牛骨酶解物對(duì)制備牛肉香精中揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

成曉瑜+李迎楠+劉文營(yíng)+賈曉云

摘 要：以牛肉香精為研究對(duì)象，從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成和電子鼻分析角度研究不同牛骨酶解物添加量對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：不同牛骨酶解物添加量使牛肉香精在風(fēng)味物質(zhì)方面有較大的差異性。牛骨酶解物添加量為6 g時(shí)，牛肉香精中揮發(fā)性物質(zhì)含量較高，達(dá)到95.39%，其中具有特征風(fēng)味的吡嗪類、醛類、酮類化合物的含量相對(duì)較高；運(yùn)用電子鼻技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，除添加量為8 g和10 g時(shí)有部分重疊，其余條件下樣品存在顯著性差異。在此條件下得到的牛肉香精烤香味較為明顯，具有良好的風(fēng)味香氣。

關(guān)鍵詞：牛肉香精；風(fēng)味物質(zhì)；牛骨酶解物；電子鼻；固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜

Effect of Addition of Enzymatic Hydrolysate of Bovine Bone into Maillard Reaction System on Volatile Aroma Composition of Beef Essence

CHENG Xiaoyu， LI Yingnan， liu Wenying， JIA Xiaoyun

（China Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences，

Beijing 100068， China）

Abstract： This study was intended to examine the effect of adding different amounts of bovine bone collagen hydrolysate prepared with flavourzyme to the Maillard reaction system used to produce beef essence on the flavor quality of reaction products. The results showed that the volatile flavor compounds of beef essence varied significantly depending on the amount of added bovine bone collagen hydrolysate. The addition of 6 g of bovine bone collagen hydrolysate led to the generation of high amounts of volatile compounds （95.39%） in the beef essence， with the characteristic flavor compounds pyrazines， aldehydes and ketones being dominant. Electronic nose analysis suggested that the flavor compounds formed in the presence of 8 and 10 g of the hydrolysate were partly identical， and significant differences were found at other addition levels of the hydrolysate. The beef essence obtained under this condition had an outstanding roast aroma and good flavor.

Key words： beef essence； flavor substances； bovine bone collagen hydrolysates； electronic nose； solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （SPME-GC-MS）

中圖分類號(hào)：TS251.94 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）04-0001-05

DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001

引文格式：

成曉瑜， 李迎楠， 劉文營(yíng)， 等. 牛骨酶解物對(duì)制備牛肉香精中揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響[J]. 肉類研究， 2016， 30（4）： 1-5. DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

CHENG Xiaoyu， LI Yingnan， liu Wenying， et al. Effect of addition of enzymatic hydrolysate of bovine bone into maillard reaction system on volatile aroma composition of beef essence[J]. Meat Research， 2016， 30（4）： 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

還原糖的羰基和游離氨基間的美拉德反應(yīng)與食品風(fēng)味之間的關(guān)系，為美拉德反應(yīng)制備肉味香精奠定了基礎(chǔ)[1]。美拉德反應(yīng)獲得的肉類風(fēng)味物質(zhì)能夠比較逼真地讓人感受到肉香氣的濃郁和口味的厚重，吸引了大量的學(xué)者研究，也成為咸式香精市場(chǎng)的寵兒[2]。

氨基作為美拉德反應(yīng)的重要前提物質(zhì)，它的來(lái)源對(duì)反應(yīng)十分重要。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸提供的氨基對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味物質(zhì)的形成影響很大。Eric等[3]研究發(fā)現(xiàn)向葵粕多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可作為增香劑；Ogasawara等[4]研究發(fā)現(xiàn)1 000～5 000 D的多肽是增強(qiáng)反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味、鮮味及持續(xù)性的關(guān)鍵；Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)不同種類的蛋白質(zhì)或多肽通過美拉德反應(yīng)可增強(qiáng)加工過程中的風(fēng)味；Huang[6]、綦艷梅[2]等對(duì)大豆、牛肉等水解產(chǎn)物、半胱氨酸對(duì)反應(yīng)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響進(jìn)行了分析。而屠宰副產(chǎn)物牛骨的蛋白質(zhì)十分豐富，其酶解液含有不同分子質(zhì)量的多肽以及氨基酸[7]，可作為美拉德反應(yīng)制備牛肉香精的重要氨基來(lái)源。

