新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡的研制

羅奕銘

（廣州瑞森生物科技股份有限公司，廣東廣州 511400）

進(jìn)入21世紀(jì)以來，食品安全問題受到越來越多人的重視，我國多起瘦肉精中毒事件的頻繁發(fā)生，引起社會(huì)對食品安全監(jiān)管的強(qiáng)烈不滿。瘦肉精[1,2]是一類藥物，而不是一種特定的物質(zhì)，是指能夠促進(jìn)瘦肉生長的藥物添加劑，例如鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、溴布特羅、馬布特羅、馬賁特羅、塞曼特羅、齊帕特羅、妥布特羅和特布他林[3,4]等。瘦肉精能使豬提高生長速度，增加瘦肉率，豬毛色紅潤光亮，收腹，賣相好；屠宰后，肉色鮮紅，脂肪層極薄，往往是皮貼著瘦肉，瘦肉豐滿。但對人體會(huì)產(chǎn)生副作用[5]，輕則導(dǎo)致心律不整，嚴(yán)重一點(diǎn)就會(huì)導(dǎo)致心臟病[6]。

目前檢測瘦肉精主要有方法有色譜技術(shù)和免疫分析技術(shù)等方法。色譜法包括高效液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法。高效液相色譜（HPLC）法的優(yōu)點(diǎn)是檢測精密度高，假陽性率低，但存在樣品處理時(shí)間長檢測過程繁瑣、儀器昂貴、難于操作等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。而氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）檢測前需要對分子上的羥基、氨基等極性基團(tuán)衍生化，難以作為常規(guī)方法應(yīng)用，不能進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

免疫分析檢測包括放射性免疫分析技術(shù)、酶免疫分析技術(shù)和金標(biāo)免疫分析技術(shù)等。放射性免疫分析技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確、快速、操作簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)[7～9]。但其所用儀器昂貴，且使用的放射性同位素存在輻射和污染，其廢棄物不易處理，限制了此種方法的廣泛應(yīng)用。酶聯(lián)免疫法和金標(biāo)免疫法是目前檢測瘦肉精較高效的免疫分析技術(shù)，但常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測一次只能檢測一種瘦肉精，所以如果要對多種瘦肉精進(jìn)行檢測則需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，常規(guī)的金標(biāo)免疫檢測也有此缺陷，且傳統(tǒng)的檢測方法只能進(jìn)行粗略的陰性與陽性判定，且判定時(shí)間相對較短，因此，我們需要一種能夠同時(shí)檢測多種瘦肉精的新型檢測方法[10,11]。

本研究建立一種快速、有效、高靈敏度的新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡[12]，試驗(yàn)根據(jù)膠體金免疫層析原理，實(shí)現(xiàn)特異性免疫檢測。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

主要試劑和儀器：牛血清白蛋白（BSA）（天津正將高科公司）；聚乙二醇（PEG）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（北京鼎國生物）；檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸鈉、疊氮鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、吐溫-20、鹽酸（廣州化學(xué)試劑廠）；氯金酸（上海國藥）；羊抗鼠抗體（武漢博士德）；新型瘦肉精多克隆抗體、瘦肉精-BSA（瑞森生物）；硝酸纖維素膜（Sartorius）；聚酯膜、玻璃纖維（Pall)；吸水紙、磁白板（上海金標(biāo)）；塑料卡、鋁箔袋（廣州）。

三維劃膜噴金儀HM3030、金標(biāo)試紙分切機(jī)WM-100（上海金標(biāo)）；連續(xù)點(diǎn)膜機(jī)R5DD-2（韓感）；磁力攪拌器（國產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金溶液的制備

量取40 mL純水于潔凈的圓底燒杯，用磁力攪拌器加入至沸騰，加入0.04 mL 10%氯金酸溶液沸騰5 min后加入0.096 mL 10%檸檬酸三鈉溶液，保持沸騰10 min。待溶液溫度降至室溫后裝入棕色密封容量瓶中，避光保存。

