miR-181a在老年急性心肌梗死血清中的表達及其臨床意義

丁學智，韓戰(zhàn)營，楊巧麗

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，高發(fā)于老年人，具有高致死率和致殘率等特點。近年來多項研究[1,2]指出，micro-RNA不僅在心肌梗死發(fā)病時發(fā)生顯著變化，而且參與調控心肌細胞的壞死和凋亡，是AMI重要生物標志物。

miR-181a位于人類染色體1q32.1位置上，以往關于其的研究主要集中在癌癥上，miR-181a不僅與癌細胞對化療藥物的敏感性有關[3]，且可以通過其對靶基因的直接作用對癌細胞的侵襲、遷移、增殖以及凋亡進行調控[4,5]。伊琳等[6]的一項研究發(fā)現，miR-181a不僅在自發(fā)性大鼠心肌組織中出現差異性表達，而且其表達與血管內皮因子信號通路的調控密切相關。此外，Das等[7]發(fā)現，miR-181家族成員可以通過調控下游細胞因子和線粒體相關蛋白的表達而對心肌功能產生影響。但是目前關于miR-181a在老年AMI患者血清中的表達的研究還鮮有報道，本文通過對比不同人群血清miR-181a的表達分析老年AMI血清miR-181a表達與心肌酶學指標的相關性，以揭示miR-181a在老年AMI患者的血清表達及其表達的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組 選取2016年1月～2017年3月于鶴壁市人民醫(yī)院心內科收治的老年AMI患者56例為AMI組，其中男性31例，女性25例，年齡60～79歲，平均年齡（69.7+6.5）歲；所有AMI患者均經心電圖、心肌酶學等檢查，符合世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的AMI診斷標準；同時選取我院健康體檢中心體檢的52例老年健康受試者（HE）作為HE組，其中男性27例，女性25例，年齡60～81歲，平均年齡（69.4±6.8）歲。排除標準：年齡＜60周歲、肝腎等器官功能障礙、慢性疾病、神經運動系統(tǒng)疾病、嚴重心律失常、心源性休克，未經治療死亡以及發(fā)病時間不詳或發(fā)病12 h內未采集血樣的患者。本次研究經醫(yī)院倫理協會批準通過，所有研究對象或其家屬均對本次研究內容知情同意。

1.2 血液收集和血清學指標 所有研究對象抽取靜脈血5～10 ml，加入EDTA后離心（1000×g）10 min（5810R，Eppendorf AG，Germany）收集血漿。應用免疫層析法試劑盒（鄂械注準20122401709，武漢明德生物，中國）檢測人血清心肌肌鈣蛋白（cTnI）。應用全自動生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S-180，Mindary，中國）檢測人血清谷草轉氨酶（AST）含量。

1.3 血清miR-181a的提取 以血漿/QIAzol溶解試劑（QIGEN，Germany）為1:5比例向血漿中加入QIAzol溶解試劑，室溫靜置15 min，然后根據miRNeasy血清/血漿試劑盒（QIGEN，Germany）中的方案提取RNA。最后，使用15ul DEPC水溶解總RNA。

1.4 實時熒光定量PCR 通過One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Japan）將提取的總RNA反轉錄成cDNA。PCR參數設置：37℃60 min，85℃ 5 s。

RT-qPCR：熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex TaqTM II（TakaRa，Japan）試劑盒，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，USA）進行擴增。 PCR參數設置：95℃ 30 s，40℃循環(huán)90℃ 5 s，65℃ 30 s。選擇U6作為內參照，通過2-△t法（△t = CTmiRNA-CTU6）計算miR-181a的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析方法 所有數據均采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，計數資料采用例數（構成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。使用Pearson法分析miR-181a相對表達量與AST和cTnI的相關性，miR-181a對老年AMI的診斷價值用受試者工作曲線（ROC）分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料對比 兩組患者在年齡、性別、體質指數（BMI）、吸煙比例、高血壓病史、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.2 血清miR-181a表達對比 RT-qPCR檢測兩組的血液miR-181a的相對表達量，結果顯示：miR-181a在AMI組的血清相對表達量為（1.18+0.30），顯著高于其在HE組的血清表達（1.60+0.27）（P＜0.05，圖1）。

