固相萃取-同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測嬰幼兒配方米粉中的五種甾醇

何仲強，林曉佳，陳樹東，吳鐘玲，許麗珠

（1.廣州市標準化研究院，廣東廣州 510050）（2.廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東廣州 511447）（3.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州 511447）

嬰幼兒米粉是指母乳無法滿足嬰幼兒營養(yǎng)需要時或者嬰兒斷奶后，用以補充嬰幼兒營養(yǎng)的輔助食品，由于嬰幼兒的消化能力較弱，將大分子的蛋白消化成小分子肽的能力低，而且嬰幼兒的免疫系統(tǒng)又尚未發(fā)育成熟，嬰幼兒營養(yǎng)米粉的質(zhì)量直接影響到嬰幼兒的的發(fā)育和對疾病的抵抗能力，嬰幼兒時期的營養(yǎng)與整個生命過程中的生命質(zhì)量息息相關(guān)，而嬰幼兒飲食攝入相對單一，所以，作為嬰幼兒第一大類輔食的嬰幼兒營養(yǎng)米粉，其營養(yǎng)密度、營養(yǎng)素含量和配比情況對嬰幼兒的生長發(fā)育顯得尤其重要。近年來，一系列與嬰幼兒食品安全相關(guān)的事件的出現(xiàn)，使得嬰幼兒食品安全問題更加受到社會的關(guān)注。發(fā)達國家對于嬰幼兒配方食品相當?shù)闹匾?，我國的嬰幼兒輔食起步較晚，直到八十年代，我國才開始出現(xiàn)較大規(guī)模的嬰幼兒強化輔助食品的生產(chǎn)[1]，嬰幼兒配方米粉是以大米為主要原料，以糖、蔬菜、水果、蛋類、肉類和豆類等為選擇性配料，并加入鈣和鐵等礦物質(zhì)及維生素等而加工制成的嬰幼兒補充食品。植物甾醇（phytosterol or plant sterol）生物界普遍存在的一種物質(zhì)，也叫固醇，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇4種[2]，植物甾醇幾乎存在于所有植物性食物中，但植物甾醇不能由人體自行合成，只能從食物中攝取。植物油和谷物等是其最主要的膳食來源，其次是蔬菜、水果和豆類等，膽固醇（膽甾醇）是構(gòu)成大腦及神經(jīng)組織的重要成分，幫助膽堿形成，是人體不可或缺的脂蛋白成分，膽固醇是天然存在于母乳中的成分，是嬰兒成長必須補充的物質(zhì)。與植物甾醇結(jié)構(gòu)類似，但是在人體內(nèi)的吸收和合成卻又相互抑制，人體腸道對外源膽固醇的吸收率相對較高，而植物甾醇能夠抑制人體對膽固醇的吸收、促進膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生化合成等作用[3～5]。目前，市場上的嬰幼兒米粉呈現(xiàn)出配料多元化，口味多樣化的趨勢，很多新興的輔料被用于加工嬰幼兒米粉中，由于的嬰幼兒輔食原輔料來源廣泛，檢測和分析其中的植物甾醇和膽固醇的含量對于評價嬰幼兒配方米粉的質(zhì)量和評估對嬰幼兒健康的影響都有著非常積極的意義。

如今，各類嬰幼兒米粉在市場上已被廣泛生產(chǎn)和銷售，而對于嬰幼兒米粉中植物甾醇類物質(zhì)缺乏相關(guān)標準和法規(guī)。我國GB 10769-2010《食品安全國家標準 嬰幼兒谷類輔助食品》感官、營養(yǎng)成分、污染物、微生物指標進行了規(guī)定。但對于嬰幼兒米粉中植物甾醇類物質(zhì)無相關(guān)的規(guī)定[6]。因此開展嬰幼兒米粉中植物甾醇類物質(zhì)的檢測，建立相關(guān)檢測方法，對保障嬰幼兒米粉質(zhì)量安全和進行相關(guān)安全隱患調(diào)查及風險評估具有積極意義。目前，國內(nèi)外對甾醇類物質(zhì)的檢測主要針對植物油等基質(zhì)的產(chǎn)品，針對嬰幼兒配方食品方面的相關(guān)檢測方法未見報道。檢測甾醇的方法主要有電化學分析法[7]、薄層色譜-分光光度法[8]、火焰離子化氣相色譜法[9]、高效液相色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]和多維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜等[12]。前處理一般先將油脂進行皂化和水解，然后再進行分離檢測[8～16]，甚至還需進行衍生化后才能上機檢測[17]，過程相當繁瑣，且靈敏度不高。