1.2.2 金標(biāo)記新型瘦肉精多克隆抗體的制備

量取20 mL膠體金溶液，倒入潔凈離心管內(nèi)，用0.1 M碳酸鉀溶液和0.1 M鹽酸溶液調(diào)膠體金溶液pH值至8.2。再稱取0.186 mg的新型瘦肉精多克隆抗體加入到膠體金溶液內(nèi)，振蕩混勻，室溫放置20 min后加入0.02 mL 10% BSA溶液，振蕩混勻，室溫放置20 min后，把金標(biāo)記的抗體溶液分裝到離心管內(nèi)，11000 r/min離心15 min。吸取上清液。再加入10 mL 0.1 M磷酸鹽緩沖液將沉淀混勻，于11000 r/min離心15 min，吸取上清液后加入4 mL金標(biāo)緩沖液將沉淀混勻，得到金標(biāo)記新型瘦肉精多克隆抗體溶液。

1.2.3 金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備

量取0.42 mL金標(biāo)新型瘦肉精多克隆抗體溶液倒入潔凈小離心管內(nèi)。設(shè)定噴金儀主機(jī)程序：噴金濃度為20 μL/cm，平臺移動(dòng)速度為132 mm/s，再將玻璃纖維膜放置于噴金儀平臺，按設(shè)定程序?qū)⒔饦?biāo)抗體均勻噴灑于玻璃纖維膜上。將噴好的金標(biāo)抗體結(jié)合墊放置于真空干燥箱內(nèi)室溫抽干6 h后，再放于有干燥劑的自封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 劃膜

稱取0.332 mg瘦肉精-BSA原液于潔凈離心管內(nèi)，加入劃膜緩沖液稀釋至終濃度為1 mg/mL，稱取1.79 mg羊抗鼠二抗溶液于另一離心管內(nèi)，加入劃膜緩沖液稀釋終濃度為2 mg/mL。將硝酸纖維素膜放置于劃膜儀平臺，兩端用壓條固定，設(shè)定劃膜儀主機(jī)程序：劃膜濃度為2 μL/cm，平臺移動(dòng)速度為128 mm/s。按設(shè)定程序?qū)⑹萑饩?BSA按一定比例混合后和二抗劃于硝酸纖維素膜上后置于真空干燥箱內(nèi)室溫抽干6 h，干燥后封袋保存?zhèn)溆?。使瘦肉?BSA所劃線標(biāo)記為檢測線T，羊抗鼠二抗所劃線標(biāo)記為質(zhì)控線C。

1.2.5 膠體金免疫層析新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡組裝

將樣品墊、膠體金墊、已包被好抗原抗體的NC膜、吸水紙依次粘貼到PVC底板上，切割成條，裝卡封口密封，置于干燥器中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 樣品制備

1.2.6.1 陰性樣品的制備

經(jīng)GC-MS法（農(nóng)業(yè)部1031號公告-3-2008中的“豬肝和豬尿中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測-氣相色譜-質(zhì)譜法”）檢測克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅、班布特羅、妥布特羅、特布他林、氯丙那林、馬布特羅、溴布特羅陰性的80份尿液。

1.2.6.2 克倫特羅

（萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅、班布特羅、妥布特羅、特布他林、氯丙那林、馬布特羅、溴布特羅）添加陽性樣品的制備。見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品配制Table 1 Preparation of Standards

1.2.6.3 實(shí)測陽性樣品的準(zhǔn)備

10份經(jīng)GC-MS檢測克倫特羅為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于3 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測萊克多巴胺為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于5 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測沙丁胺醇為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于3 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測西馬特羅為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于5 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測班布特羅為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于5 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測妥布特羅為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于5 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測特布他林為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于8 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測氯丙那林為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于5 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測馬布特羅為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于3 μg/L）。10份經(jīng)GC-MS檢測溴布特羅為陽性的實(shí)際豬尿樣品（濃度均大于8 μg/L）。見表2。

表2 實(shí)際豬尿樣品Table 2 Pratical urine sample of pig

1.2.7 靈敏度

取3批次新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡分別檢測添加克倫特羅/沙丁胺醇濃度為0 μg/L、1 μg/L、3 μg/L和5 μg/L的豬尿樣；添加萊克多巴胺/西馬特羅/班布特羅/妥布特羅/氯丙那林/馬布特羅濃度為0 μg/L、3 μg/L、5 μg/L和8 μg/L的豬尿樣；添加特布他林/溴布特羅為0 μg/L、5 μg/L、8 μg/L和10 μg/L的豬尿樣各10份。室溫條件下操作，肉眼觀測進(jìn)行判定。