目前，國(guó)內(nèi)外研究多集中于以肉蛋白為來(lái)源的酶解產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)物風(fēng)味的影響[8-9]，以牛骨酶解產(chǎn)物的相關(guān)研究較少。因此，增加牛骨在肉味香精方面的開發(fā)，對(duì)副產(chǎn)物的綜合利用具有更深遠(yuǎn)的意義。實(shí)驗(yàn)中采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、電子鼻風(fēng)味分析方法，研究不同牛骨酶解物添加量對(duì)牛肉香精主要揮發(fā)性成分的影響，為牛骨在牛肉香精的開發(fā)應(yīng)用提供理論技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉、牛骨購(gòu)于北京豐臺(tái)牛街清真市場(chǎng)。

復(fù)合動(dòng)物蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 諾維信（中國(guó)）投資有限公司；木糖、半胱氨酸、丙氨酸等均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

SUPELCO固相微萃取 美國(guó)Sigma公司；TRACE 1310氣相色譜-TSQ8000質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國(guó)Airsense公司；LGJ-30D冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉酶解物、牛骨酶解物制備

參考文獻(xiàn)[7]方法，取牛骨破碎后加熱至110 ℃，取下層骨渣酶解，酶解溫度為60 ℃，復(fù)合動(dòng)物蛋白酶15 mg/g，酶解4 h，風(fēng)味蛋白酶10 mg/g，酶解2 h后終止反應(yīng)；將酶解液凍干后備用。

稱取新鮮牛肉，按肉水比1∶1（m/m）加入水，經(jīng)組織搗碎機(jī)攪碎，加入0.4%風(fēng)味蛋白酶，50 ℃酶解4 h后終止反應(yīng)，冷卻至室溫備用。

1.3.2 美拉德反應(yīng)制備牛肉香精

準(zhǔn)確稱量并添加牛肉酶解物50 g、木糖5 g、葡萄糖2 g、酵母1 g、半胱氨酸5 g、牛油5 g、水解植物蛋白液（hydrolyzed vegetable protein，HVP）30 g、丙氨酸1.5 g、甘氨酸3 g，分別添加牛骨酶解物2、4、6、8、10 g，混合均勻，美拉德反應(yīng)時(shí)間為75 min，反應(yīng)溫度為105 ℃，考察不同牛骨酶解物添加量對(duì)牛肉香精風(fēng)味的影響。

1.3.3 GC-MS測(cè)定

固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）：取1 mL牛肉香精樣品裝入頂空瓶中，50 ℃水浴鍋中平衡30 min，將事先250 ℃條件下老化30 min的固相微萃取針頭插入頂空瓶中，吸附30 min。吸附結(jié)束后，將萃取針頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解析5 min，進(jìn)行GC-MS測(cè)定[10-11]。

色譜條件：色譜柱DB-Wax極性柱；流速1.0 mL/min。程序升溫：進(jìn)樣口溫度250 ℃，起始柱溫35 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫到200 ℃，再以10 ℃/min升到250 ℃保持5 min。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度280 ℃；質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍設(shè)定為40～600 u。

1.3.4 電子鼻傳感器檢測(cè)

PEN3型電子鼻傳感器的不同金屬氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)類型不同[12]。不同來(lái)源的氨基得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物不同，進(jìn)而影響揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，因此在傳感器上呈現(xiàn)不同的氣味感應(yīng)信號(hào)。

準(zhǔn)確量取1 mL牛肉香精，25 ℃恒溫環(huán)境平衡2 h，運(yùn)用電子鼻傳感器對(duì)不同樣品進(jìn)行檢測(cè)，傳感型號(hào)在60 s后基本穩(wěn)定，選定信號(hào)采集時(shí)間為70 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

風(fēng)味組分的質(zhì)譜分析：檢索NIST11.L和Demo.l數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)不同條件下牛肉香精的揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，并根據(jù)面積歸一化法求得各成分的相對(duì)百分含量。

電子鼻分析數(shù)據(jù)分析：運(yùn)用Winmuster軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME-GC-MS測(cè)定分析結(jié)果

在牛肉香精的熱反應(yīng)體系中，添加不同牛骨酶解物2、4、6、8、10 g分別得到牛肉味的反應(yīng)物，采用SPME方法，結(jié)合GC-MS，對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，得到的總離子流圖如圖1所示，鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味成分見表2。

