋白的表達(dá)是Bokhman分型Ⅱ型的一個(gè)重要預(yù)測因子，并且與中、高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。以往關(guān)于HIF-1α腫瘤預(yù)后價(jià)值的研究結(jié)果既沒有結(jié)論性，也存在爭議。一些作者認(rèn)為，HIF-1α的高表達(dá)與較短的生存時(shí)間和復(fù)發(fā)時(shí)間有關(guān)；相反，其他研究者認(rèn)為HIF-1α與腫瘤患者的預(yù)后無關(guān)[21-22]。

值得注意的是，我們的研究表明，HIF-1α蛋白的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后較差的Bokhman分型Ⅱ型和更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)；這與有關(guān)研究[22]結(jié)果一致。

PTEN/mTOR通路參與子宮內(nèi)膜癌變刺激了對mTOR抑制劑的研究。在雷帕霉素衍生物替西羅莫司的第2階段研究中，有14%的子宮內(nèi)膜癌患者出現(xiàn)部分反應(yīng)，而有系統(tǒng)治療史的患者中有4%未接受過化療。此外，69%的既往未經(jīng)治療的患者和48%的化療后患者病情穩(wěn)定。然而，本研究并未揭示PTEN蛋白表達(dá)或PTEN基因突變與替西羅莫司治療結(jié)果之間的關(guān)系[23]。目前，其他mTOR抑制劑正在進(jìn)行先進(jìn)的子宮內(nèi)膜癌治療試驗(yàn)。

HIF-1α的表達(dá)會改變葡萄糖從有氧代謝到無氧代謝的過程。GLUT和碳酸氫酶參與了這種改變條件的適應(yīng)性。GLUT-1葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體也負(fù)責(zé)攝取這種糖。GLUT-1的表達(dá)在無氧條件下增加，引起代謝性脂肪分解。與此相反，GLUT-1的過度表達(dá)證實(shí)了各種腫瘤的發(fā)生，如食管癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌和乳腺癌[24]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，GLUT-1的表達(dá)也增加了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但是，GLUT-1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間并沒有顯著相關(guān)性，這一結(jié)論與以前的報(bào)道一致，根據(jù)這些報(bào)道我們發(fā)現(xiàn)，GLUT-1的存在是腫瘤轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[25]。正常子宮內(nèi)膜中缺少GLUT-1的表達(dá)，以及在癌前病變中的弱表達(dá)和子宮內(nèi)膜癌組織中的過度表達(dá)表明，GLUT-1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的早期可溶解。

CA-Ⅸ在缺氧誘導(dǎo)的糖酵解過程中起著重要的作用，在許多腫瘤中觀察到了CA-Ⅸ的過量表達(dá)，但在正常組織中卻沒有[10]。我們的研究證實(shí)了CA-Ⅸ在子宮內(nèi)膜癌微環(huán)境中的表達(dá)增加。然而，這種表達(dá)水平與腫瘤的臨床病理特征之間并沒有顯著相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn)與迄今發(fā)表的2項(xiàng)研究結(jié)果一致[26-27]。有文獻(xiàn)[26]證實(shí)了CA-Ⅸ在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織，并提示CA-Ⅸ參與了與腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)的葡萄糖代謝的轉(zhuǎn)移。然而，我們的研究結(jié)果表明，測定GLUT-1和CA-Ⅸ的表達(dá)對確定子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后沒有幫助。GLUT-1和CA-Ⅸ參與致癌的早期階段，這表明兩者在良性和惡性腫瘤之間的潛在應(yīng)用是不可區(qū)分的。

總之，HIF-1α在高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組及非子宮內(nèi)膜樣病理組織亞型中的重要作用表明，該因子的表達(dá)可能有助于輔助病理形態(tài)學(xué)檢查，有助于預(yù)測子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后。