太婆梨果中揮發(fā)性香氣成分的SPME-GC/MS分析

張文君 王穎 杜紅霞 李慧冬 方麗萍 郭長英 丁蕊艷 毛江勝 陳子雷

摘要：本研究通過固相微萃取頭的選擇、方法可行性分析，建立了太婆梨果中揮發(fā)性香氣成分的固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用（SPME-GC/MS）檢測方法。以6 g帶皮太婆梨果切塊（0.5 cm×0.5 cm）為試材，在40℃恒溫萃取40 min，以2-壬酮為內(nèi)標，采用基質(zhì)標準曲線-內(nèi)標法定量分析太婆梨果中的揮發(fā)性香氣成分。結(jié)果顯示：在5～200 mg/L范圍內(nèi)，方法的線性關(guān)系良好，R2> 0.99，各物質(zhì)的最小檢出限均小于3.77×10-3 ?ng;在0.167 mg/kg添加水平下，各標準物質(zhì)的添加回收率為82.8%～101.7%，相對標準偏差為1.2%～8.4%，能夠滿足太婆梨果中香氣成分定性定量分析的要求。利用該方法，從太婆梨果中共檢出32種揮發(fā)性香氣成分（質(zhì)量分數(shù)大于5 ng/g），以酯類與烯烴類物質(zhì)為主。經(jīng)香氣值計算確定梨果可量化特征香氣物質(zhì)為乙酸己酯、乙酸丁酯、E-2-己烯醛、3-甲硫基丙酸乙酯。

關(guān)鍵詞：太婆梨;固相微萃取;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用;揮發(fā)性香氣成分

中圖分類號：S661.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）12-0053-06

太婆梨，又名笨梨，山東一帶稱之為“老媽子梨”、“麻子梨”，最早從英國引進，屬于西洋梨。但引進后經(jīng)過簡單的人工馴化，其性質(zhì)更接近于野梨，很多著名的梨種，如馳名中外的“萊陽梨”，都是由太婆梨馴化得到的。2007年以來，山東省出現(xiàn)一種改良后的太婆梨，其果皮較薄，果肉呈半透明的淡玉色，即食口感松軟，甜而不膩，具有獨特清香，且梨體

95%的部分可供食用，較改良之前更易保存，一經(jīng)面市，就廣受消費者的喜愛。果實香氣可以客觀反映果實的風味特性及成熟程度[1]，直接決定著果實及其加工品的品質(zhì)，顯著影響其市場競爭力，近年來受到大量學者的廣泛關(guān)注。

報道的梨果中香氣成分的研究以西洋梨居多，如：Bartlett梨風味獨特、香氣濃郁，癸烯酸酯類物質(zhì)是其果實中主要香氣物質(zhì)[2];Shiota對La Franee Pear成熟過程中揮發(fā)性成分變化的分析同樣指出，（2E，4Z）-癸二烯酸乙酯是其重要的風味組成成分[3];王傳增等[4]對不同用量1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）處理下“早紅考密斯”0℃貯藏后貨架期7 d的果實香氣成分進行分析，得出酯類是各處理中組分數(shù)和含量最大的香氣類別，并通過品質(zhì)與香氣種類變化確定最佳保鮮劑用量;劉松忠等[5]比較了西洋梨品種間風味物質(zhì)含量差異，發(fā)現(xiàn)紅考密斯、巴梨、康佛倫斯、三季梨4個品種中酯類芳香成分相對含量較其他特性芳香成分的相對含量高，均檢測到乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯及（2E，4Z）-癸二烯酸乙酯7種特征香味成分，但品種間芳香成分含量存在較大差異。目前尚未見有關(guān)太婆梨香氣物質(zhì)的分析報道。

固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)是當前香氣成分研究最常用的方法[6-8]。本研究以帶皮太婆梨果為材料，探索建立適合太婆梨果香氣成分檢測的SPME-GC/MS方法，并利用該方法對其梨果香氣組分進行分析研究，以期為太婆梨的香氣評價提供方法和數(shù)據(jù)支持。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與試劑

選取成熟度一致、無機械損傷和病蟲害的太婆梨果實作為試驗材料，購買于煙臺直采果園。

試驗所用標準品：乙酸丁酯（99.0%）、苯甲醛（99.3%）購于北京曼哈格公司;乙酸-2-己烯-1-醇酯（98%）購于上海阿拉丁試劑公司;辛酸乙酯（98%）購于上海梯希愛化成工業(yè)公司;壬醛（96%）購于薩恩化學公司;己酸甲酯（99.5%）、乙酸戊酯（99.0%）、苯甲酸乙酯（99.0%）、反-4-癸烯酸乙酯（95%）、乙酸庚酯（98%）購于北京百靈威公司;戊酸乙酯（99.5%）、己酸乙酯（99.3%）、2-壬酮（99.0%）購于德國Dr. Ehrensorfer公司;甲醇（HPLC級）購于美國 Fisher 公司。