由表2可知，在牛骨酶解物添加量2、4、6、8、10 g時(shí)制備的牛肉香精經(jīng)GC-MS分別檢出37、36、43、43、42 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，主要是醇類、醛類、酮類、酯類、含氮類、酸類等，其種類及相對(duì)含量見表3。主要包括：糠醇、2-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、3-甲基-2-丁酮、

2-甲基四氫呋喃-3-酮、3-甲基-1，2-環(huán)戊二酮、乙酸異丙烯酯、γ-戊內(nèi)脂、2-乙基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、

2-乙?；量⒂鷦?chuàng)木酚等，這些化合物揮發(fā)性成分含量較高，不同牛骨酶解物添加量制備的產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總量由高到低依次為6 g>8 g>10 g>4 g>2 g。

醇類化合物是由羰基化合物還原或脂肪經(jīng)氧化分解產(chǎn)生的。在反應(yīng)體系中醇類較其他類別相對(duì)含量最高，主要為糠醇，糠醇具有焦糖香、甜香及咖啡香等氣味[7]，4 種反應(yīng)物含量均在25%以上，10 g的牛骨酶解物添加量的相對(duì)含量最高，高達(dá)36.96%。Wettsinghe等[13]研究發(fā)現(xiàn)不飽和醇閾值較低，具有蘑菇香味，對(duì)肉品風(fēng)味的形成具有一定的作用。

含氮類的化合物總量列居第2位，種類也最多。含氮類化合物是肉品最重要的香味呈味物[14]，其中吡嗪類化合物是揮發(fā)性風(fēng)味成分中的重要組分，在反應(yīng)體系中含量最高。吡嗪是美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的主要揮發(fā)性物質(zhì)之一，這些芳香成分已被確認(rèn)為燒烤香的直接貢獻(xiàn)化合物[1]。不同牛骨酶解物添加量的反應(yīng)產(chǎn)物中均含有2-乙基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪、2-乙?；量?、2，5-二甲基-3-丙基吡嗪，它們提供燒烤牛肉的風(fēng)味。相對(duì)含量較高的2，3，5-三甲基吡嗪具有堅(jiān)果香、

可可及土豆樣香氣；2-乙?；量┚哂惺卟恕⒛⒐郊巴炼瓜銡鈁7]。牛骨酶解物添加量為6 g時(shí)，牛肉香精中含氮類化合物含量相對(duì)較高，達(dá)到18.24%，其中吡嗪類化合物含量為14.04%；而添加量為4 g和8 g時(shí)吡嗪類化合物含量較低，添加量為2 g時(shí)吡嗪類化合物種類雖較高，但整體風(fēng)味物質(zhì)含量較少，且香味不夠濃郁。因此牛骨酶解物添加量為6 g時(shí)牛肉香精烤香味較為明顯，具有良好的風(fēng)味香氣。

醛、酮類化合物屬于羰基類化合物，在檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味化合物中，羰基類化合物對(duì)牛肉香精特征風(fēng)味的形成具有重要作用，不同肉香風(fēng)味的差異主要來(lái)自于羰基化合物的定性定量差異[15]。醛、酮類化合物可以增強(qiáng)牛肉香精的層次感，使其風(fēng)味更加圓潤(rùn)[16]。牛骨酶解物添加量的不同，對(duì)牛肉香精中醛、酮類化合物含量影響較大，其中添加量為6 g時(shí)，牛肉香精中羰基類化合物含量較高，達(dá)到29.48%，且種類較多，其次為添加量為8 g時(shí)含量為26.99%，而添加量為2 g時(shí)羰基化合物含量最低。醛類化合物的閾值較低[17]，能夠賦予牛肉香精清香、果香及堅(jiān)果香，其中含量相對(duì)較高的2-甲基丁醛具有果香及堅(jiān)果香，苯甲醛可能賦予產(chǎn)物脂香風(fēng)味。而酮類化合物多具有甜香味，其中3-羥基-2-丁酮具有甜香，2-甲基四氫呋喃-3-酮具有果香及青香，5-甲基-2-乙?；秽哂锌鞠恪熝慵扒逄鸬臍馕禰18]。