1.2.8 假陽性率試驗(yàn)

新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡對80份經(jīng)GC-MS檢測為陰性的豬尿進(jìn)行檢測，并分別以含克倫特羅/沙丁胺醇為0和3 μg/L的豬尿；特布他林/溴布特羅為0和8 μg/L的豬尿；萊克多巴胺/西馬特羅/班布特羅/妥布特羅/氯丙那林/馬布特羅為0和5 μg/L的豬尿?yàn)殛幮詫φ蘸完栃詫φ?，?jì)算假陽性率。

1.2.9 假陰性率試驗(yàn)

新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡對40份陽性豬尿（10份為3 μg/L克倫特羅/沙丁胺醇陽性添加樣品，10份為8 μg/L特布他林/溴布特羅陽性添加樣品，10份為5 μg/L萊克多巴胺/西馬特羅/班布特羅/妥布特羅/氯丙那林/馬布特羅陽性添加樣品，10份為濃度均大于3 μg/L實(shí)測克倫特羅/沙丁胺醇陽性樣品，10份為濃度均大于8 μg/L實(shí)測特布他林/溴布特羅陽性樣品，10份為濃度均大于5 μg/L實(shí)測萊克多巴胺/西馬特羅/班布特羅/妥布特羅/氯丙那林/馬布特羅陽性樣品）進(jìn)行檢測，并分別以含克倫特羅/沙丁胺醇0和3 μg/L尿樣；特布他林/溴布特羅0和8 μg/L尿樣；萊克多巴胺/西馬特羅/班布特羅/妥布特羅/氯丙那林/馬布特羅0和5 μg/L尿樣為陰性對照和陽性對照，計(jì)算假陰性率。

1.2.10 新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡的批內(nèi)和批間重復(fù)

將同批和不同批次的新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡分別檢測上述陰性樣品、陽性樣品、實(shí)測陽性樣品，每個(gè)濃度重復(fù)10次，觀察其重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

圖1 試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of colloidal gold strip

膠體金免疫試紙條的作用原理主要有雙抗夾心和競爭結(jié)合兩種。本試驗(yàn)研制的新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡采用了競爭原理，如圖1所示拆開卡殼的試紙條，底板為PVC底板（雙面膠白色塑料板），從加樣處開始分別為樣品吸收墊、膠體金墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜（NC膜)和吸水墊。膠體金墊上噴涂膠體金標(biāo)記的新型瘦肉精多克隆抗體，NC膜上分別噴涂偶聯(lián)新型瘦肉精-BSA（檢測線T）和羊抗鼠IgG（質(zhì)控線C）。該法檢測線T出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果顯示為新型瘦肉精陰性；檢測線無條帶，結(jié)果顯示為新型瘦肉精陽性。這是因?yàn)楫?dāng)被檢物質(zhì)溶液中不含新型瘦肉精時(shí)，玻璃纖維上釋放的膠體金標(biāo)記新型瘦肉精多克隆抗體便會(huì)被檢測線處的偶聯(lián)抗原新型瘦肉精-BSA物質(zhì)識別并結(jié)合，因而被截留在該處，當(dāng)累積到一定程度便出現(xiàn)紅色線，但弱陽性時(shí)會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)強(qiáng)度減弱的檢測線；當(dāng)被檢物質(zhì)溶液中新型瘦肉精的濃度達(dá)到一定時(shí)，新型瘦肉精與膠體金標(biāo)記的全部多抗體的反應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，這樣當(dāng)免疫膠體金到達(dá)檢測線時(shí)不能再與偶聯(lián)抗原發(fā)生反應(yīng)，因而不出現(xiàn)紅色線。無論被檢測物質(zhì)中有無新型瘦肉精，膠體金標(biāo)記的新型瘦肉精多克隆抗體都會(huì)與噴涂在NC膜上的羊抗鼠IgG發(fā)生免疫反應(yīng)，即在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紅色線。

