炮制對地榆中鞣質類成分含量及凝血作用的影響

趙慧 張學順 戴衍朋 張偉 王雪 孫立立

摘要：為考察炮制對地榆中鞣質類成分以及凝血作用的影響，采用紫外可見分光光度法測定地榆中鞣質含量，采用UPLC法測定地榆中沒食子酸、鞣花酸含量。結果表明，隨著炮制程度的加重，總鞣質含量呈下降趨勢，沒食子酸先升高后降低，而鞣花酸呈上升趨勢;體外抗凝血試驗表明，凝血作用以炮制適中的地榆炭為最佳。

關鍵詞：地榆;炮制;鞣質;沒食子酸;鞣花酸;凝血作用

中圖分類號：S567.23+9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）12-0127-05

中藥地榆始載于《神農本草經》，列為中品，是薔薇科地榆屬植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）或長葉地榆[Sanguisorba officinalis L. var. longifolia （Bert.） Yü et Li]的干燥根[1]。地榆生品以涼血解毒為主，用于血痢經久不愈、燙傷、皮膚潰爛、濕疹、癰腫瘡毒等;炒炭炮制后，以收斂止血力勝，用于便血、痔瘡出血、崩漏下血等，各種出血證均可選用[2]。

地榆主要化學成分為鞣質和三萜類化合物，此外還有黃酮類、蒽醌類化合物[3，4]。一般認為鞣質是地榆止血作用的主要活性成分[5-7]，但炮制后鞣質成分含量變化以及止血作用報道不一[8-12]，本研究對生地榆以及不同炮制程度地榆炭的總鞣質、沒食子酸、鞣花酸含量進行測定，結合凝血作用的藥效試驗分析了炮制程度對地榆鞣質含量和止血作用的影響，為地榆炒炭止血的炮制原理解析提供數據支撐。

1?材料與方法

1.1?供試材料

1.1.1?試驗儀器?Waters H-Class UPLC全自動高效液相色譜儀（含PDA檢測器）;XS205D（1/100 000）電子天平（梅特勒托利多）;UV-2550紫外-可見分光光度儀（島津）;HZS-H水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）;LC-350A型超聲波中藥處理機（濟寧市魯超超聲設備有限公司）;數字恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）;Multiskan FC酶標儀（賽默飛世爾）。

1.1.2?試藥與試劑

沒食子酸對照品（批號：110831-201302）購自中國藥品生物制品檢定所;鞣花酸對照品（批號：10149850），購于美國阿法埃莎（Alfa Aesar）。

乙腈（色譜純），購于美國默克;磷酸（色譜純），購于天津科密歐化學試劑有限公司;色譜用水為蒸餾水（屈臣氏）;甲醇、95%乙醇、鉬酸鈉、硫酸鋰、溴、鹽酸、無水碳酸鈉、干酪素、氯化鈣均為分析純。

地榆飲片產地甘肅，經山東中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源研究室林慧彬研究員鑒定，為薔薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）的干燥根。

1.2?試驗方法

1.2.1?不同炮制程度地榆樣品的制備

取凈地榆片300 g置預熱的炒鍋內，炒制不同時間，制備不同炮制程度地榆炭（表1）。

1.2.2?地榆及地榆炭中總鞣質測定?（1）對照品溶液的制備：精密稱取沒食子酸對照品50.0 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含沒食子酸0.05 mg）。

（2）標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水12.0、11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應的試劑為空白，采用紫外可見分光光度法，在760 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=118.54x+0.0298，r=0.998。說明沒食子酸在0～0.0101 mg/mL線性關系良好。

（3）供試品溶液的制備：稱取樣品粉末（過四號篩）0.4 g，置250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置使固體物沉淀，過濾，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得。

（4）鞣質含量測定：先精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照“標準曲線的制備”項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水10 mL，依法測定吸光度，從標準曲線中讀取供試品溶液中沒食子酸的量（mg），計算，即得總酚量。

再精密量取供試品溶液25 mL，加至盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水10 mL，依法測定吸光度，從標準曲線中讀取供試品溶液中沒食子酸的量（mg），計算，即得未被吸附的多酚量。

鞣質含量=總酚量-未被吸附的多酚量

1.2.3?地榆及地榆炭中游離沒食子酸和鞣花酸的測定?（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流動相：A乙腈，B為0.1%磷酸溶液（0～0.7 min，A 1.5%→4.0%;0.7～1.7 min，A 4.0%→30.0%;1.7～3.5 min，A 30.0%→40.0%;3.5～5.0 min，A 40%→50%）。流速0.6 mL/min;柱溫35℃。波長270/252 nm。進樣量0.5 μL。在上述色譜條件下，沒食子酸、鞣花酸對照品和供試品的色譜圖。

（2）溶液制備：分別精密稱取沒食子酸、鞣花酸對照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升含沒食子酸0.10 mg、鞣花酸0.45 mg的溶液，即得對照品溶液。

精密稱取地榆粉末（過四號篩）0.2 g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理40 min，放涼，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（3）線性關系考察：分別吸取不同體積的沒食子酸對照品溶液，注入高效液相色譜中，測定，以對照品進樣質量（μg）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制出校正曲線，Y=5078154X-2979.6，R2=0.9999，表明沒食子酸進樣量在0.0198～0.2376 μg范圍內具有良好的線性關系。