2.3 miR-181a表達與AST和cTnI的相關性 在AMI組，miR-181a相對表達量與血清AST含量（r=0.647，P＜0.01）、血清cTnI含量（r=0.738，P＜0.01）呈正相關（圖2～3）。

2.4 miR-181a對老年AMI的預測價值 miR-181a的ROC曲線下面積（AUC）為0.842，其95%CI為0.770～0.914。當miR-181a在血清中的相對表達量為1.34時，Youden指數最大，因此miR-181a的診斷閾值為1.34，此時miR-181a診斷老年AMI的敏感性為83.9%，特異性為69.2%（圖4）。

3 討論

表1 兩組研究對象一般情況對比

圖1 miR-181a在老年AMI患者血清中高表達

圖2 AMI組患者血清miR-181a表達與AST的相關性

microRNA是一類在真核細胞中發(fā)現的、由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過其對靶基因轉錄的調控參與到真核細胞的分化、增殖、生長和凋亡的調解。在心血管疾病的中，miRNA不僅通過其對靶基因的調控而在心肌肥大、心肌壞死和凋亡中發(fā)揮著重要的作用，并且參與到AMI發(fā)病的每個過程[8-10]。同時由于miRNA在血液中異常的穩(wěn)定，并且對各種病理生理條件下表達差異明顯，是一種理想的疾病血液檢測生物標志物：Liu等[11]研究指出，血漿miR-1，miR-208和miR-499是漢人群AMI的潛在預測生物標志物。

本文研究發(fā)現，miR-181a在在老年AMI血清中的相對表達量顯著高于其在健康人血清中的表達P＜0.05）。Raut等[12]的研究指出，miR-181a和miR-30c在糖尿病性心肌病中呈現異常表達，并且表達失調的miR-181a和miR-30c協同靶向作用其共同的靶基因p53，進而通過p53-p21信號通路調控心肌細胞的肥大與凋亡。而關于AMI發(fā)病機制和致死機理的相關研究已經指出[8,13]，冠狀動脈內不穩(wěn)定的斑塊破裂后，引起的血小板活化而啟動的凝血級聯反應使得血液處于高凝狀態(tài)，這種處于高凝狀態(tài)血液極易形成栓塞而導致心肌缺血，最終導致心肌壞死或者凋亡。由此可以看出，miR-181a可能通過對心肌細胞凋亡的調節(jié)而參與到疾病的發(fā)生發(fā)展中。

圖3 AMI組患者血清miR-181a表達與cTnI的相關性

圖4 miR-181a對老年AMI的預測曲線

為進一步研究miR-181a在老年AMI患者血清中的表達與心肌細胞凋亡之間的關系，本文通過Peasrson法分析老年AMI患者血清中miR-181a的相對表達量與血清AST、cTnI的相關性，結果顯示：在老年AMI患者血清中，miR-181a相對表達量與血清AST含量（r=0.647，P＜0.01）、血清cTnI含量（r=0.738，P＜0.01）呈正相關。AST是一個與心肌細胞損傷、凋亡或者壞死密切相關的心肌酶，當發(fā)生心肌損傷或者壞死時，其在血清中的表達量將顯著升高。CTnI是心肌肌鈣蛋白的一個亞型，在正常生理情況下，外周血cTnI的表達量極低（0～0.3 ug/L），但當發(fā)生心肌梗死時在血液中的含量會在2～3 h內可檢測到升高，并在24～28 h內達到峰值，也正因為其對心肌損傷有高度敏感性和特異性，所以其是歐洲和美國的指南中所強調使用的診斷AMI的首選生物標志物[14]。由此可以看出，miR-181a與心肌損傷、壞死或者凋亡有關。同時，Das等[7]的發(fā)現也從另一個側面指出，miR-181a是通過對其下游靶基因的作用而參與到對心肌細胞的損傷、壞死或凋亡調解中。

miR-181a對老年AMI的預測分析顯示最佳界值為1.34，敏感性為83.9%，特異性為69.2%，AUC為0.842，其95%CI為0.770～0.914，提示miR-181a對老年AMI患者診斷具有一定價值[15]。

