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    川楝子黃酮的提取和初步純化

    2018-03-01 11:58:18謝肖鋒
    生物化工 2018年1期
    關(guān)鍵詞:川楝子樣液液料

    謝肖鋒

    (貴州大學(xué) 藥學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

    川楝子(Fructus Toosendan)是落葉喬木川楝樹(shù)(Melia toosendan Sib.et Zucc.)的干燥成熟果實(shí),在冬季采收[1]。川楝子作為驅(qū)蟲(chóng)藥已有悠久的歷史,同時(shí)也作為傳統(tǒng)的理氣藥,主產(chǎn)于川、黔、湘、鄂等地,其中川產(chǎn)為上乘,而作為道地藥材,因此被稱(chēng)作川楝子[2]?!侗静菥V目》有記載,此藥味道酸而苦,具有毒性,是寒性藥;入肝、胃、小腸經(jīng)。現(xiàn)代藥理研究實(shí)驗(yàn)證明,川楝子具有驅(qū)蛔殺蟲(chóng)、抗菌、抗肉毒、消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤[3]、抗氧化、抑制破骨細(xì)胞[4]等作用。川楝子中主要活性成分有川楝素等萜類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物[5]。

    黃酮化合物的提取方法主要有超聲提取法、微波提取法、超臨界流體提取法、酶提取法、水浸出法和有機(jī)溶劑提取法等[6]。雖然超聲提取、超臨界提取和酶提取等方法提取效果好提取效率高,但考慮設(shè)備比較昂貴,提取條件要求高和經(jīng)濟(jì)投入大且難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)提取。因此,目前工業(yè)化普遍采用水提或有機(jī)溶劑提取法[7-8]。本文采用含水乙醇回流法設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行川楝子黃酮的提取,采用樹(shù)脂吸附法進(jìn)行川楝子黃酮的初步純化,為川楝子資源的進(jìn)一步研究和利用提供參考依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 藥材

    川楝子,購(gòu)于貴州省藥材公司。

    1.2 主要試劑

    亞硝酸鈉(AR,南臺(tái)華鑫化學(xué)試劑有限公司);硝酸鋁(AR,廣東汕頭市西隴化工廠);氫氧化鈉(AR,重慶川江化學(xué)試劑廠);95%乙醇(AR,重慶川江化學(xué)試劑廠);AB-8樹(shù)脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);D101樹(shù)脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);NKA-9樹(shù)脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);聚酰胺樹(shù)脂(30目-60目)(青島海洋化工生物有限責(zé)任有限公司);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(1198-081209購(gòu)于國(guó)家工程研究中心,純度≥98%)。

    1.3 主要儀器

    FA2004分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);DS-205A超聲波發(fā)生器(寧波市海曙達(dá)盛超聲波儀器廠);HH-S電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇市億通電子有限公司);UV-1801分光光度計(jì)(北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);DGG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);WFZ-2000分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司);JA1203精密電子天平(上海良平儀器儀表有限公司);KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 原材料預(yù)處理

    將購(gòu)買(mǎi)的川楝子藥材放入烘箱60℃烘48 h,粉碎,過(guò)60目篩,備用。將新購(gòu)買(mǎi)的D-101、聚酰胺樹(shù)脂浸泡在95%的乙醇中24 h,使樹(shù)脂充分溶脹,然后用95%乙醇沖洗,直到流出液加水不出現(xiàn)白色渾濁為止,再用蒸餾水沖洗至無(wú)醇味。用5%鹽酸溶液沖洗浸泡4 h,用蒸餾水洗至中性,再用5%NaOH溶液沖洗并浸泡4 h,最后用蒸餾水洗至中性,備用[9]。

    2.2 對(duì)照品溶液的制備

    稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品(60℃下干燥至恒重)21.80 mg置于100mL容量瓶中,加入一定量乙醇在超聲下使其完全溶解,乙醇定容至刻度,搖勻即得對(duì)照品溶液。

    2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    在400~600 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定對(duì)照品溶液的吸光值。測(cè)定結(jié)果顯示在509 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,因此選擇509 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

    吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL和7.0mL,分別置于7個(gè)25mL容量瓶中,均加入乙醇至8mL,加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL,搖勻后靜置6 min,加入1.0mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻后靜置6 min,加10.0mL 4%氫氧化鈉溶液,加蒸餾水至刻度,搖勻后靜置15 min,以乙醇代替對(duì)照品溶液作為空白對(duì)照,在509 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo),蘆丁濃度(mg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程和R2。

    2.4 提取方法

    稱(chēng)取一定量川楝子粉末置于圓底燒瓶中,加入一定量適宜濃度的乙醇,加熱微沸回流提取一定時(shí)間,抽濾,減壓濃縮,真空干燥備用。

    分別對(duì)上述提取方法中的液料比、乙醇濃度、提取時(shí)間三個(gè)影響因素進(jìn)行單因素考察和正交試驗(yàn)優(yōu)化。

    2.5 川楝子黃酮的含量測(cè)定

    精密量取供試品溶液3.0mL置于25mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL,搖勻后靜置6 min,加10%硝酸鋁溶液1.0mL,搖勻后靜置6 min,加入10.0mL 4%氫氧化鈉溶液,加蒸餾水至刻度,搖勻后靜置15 min,以70%乙醇代替供試液作為空白對(duì)照,在509 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算川楝子中黃酮的含量。

    2.6 D101大孔樹(shù)脂純化工藝考察

    2.6.1 動(dòng)態(tài)上樣量的考察

    樹(shù)脂的泄漏曲線與富集效率密切相關(guān),根據(jù)上述靜態(tài)吸附率和解吸率,選擇較好的一種樹(shù)脂。取一定量預(yù)處理樹(shù)脂,柱床體積(BV)為30mL,濕法裝入1.6 cm×30 cm層析柱,將川楝子粗提物水溶液(質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL)以2mL/min的流速動(dòng)態(tài)吸附,以10mL每份收集流出液,測(cè)定吸光值,計(jì)算流出液總黃酮濃度,繪制樹(shù)脂的泄漏曲線。

    2.6.2 提取液不同pH對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響

    取5根1.6 cm×30 cm的層析柱,分別裝入預(yù)處理好的D101樹(shù)脂30mL,上樣液90mL(質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL),pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,以2mL/min的流速進(jìn)行上柱,根據(jù)上樣液濃度和流出液濃度計(jì)算吸附率,確定最適樣液的pH值。

    2.6.3 上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響

    取4根1.6 cm×30 cm的層析柱,分別裝入預(yù)處理好的D101吸附樹(shù)脂30mL,上樣液90mL(質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL),分別以1、2、3、4mL/min的流速進(jìn)行上柱,根據(jù)上樣液濃度和流出液濃度計(jì)算吸附率,選出最佳上樣流速。

    2.6.4 不同濃度乙醇洗脫對(duì)解吸率的影響

    取5根1.6 cm×30 cm的層析柱,分別裝入預(yù)處理好的D101吸附樹(shù)脂30mL,上樣量均為90mL(質(zhì)量體積比為79.6 mg/mL),先以5BV蒸餾水洗脫,然后再分別用40%,50%,60%,70%和80%乙醇各50mL按2mL/min速度洗脫,洗脫液測(cè)黃酮含量,確定最佳醇洗濃度。

    2.6.5 洗脫液流速對(duì)解吸率的影響

    取4根1.6 cm×30 cm的層析柱,分別裝入吸附飽和的D101樹(shù)脂30mL,先用5 BV蒸餾水洗脫,然后用60%的乙醇5BV洗脫,分別控制流速為1、2、3、4mL/min收集洗脫液,計(jì)算洗脫率,選出最佳洗脫液流速。

    2.6.6 洗脫劑用量考察

    取1.6 cm×30 cm的層析柱,裝入吸附飽和的D101樹(shù)脂30mL,先以5BV蒸餾水洗脫,然后以60%乙醇,2mL/min的流速進(jìn)行洗脫,每10mL收集1次洗脫液,測(cè)定吸光值,計(jì)算總黃酮濃度,確定洗脫體積和終點(diǎn)。

    2.7 類(lèi)似方法考察聚酰胺樹(shù)脂純化工藝

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

    按照2.3的方法,繪制得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖1所示。從圖1可知,在8.72~61.04 mg/L的濃度范圍內(nèi),吸光度值與總黃酮濃度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.015 1x-0.038 7,R2=0.998 5。

    圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    3.2 提取單因素考察結(jié)果

    乙醇濃度對(duì)提取率的影響如圖2,結(jié)果選擇70%乙醇濃度。

    圖2 乙醇濃度的考察

    液料比對(duì)提取率的影響如圖3,結(jié)果選擇30∶1的液料比。

    圖3 液料比的考察

    提取時(shí)間對(duì)提取率的影響如圖4,結(jié)果選擇回流提取時(shí)間為3 h。

    圖4 提取時(shí)間的考察

    3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選用L9(34)正交表格,選擇液料比(A)、乙醇濃度(B)、回流時(shí)間(C)為考察因素,選擇適當(dāng)?shù)囊蛩厮椒秶源ㄩ狱S酮提取率為指標(biāo)對(duì)川楝子總黃酮提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn),見(jiàn)表1。

    正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2和表3。由表2可以看出,各因素對(duì)川楝子黃酮提取的影響主次為:液料比>乙醇濃度>提取時(shí)間。液料比和乙醇濃度具有顯著性影響。最佳提取條件為A2B2C3,即液料比35∶1,乙醇濃度70%,提取時(shí)間3.5 h。

    表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

    3.4 大孔樹(shù)脂D101工藝參數(shù)

    樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的測(cè)定如圖5,選擇60mL為合適的上樣量。

    圖5 上樣量的考察

    上樣液pH對(duì)吸附率的影響如圖6,選擇上樣液pH值為6。

    圖6 上樣液pH的考察

    上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響如圖7,最佳上樣流速選擇2mL/min。

    圖7 上樣流速的考察

    不同濃度乙醇洗脫對(duì)解吸率的影響如圖8,采用60%乙醇為洗脫劑。

    表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析表

    表3 正交試驗(yàn)方差分析

    圖8 洗脫劑濃度的考察

    洗脫液流速對(duì)解吸率的影響如圖9,選擇2mL/min為最佳洗脫流速。

    圖9 洗脫流速的考察

    3.4.6洗脫終點(diǎn)的確定,如圖10,確定90mL為洗脫劑用量。

    圖10 洗脫終點(diǎn)的考察

    聚酰胺樹(shù)脂工藝考察結(jié)果,上樣質(zhì)量體積比為78.8 mg/mL,上樣流速為2mL/min,上樣量為90mL(BV=30mL),吸附4 h后,用70%乙醇洗脫,洗脫流速為2mL/min。

    4 結(jié)論

    通過(guò)提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),得到提取最佳工藝條件為:液料比35∶1,乙醇濃度70%,回流時(shí)間3.5 h,重復(fù)回流3次,在此工藝下,提取物黃酮含量為3.71%,得率為0.585%。

    通過(guò)純化工藝的初步考察實(shí)驗(yàn),得到初步純化工藝為:提取物黃酮含量可從原來(lái)的3.71%提高到20.3%。

    5 討論

    通過(guò)對(duì)川楝子黃酮的提取實(shí)驗(yàn)得到的一些經(jīng)驗(yàn):藥材回流提取完成后冷卻到一定程度趁熱過(guò)濾,否則會(huì)形成果凍狀;減壓蒸餾時(shí)候要注意避免溶液爆沸。這可能與藥材中含有多糖皂苷等雜質(zhì)有關(guān)。乙醇回流提取重復(fù)性好,污染小,成本低,容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化,同時(shí)采用紫外分光光度法測(cè)定黃酮含量簡(jiǎn)便快速。采用大孔樹(shù)脂法進(jìn)行初步純化,對(duì)黃酮含量流失較少,工藝參數(shù)可控。本實(shí)驗(yàn)可為川楝子黃酮的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考。

    [1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

    [2]孫建.川楝子化學(xué)成分及炮制質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué),2009.

    [3]劉小玲.川楝素提取物的制備和抗腫瘤機(jī)理研究[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2009.

    [4]周英,郭東貴,王慧娟,等.川楝子抑制破骨細(xì)胞活性組份的研究[J].中藥材,2009,32(9):1433-1435.

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    [9]張強(qiáng)祖.中藥材黃酮的大孔樹(shù)脂吸附工藝研究及生產(chǎn)線設(shè)計(jì)[D].上海:華東理工大學(xué),2013.

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