分別吸取不同體積鞣花酸對照品溶液，注入高效液相色譜中，測定，以對照品進樣質量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制出校正曲線，Y=9175392X+9142.6，R2 = 0.9997，表明鞣花酸進樣量在0.0123～0.1848 μg范圍內具有良好的線性關系。

（4）精密度試驗：按本試驗色譜條件，將沒食子酸和鞣花酸對照品溶液重復進樣6次，每次0.5 μL，測定沒食子酸的峰面積RSD為0.77%，鞣花酸的峰面積RSD為0.39%，表明精密度良好。

（5）穩(wěn)定性試驗：按本試驗色譜條件，取供試品溶液，室溫條件下，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣并進行分析，測定峰面積。結果沒食子酸在24 h內峰面積RSD為0.92%，鞣花酸為0.84%，表明該供試品溶液至少在24 h內穩(wěn)定。

（6）重復性試驗：精密稱取同一批次的地榆樣品粉末6份，制備供試品溶液，精密吸取一定量的供試品溶液注入液相色譜儀，

按本試驗色譜條件測定，計算沒食子酸和鞣花酸含量。結果沒食子酸和鞣花酸的含量分別為0.66%和0.89%，RSD分別為2.22%和2.17%，表明方法重復性良好。

（7）加樣回收率：精密稱取已知含量的地榆樣品6份，分別加入沒食子酸和鞣花酸對照品溶液適量，制備供試品溶液，按本試驗色譜條件測定峰面積，計算沒食子酸和鞣花酸的平均加樣回收率，結果見表2。

（8）樣品測定：稱取地榆樣品粉末，制備供試品溶液，按本試驗色譜條件，測定峰面積并計算各樣品中游離沒食子酸和鞣花酸的含量，見表3。

1.2.4?地榆及地榆炭凝血作用測定

采集正常人抗凝血漿，加入不同炮制程度地榆提取液和鈣離子，在鈣離子的作用下血液開始凝固，按照預定時間用去離子水流注，收集流注液，用紫外分光光度計測流注液中游離血紅蛋白的吸光度值（OD），描繪凝血時間值曲線圖，觀察值隨時間的變化情況，以判定被測樣品對凝血因子的激活程度。

通過預試驗發(fā)現(xiàn)，地榆提取液與抗凝血接觸后10 min開始出現(xiàn)凝血現(xiàn)象直至15 min，因此本試驗取10 min和15 min兩個時間點進行測定。

（1）抗凝血的采集：靜息狀態(tài)下抽取健康志愿者肘靜脈血液，棄去針管前部0.5 mL血液，防止針頭被組織污染，其余血液與38 g/L枸櫞酸鈉按1∶9體積比混勻。

（2）體外凝血試驗：用1 000 μL移液器吸取各炮制程度地榆提取液

250 μL于燒杯中，空白組加入250 μL蒸餾水;吸取80 μL抗凝血漿、

25 μL氯化鈣溶液于各組燒杯中，混勻，啟動計時器，10 min和15 min時分別用 10 mL蒸餾水沿燒杯壁緩緩流注液體表面，輕輕搖晃后靜置

10 min。

吸取流注液于比色皿中，用酶標儀在540 nm處測定每份流注液中血紅蛋白的吸光度。

2?結果與分析

2.1?鞣質類成分測定結果

由表3可知，總鞣質、沒食子酸、鞣花酸成分變化趨勢不同：生地榆中鞣質含量達14.7%，炮制后鞣質含量呈顯著下降趨勢;生地榆中沒食子酸含量為2.38%，炮制后含量隨制炭程度加重先增加后降低，炮制適中時較高;而生地榆中鞣花酸含量最低，為3.71%，其含量隨炮制程度的加重而增加，在過重的地榆炭中，其含量增加至7%左右。

2.2?體外凝血試驗結果

表4表明不同的炮制程度對地榆凝血活性具有較大影響。各組在5 min內血紅蛋白的吸光度都明顯降低，表明出現(xiàn)了加速凝血的作用。地榆炭3和4樣品（炮制程度適中）在5 min內血紅蛋白的吸光度變化率最高，表現(xiàn)出較強的促凝血作用;而地榆炭5和6樣品（炮制程度重）在5 min內血紅蛋白的吸光度變化率較低，表明其凝血作用較弱。生品和炮制程度較輕的樣品，也具有一定促凝血作用，但弱于炮制程度適中的地榆炭。

3?討論與結論

明朝陳家謨于《本草蒙荃》中說“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則氣味反失”。凝血試驗結果表明炮制適中的地榆具有較強的凝血活性，因此適當的炮制程度確是中藥發(fā)揮作用的重要因素。

一般認為地榆鞣質是其止血作用的主要活性成分[5]，通過對不同炮制程度地榆炭中鞣質含量測定以及凝血活性的研究發(fā)現(xiàn)，總鞣質與凝血作用無正相關關系;前期試驗結果以及文獻報道也顯示大分子的單寧酸止血作用較差，而沒食子酸和鞣花酸具有較好的止血活性[6，7]，因此曾推測小分子的鞣質類成分可能與地榆止血功效有較大相關性。本試驗結果顯示，沒食子酸與凝血活性變化的趨勢相似，沒食子酸可能是其促凝止血的主要活性成分之一;而鞣花酸與之差別較大，其原因可能與鞣花酸的水溶性較差有關。

參?考?文?獻：

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