1.2?試驗設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜儀配備Agilent 5977 MSD質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）;SUPELCO固相微萃取裝置（美國色譜科公司），配有50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm Carboxen/PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、85 μm Polyacrylate五種萃取頭;CORNING PC-420D磁力攪拌器（美國康寧公司）;Sartorius BSA224S-CW分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.3?試驗方法

1.3.1?標準溶液配制?稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）各香氣物質(zhì)標準品，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 000 mg/L的單一香氣標準儲備液。然后將2-壬酮標液用甲醇稀釋至1 000 mg/L備用，并將其余12種香氣物質(zhì)標準儲備液經(jīng)甲醇稀釋成500 mg/L混標溶液，最后用甲醇逐級稀釋500 mg/L混標至5、10、20、50、100、200 mg/L標準工作液，每級香氣混標中添加2-壬酮并使其濃度始終保持在200 mg/L。所有標準溶液于-18℃冰箱中貯存。

1.3.2?氣相色譜質(zhì)譜條件?Agilent 7890A氣相色譜儀串聯(lián)5977 MSD質(zhì)譜儀，配備DB-5 ms （30 m × 250 μm × 0.25 μm）色譜柱，柱溫采取程序升溫（見表1），載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min，進樣口、連接桿溫度分別為270、280℃;質(zhì)譜為EI離子源，電子能量、電子倍增器電壓分別為70 ev、1 382.3 V，掃描范圍為45～450 amu，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量模式全程掃描。

1.3.3?揮發(fā)性香氣成分萃取?按照四分法將每個梨果分成4部分，從每部分豎切0.5 cm厚的帶皮梨片，去掉核。每次照此方法取5個梨果的果肉，切成0.5 cm×0.5 cm的帶皮梨塊，混勻，取6 g裝入萃取瓶中，加入200 mg/L 2-壬酮 50 μL，蓋緊塞子靜置10 min，在40℃條件下萃取40 min[9，10]。試驗重復3次。

1.3.4?揮發(fā)性香氣成分檢測與分析?將固相微萃取頭插入氣相色譜端進樣口，于270℃下解析10 min，在1.3.2條件下進行檢測，所得圖譜進行如下分析：

（1）定性分析：不同的物質(zhì)經(jīng)氣相色譜分離后會形成不同的色譜峰。經(jīng)NIST/WILEY檢索及資料分析，再結(jié)合有關(guān)文獻，對所得譜圖進行人工分析，以確定相應(yīng)的化學成分。

（2）定量分析：以2-壬酮（其濃度200 mg/L，體積50 μL）為內(nèi)標，用面積歸一化法換算出各組分的含量。

2?結(jié)果與分析

2.1?固相微萃取頭的選擇

不同的微萃取頭負載不同的固定相，是影響揮發(fā)性芳香物質(zhì)萃取效果的核心因素[9]。本研究對SUPELCO固相微萃取裝置配備的五種常用微萃取頭進行試驗，以篩選適合萃取太婆梨揮發(fā)性香氣物質(zhì)的萃取頭。結(jié)果顯示，50/30 μm DVB/CAR/PDMS（灰色，雙極性）、65 μm PDMS/DVB（藍色，雙極性偏非極性，具有非極性與極性，但性質(zhì)更多為非極性）、75 μm Carboxen/PDMS（黑色，雙極性）、100 μm PDMS（紅色，非極性）、85 μm Polyacrylate（白色，極性）五種微萃取頭萃取的太婆梨香氣物質(zhì)總量分別為7 790.31、6 739.59、8 366.12、4 252.51、2 673.79 ng/g，香氣物質(zhì)種類分別有78、54、72、63、47種;以75 μm Carboxen/PDMS微萃取頭萃取的香氣物質(zhì)總量最高，其次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS微萃取頭，兩者萃取的香氣物質(zhì)種類也相差不大。

梨果揮發(fā)性香氣物質(zhì)主要包括酯類、烯烴類、醛類、酮類等物質(zhì)[10]。比較五種萃取頭萃取到的太婆梨香氣物質(zhì)，75 μm Carboxen/PDMS、65 μm Polyacrylate兩種微萃取頭萃取到的酯類物質(zhì)較多，分別高達95.4%、80.9%;其余三種微萃取頭萃取到的酯類物質(zhì)與烯烴類物質(zhì)相當，均約占所萃取香氣物質(zhì)總量的50%。醛類、酮類、醇類及其他類物質(zhì)，五種萃取頭萃取到的量均較少，醛類占比0.1%～2.3%，[JP3]以75 μm Carboxen/PDMS微萃取頭萃取量最高，略高于50/30 μm DVB/CAR/PDMS;醇類占比較低，除85 μm Polyacrylate萃取頭萃取量占比1.1%外，其余四種萃取頭的萃取量均低于0.05%;其他類物質(zhì)占比0.9%～1.8%，五種萃取頭之間相差不大;酮類物質(zhì)含量非常少，除75 μm Carboxen/PDMS外，其余四種微萃取頭均未檢測到。

雖然75 μm Carboxen/PDMS微萃取頭萃取的香氣物質(zhì)總量最多，且香氣中酯類物質(zhì)含量最高，但是其萃取的烯烴類物質(zhì)遠低于50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB萃取頭，每種類型都是梨果風味必不可少的一部分，由此綜合考慮萃取到的香氣物質(zhì)總量、種類及每類所占比例，確定50/30 μm DVB/CAR/PDMS為最佳萃取頭。