2.1 靈敏度與滴尿量

圖2 梯度濃度顯色結(jié)果Fig.2 the results of color gradient concentration

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，三個(gè)批號各梯度濃度的檢測卡在3 min內(nèi)結(jié)果呈梯度變化，CLEN 3 μg/L、RAC 5 μg/L、SAL 3 μg/L、SiT 5 μg/L、BUT 5 μg/L、BBT 5 μg/L、TER 8 μg/L、CLOR 5 μg/L、MAT 5 μg/L、BUB8 μg/L的添加樣品質(zhì)控帶顯色，檢測帶無明顯顯色；CLEN 5 μg/L、RAC 8 μg/L、SAL 5 μg/L、SiT 8 μg/L、BUT 8 μg/L、BBT 8 μg/L、TER 10 μg/L、CLOR 8 μg/L、MAT 8 μg/L、BUB 10 μg/L的添加樣品質(zhì)控帶顯色，檢測帶無顯色；0 μg/L，樣品質(zhì)控帶和檢測帶均顯色。表明膠體金免疫層析試驗(yàn)具有良好的敏感性和特異性，故該膠體金檢測試紙卡的檢測限可定為CLEN 3 μg/L、RAC 5 μg/L、SAL 3 μg/L、SiT 5 μg/L、BUT 5 μg/L、BBT 5 μg/L、TER 8 μg/L、CLOR 5 μg/L、MAT 5 μg/L、BUB 8 μg/L。滴尿量約為70～90 μg/L，對判讀效果無大影響，但發(fā)現(xiàn)滴尿量超過200 μg/L以上，膠體金檢測卡會(huì)出現(xiàn)死金現(xiàn)象、或者層析墊因浸泡太多液體而出現(xiàn)假陽性，通過圖示可知，三個(gè)批次的穩(wěn)定性及色度辨析達(dá)到判讀要求，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，對監(jiān)管檢測工作提供便捷的檢測利器。

2.2 假陽性率試驗(yàn)

一般檢測豬尿出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象主要由以下因素導(dǎo)致：喂養(yǎng)的獸藥會(huì)產(chǎn)生干擾性物質(zhì)，飼料中金屬離子濃度過高，過夜未保存好的豬尿影響檢測結(jié)果，尿液含有特殊的、或者其他新型瘦肉精導(dǎo)致交叉反應(yīng)等。現(xiàn)對80份經(jīng)GC-MS法檢測為陰性的豬尿進(jìn)行檢測，以該方法檢測限CLEN 3 μg/L、RAC 5 μg/L、SAL 3 μg/L、SiT 5 μg/L、BUT 5 μg/L、BBT 5 μg/L、TER 8 μg/L、CLOR 5 μg/L、MAT 5 μg/L、BUB 8 μg/L為判定限進(jìn)行判斷，80份尿樣均為陰性，該80份樣品的假陽性率為0。見表3。

表3 豬尿陰性樣本檢測結(jié)果Table 3 Results of negative samples of pig urine

2.3 假陰性率試驗(yàn)

新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡對160份陽性豬尿進(jìn)行檢測，以該方法檢測限CLEN 3 μg/L、RAC 5 μg/L、SAL 3 μg/L、SiT 5 μg/L、BUT 5 μg/L、BBT 5 μg/L、TER 8 μg/L、CLOR 5 μg/L、MAT 5 μg/L、BUB 8 μg/L為判定限進(jìn)行判斷，160份尿樣均為陽性，該160份樣品的假陰性率為0。見表4。