綜上所述，miR-181a在老年AMI患者血清中呈現高表達，并且其可能是診斷老年AMI潛在的生物標志物。

[1]王虹,林英忠. miRNA:急性心肌梗死治療新戰(zhàn)略標靶[J]. 中國老年學,2011,31(15):3000-2.

[2]Shyu KG,Wang BW,Cheng WP,et al. MicroRNA-208a Increases Myocardial Endoglin Expression and Myocardial Fibrosis in Acute Myocardial Infarction[J]. Canadian Journal of Cardiology,2015,31(5):679-90.

[3]金建華,陸文斌,鄧建忠,等. NSCLC患者血清miR-181a的表達變化及其與鉑類藥物化療敏感性的關系[J]. 山東醫(yī)藥,2013,53(47):18-20.

[4]Taylor MA,Sossey-Alaoui K,Thompson CL,et al. TGF-β upregulates miR-181a expression to promote breast cancer metastasis[J]. Journal of Clinical Investigation,2013,123(1):150-63.

[5]Hupé P,Robert T,Ripoche H,et al. miR-181a and miR-630 Regulate Cisplatin-Induced Cancer Cell Death[J]. Cancer Research,2010,70(5):1793-803.

[6]伊琳,陳蓓蓓,孫少伯,等. 當歸揮發(fā)油對自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中微小RNA差異表達譜的影響[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版),2016,42(4):671-5.

[7]Das S,Kohr M,Dunkerly-Eyring B,et al. Divergent Effects of miR-181 Family Members on Myocardial Function Through Protective Cytosolic and Detrimental Mitochondrial microRNA Targets[J].Journal of the American Heart Association, 2017,6(3):e004694.

[8]Yang T,Zhang G F,Chen XF,et al. MicroRNA-214 provokes cardiac hypertrophy via repression of EZH2[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2013, 436(4):578-84.

[9]陳沁,黃杰鳳,王浩,等. 微小RNA-214對慢性間歇低氧大鼠心肌細胞凋亡的影響及機制[J]. 中華醫(yī)學雜志,2015,95(16):1214-7.

[10]Rayner K,Dimmeler S,Calin GA,et al. Novel biomarkers for acute myocardial infarction: is microRNA the new kid on the block?[J].Clinical Chemistry,2014,60(6):812-7.

[11]Liu X,Fan Z,Zhao T,et al. Plasma miR-1, miR-208, miR-499 as potential predictive biomarkers for acute myocardial infarction: An independent study of Han population[J]. Experimental Gerontology,2015,72(8):230-8.

[12]Raut SK,Singh GB,Rastogi B,et al. miR-30c and miR-181a synergistically modulate p53-p21 pathway in diabetes induced cardiac hypertrophy[J]. Molecular & Cellular Biochemistry,2016,417(1-2):191.

[13]Yang T,Gu H,Chen X,et al. Cardiac hypertrophy and dysfunction induced by overexpression of miR-214 in vivo[J]. Journal of Surgical Research, 2014,192(2):317-25.

[14]Stone NJ,Robinson JG,Lichtenstein AH,et al. Treatment of blood cholesterol to reduce atherosclerotic cardiovascular disease risk in adults: synopsis of the 2013 American College of Cardiology/American Heart Association cholesterol guideline[J]. Annals of Internal Medicine,2014,160(5):339-43.

[15]王敬瀚. ROC曲線在臨床醫(yī)學診斷實驗中的應用[J]. 中華高血壓雜志,2008,16(2):175-7.