2.2?方法可行性評價

2.2.1?方法線性范圍、檢出限?將不同濃度的標準工作溶液滴加在梨塊上，密封靜置10 min，按照1.3.3與1.3.4進行萃取與測定，以不添加標準工作液的梨塊為對照。以各標準品的峰面積與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標，各標準品濃度與內(nèi)標濃度之比為橫坐標進行線性回歸分析，繪制標準曲線，結(jié)果（表2）表明，各物質(zhì)均在5～200 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于0.99;經(jīng)計算各物質(zhì)的最小檢出限小于3.77×10-3 ?ng。

2.2.2?添加回收率與相對標準偏差?梨塊樣品中添加20 mg/L的混標溶液50 μL，按照1.3.3與1.3.4步驟測定，考察方法的回收率及重復性，每個樣品重復5次。結(jié)果（表3）顯示，各標準物質(zhì)在梨塊中的添加回收率為82.8%～101.7%，相對標準偏差1.2%～8.4%，均滿足定性定量分析要求。

2.3?太婆梨果揮發(fā)性香氣物質(zhì)的GC-MS分析

太婆梨中香氣成分的GC/MS總離子流圖。經(jīng)NIST/WILEY譜庫檢索，并與文獻資料[1-12]比較，確定了太婆梨果中揮發(fā)性香氣成分（表4），其中，質(zhì)量分數(shù)大于5 ng/g的香氣成分共32種，包括酯類10種、烯烴類13種、醛類1種、其他類8種。

從太婆梨果檢出的香氣物質(zhì)中，烯烴類物質(zhì)占50.1%，酯類物質(zhì)47.5%，其他類1.8%，醛類物質(zhì)0.6%，醇類物質(zhì)0.03%。主要香氣成分為α-法呢烯（44.0%）、乙酸己酯（31.4%）、乙酸丁酯（10.6%）、（Z，E）-2，4-癸二烯酸乙酯（2.3%）、（3Z，6E）-α-法呢烯（1.8%）、α-cis-雪松烯（1.1%）。

香氣值是香氣組分含量與其香氣閾值的比值，香氣值大于1的為特征香氣成分。太婆梨的特征香氣物質(zhì)有4種（表5），分別為乙酸己酯、乙酸丁酯、E-2-己烯醛、3-甲硫基丙酸乙酯。目前，仍有相當一部分香氣成分沒有閾值，無法量化其香氣值，但對梨果的香氣也有不同程度的貢獻，只有這些揮發(fā)性芳香物質(zhì)共同作用才形成了果實獨特的風味。另有學者根據(jù)不同化學結(jié)構(gòu)香氣成分的感官反應(yīng)將香氣分為果香型、青香型、花香型、辛香型、木香型、酵香型等[10]。從特征香氣與相對含量較高香氣成分看，太婆梨兼具果香、花香和青草香，與其獨特清香的感官風味相一致。

3?討論與結(jié)論

本研究建立了太婆梨果中揮發(fā)性香氣成分的SPME-GC/MS分析方法，確定了適宜的微萃取頭，經(jīng)評價該方法可行。利用該方法檢測太婆梨果的香氣成分，共檢出32種質(zhì)量分數(shù)大于5 ng/g的香氣成分，主要為烯烴類、酯類物質(zhì)，并確定其可量化的特征香氣成分為乙酸己酯、乙酸丁酯、E-2-己烯醛、3-甲硫基丙酸乙酯。

太婆梨屬于西洋梨系統(tǒng)，前人研究表明早紅考密斯、巴梨、康佛倫斯、三季梨等梨中酯類芳香成分相對含量較其他特性芳香成分的相對含量高[4，5]，本研究也發(fā)現(xiàn)太婆梨果中酯類物質(zhì)含量較高，但略低于烯烴類物質(zhì)，這可能與太婆梨本身特性、生長環(huán)境、貯藏條件以及所選微萃取頭種類不同等有一定關(guān)系。國外研究表明癸烯酸酯類物質(zhì)，特別是（2E，4Z）-癸二烯酸乙酯是西洋梨的重要風味組成[2，3]。本試驗在太婆梨中同樣檢出（E，Z）-2，4-癸二烯酸乙酯，同時還有其同分異構(gòu)體（Z，E）-2，4-癸二烯酸乙酯。除此之外，太婆梨中還檢出癸酸甲酯、3-羥基月桂酸乙酯、油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸甲酯等酯類物質(zhì)，是目前所測梨果中檢測到10～18碳酸酯數(shù)量最多的梨果;3-甲硫基丙酸乙酯首次在菠蘿中發(fā)現(xiàn)，繼而在葡萄中再次發(fā)現(xiàn)，目前分析的幾種梨中，只在南果梨[1]和太婆梨中發(fā)現(xiàn)。

本研究可為太婆梨香氣評價提供一種科學的分析方法，同時為其香味育種提供數(shù)據(jù)支持。

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