酸類化合物可能是由相應(yīng)的醇、醛在美拉德反應(yīng)過程中高溫氧化得到的。牛骨酶解物添加量為4、10 g時(shí)含量較高，其中含量相對(duì)較高的乙酸呈現(xiàn)刺激、尖酸的氣息，對(duì)牛肉香精的風(fēng)味有一定的影響，其余條件下酸類化合物含量相差不大。酯類化合物主要是游離的脂肪酸和脂肪氧化產(chǎn)生的醇酯化產(chǎn)生的，內(nèi)酯和硫酯對(duì)肉味香精有一定的貢獻(xiàn)。其中添加量為6 g時(shí)，牛肉香精中酯類化合物含量較高，達(dá)到5.39%，且種類達(dá)8 種，其中相對(duì)含量較高的乙酸酯類具有愉快的水果香氣；而γ-戊內(nèi)酯具有果香及甜香。酯類化合物在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中所占比例相對(duì)較少。醚類、酚類化合物檢測(cè)出的相對(duì)較少，二糠基醚具有咖啡、榛子、堅(jiān)果香氣，而愈創(chuàng)木酚具有可口的肉香及煙熏味[18]。

綜合上述分析得到，牛骨酶解物添加量為6 g時(shí)，牛肉香精中揮發(fā)性物質(zhì)含量較高，其中具有特征風(fēng)味的吡嗪類化合物及醛、酮類化合物的含量相對(duì)較高?？烧J(rèn)為，在該反應(yīng)條件下牛肉香精中牛骨酶解物添加量為6 g較為適宜。

2.2 電子鼻測(cè)定結(jié)果

利用電子鼻技術(shù)從整體香氣成分水平上對(duì)不同牛骨酶解物添加量條件下牛肉香精進(jìn)行主成分分析和線性判別分析。PCA轉(zhuǎn)換中得到的貢獻(xiàn)率越大，則主要成分可以更好地反映多指標(biāo)信息[19-20]。由圖2A可知，PC1、PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為88.22%和9.10%，總貢獻(xiàn)率為97.32%，說(shuō)明其主成分可以很好地反映指標(biāo)信息，除添加量為8 g和10 g條件下有部分重疊，其余數(shù)據(jù)點(diǎn)均分布在各自的區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明不同牛骨酶解物添加量下肉味香精的主成分之間有顯著性差異，添加量為4 g時(shí)，數(shù)據(jù)點(diǎn)與其他距離較大，說(shuō)明添加量為4 g與其他條件主成分有明顯差異。由圖2B可知，LD1、LD2的方差貢獻(xiàn)率分別為78.77%和8.67%，總貢獻(xiàn)率為87.44%，其中添加量為8 g和10 g時(shí)有部分重疊，說(shuō)明二者之間具有一定的相似性，其余數(shù)據(jù)分布較為分散。因此，采用PCA和LDA分析方法，能夠區(qū)分出這5 種添加量下樣品間存在顯著性差異，風(fēng)味均有所改變。

圖 2 不同牛骨酶解物添加量肉味香精的PCA分析（A）和LDA分析（B）

Fig.2 PCA analysis （A） and LDA analysis （B） of beef essences produced with different amounts of bovine bone collagen hydrolysate

3 結(jié) 論

不同添加量牛骨酶解物的牛肉香精在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面有較大的差異性，可見牛骨酶解物含量對(duì)牛肉香精的風(fēng)味品質(zhì)有很大的影響。通過SPME-GC-MS對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定性、定量分析結(jié)果顯示，牛骨酶解物添加量為6 g時(shí)，牛肉香精中揮發(fā)性物質(zhì)含量較高，達(dá)到95.39%，其中具有特征風(fēng)味的吡嗪類化合物及醛、酮類化合物的含量相對(duì)較高；運(yùn)用電子鼻技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，除添加量為8 g和10 g時(shí)有部分重疊，其余條件下樣品存在顯著性差異。在此條件下得到的牛肉香精烤香味較為明顯，具有良好的風(fēng)味香氣。

本研究同時(shí)添加牛肉酶解物及牛骨酶解物發(fā)生美拉德反應(yīng)，同時(shí)對(duì)產(chǎn)物風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析，判斷出較為適宜的牛骨酶解物添加量，同時(shí)得到風(fēng)味較好的牛肉香精，為牛肉香精的研發(fā)提供一定的理論參考。

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