表4 豬尿陽性樣本檢測結(jié)果Table 4 Results of positive samples of pig urine

BUT陽性樣品 檢測卡（10份） 陽性陽性陽性陽性陽性陽性 陽性 陽性 陽性陽性添加濃度/(μg/L) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5實(shí)測BUT陽性樣品 GC-MS測定/(μg/L) 6.8 8.3 7.8 9.2 7.9 7.9 9.1 8.3 8.2 8.8 BBT陽性樣品 檢測卡（10份） 陽性陽性陽性陽性陽性陽性 陽性 陽性 陽性陽性添加濃度/(μg/L) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5實(shí)測BBT陽性樣品 GC-MS測定/(μg/L) 7.2 7.2 8.6 8.4 7.9 8.9 91 8.2 7.5 9.1 TER陽性樣品 檢測卡（10份） 陽性陽性陽性陽性陽性陽性 陽性 陽性 陽性陽性添加濃度/(μg/L) 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8實(shí)測TER陽性樣品 GC-MS測定/(μg/L) 10.911.29.3 10.29.8 10.911.1 9.2 9.9 11.1 CLOR陽性樣品 檢測卡（10份） 陽性陽性陽性陽性陽性陽性 陽性 陽性 陽性陽性添加濃度/(μg/L) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5實(shí)測CLOR陽性樣品 GC-MS測定/(μg/L) 8.5 8.4 8.7 7.7 8.3 8.5 7.4 8.9 8.9 7.9 MAT陽性樣品 檢測卡（10份） 陽性陽性陽性陽性陽性陽性 陽性 陽性 陽性陽性添加濃度/(μg/L) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5實(shí)測MAT陽性樣品 GC-MS測定/(μg/L) 8.0 9.2 8.7 7.9 6.7 8.3 9.5 8.3 8.5 8.8 BUB陽性樣品 檢測卡（10份） 陽性陽性陽性陽性陽性陽性 陽性 陽性 陽性陽性添加濃度/(μg/L) 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8實(shí)測BUB陽性樣品 GC-MS測定/(μg/L) 9.8 10.410.810.79.9 9.9 11.3 11.2 10.710.4

3 總結(jié)

本文研究成功建立檢測新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡的方法，通過大量樣本的測試，梯度濃度顯色結(jié)果表明：新型瘦肉精多殘留膠體金檢測卡的靈敏度分別為CLEN 3 μg/L、RAC 5 μg/L、SAL 3 μg/L、SiT 5 μg/L、BUT 5 μg/L、BBT 5 μg/L、TER 8 μg/L、CLOR 5 μg/L、MAT 5 μg/L、BUB 8 μg/L，濃度梯度性可以有效確認(rèn)樣本的半定量結(jié)果，其檢測最快觀察時(shí)間為3 min，若想顯色更加穩(wěn)定，可以在5 min后進(jìn)行判讀，本研究沒有體系化的測試檢測卡的保質(zhì)期，沒法確保產(chǎn)品在長期保存時(shí)間下的穩(wěn)定性，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行保質(zhì)期穩(wěn)定性測試，通過大批實(shí)際樣品及加標(biāo)樣品的測試，批內(nèi)和批間重復(fù)性為100%，假陽性率和假陰性率均為0，達(dá)到預(yù)期的測試效果，同時(shí)，測通過測試，檢測滴加的最優(yōu)尿液量為70～90 μL。該方法應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)一個(gè)樣本可同時(shí)檢測8種類似的激素，大大降低了檢測時(shí)間和檢測成本，比單檢技術(shù)更有優(yōu)勢，這方法既簡捷又可靠，是一種值得推廣的定性篩選方法，可作為液相色譜等儀器法的補(bǔ)充，通過與孫曉亮[12]針對豬尿中30種不同瘦肉精的藥物殘留進(jìn)行比對，雖沒達(dá)到全面覆蓋所有的新型瘦肉精，但適合現(xiàn)場檢測，本方法屬于快速檢測法，是豬尿初篩的便捷途徑，能有廣泛應(yīng)用于全國基礎(chǔ)檢測，減少資源的浪費(fèi)，同時(shí)，也作為新型瘦肉精快速檢測的利器，在我國家禽生產(chǎn)場、動(dòng)物性食品加工廠、國家和地方的檢驗(yàn)/監(jiān)督部門、食品衛(wèi)生與安全檢驗(yàn)/監(jiān)察部門等行業(yè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用，將為我國農(nóng)藥/獸藥殘留檢測和監(jiān)控計(jì)劃提供技術(shù)支撐，促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)全面發(fā)展，提升食品安全和質(zhì)量等級、提高市場競爭力和增加進(jìn)出口貿(mào)易。

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