本文前處理采用固相萃取方式，通過加入氘代同位素內(nèi)標，無需皂化和衍生化，建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定5種目標甾醇的方法。方法靈敏度高、結(jié)果準確可靠、回收率和穩(wěn)定性均能滿足檢測要求，適用于大批量樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

7890A-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），配7683自動進樣器（美國Agilent公司；固相萃取裝置（Waters 公司）；MS 3 basic漩渦混合器（德國IKA公司）；KDC-400低速離心機（科大創(chuàng)新公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore 公司）；Turbo LV濃縮工作站（美國Biotage公司）。

1.2 標準品與試劑

2,2,3,4,4,6-d6膽固醇（Cholesterol內(nèi)標，純度：98.8%美國Sigma）；膽固醇（Cholesterol，德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度95%）、菜油甾醇（Campesterol，純度99.5%，美國Chromadex）；菜籽甾醇（Brassicasterol，純度99.5%，日本W(wǎng)AKO）；豆甾醇（Stigmasterol，對照品，上海詩丹德）；β-谷甾醇（β-Sitosterol，對照品，上海安譜）；正己烷（分析純，廣州化學試劑廠）；乙醚（分析純，廣州化學試劑廠）；丙酮（HPLC級，德國Merck公司）；超純水（18.2 MΩ）：實驗室自制；洗脫液：將10 g氫氧化四甲基銨（分析純，廣州化學試劑廠）加人50 mL超純水，溶解后，用異丙醇（分析純，廣州化學試劑廠）定容到1000 mL；固相萃取小柱（Florisil，1.0 g/6 mL，CNW/上海安譜）。

1.3 溶液配制

標準儲備溶液：稱取各標準品和內(nèi)標物0.1 g（精確到0.1 mg），用正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用正己烷定容，配成2000 mg/L的單標標準溶液儲備液。置于4 ℃冰箱保存。

標準甾醇混合標準工作液：分別移取適量的單標儲備液，用異丙醇逐級稀釋成適合濃度的5種甾醇混合標準工作液。均置于4 ℃冰箱保存。

1.4 前處理

1.4.1 皂化法

取粉碎均勻后的米粉樣品1.0 g于三角瓶中，加入25 μg氘代膽固醇內(nèi)標，加入10 mL水渦旋混合均勻，加入10%氫氧化鉀乙醇溶液(m/V) 10 mL，在80 ℃水浴中回流加熱30 min后，加入10 g NaCl，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用50 mL正己烷分3次萃取，水洗至pH中性后以無水硫酸鈉脫水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40 ℃蒸干，用5.0 mL丙酮定容，混勻后上機。

1.4.2 SPE法

萃?。喝》鬯榫鶆蚝蟮拿追蹣悠?.0 g于50 mL塑料離心管中，加入25 μg氘代膽固醇內(nèi)標，10 mL水和5 mL乙醇渦旋混合均勻，加入4 g NaCl，用25 mL乙醚分3次萃取，于Turbo LV濃縮工作站濃縮至干，用5 mL正己烷溶液溶解，渦旋振蕩均勻，備用。

凈化：稱取1.0 g無水硫酸鈉加入SPE小柱中，然后加入10 mL正己烷溶液活化；將5 mL樣品液移入SPE小柱，用10 mL正己烷沖洗比色管后轉(zhuǎn)移至SPE柱中；用10 mL 5%乙醚/正己烷（V/V）淋洗液進行淋洗，再用10 mL洗脫液洗脫并收集于潔凈干燥的氮吹管中，提取液于60 ℃氮吹緩慢濃縮至近干，以異丙醇渦旋復溶定容至5.0 mL。

1.5 儀器條件

1.5.1 氣相色譜（GC）測定條件

色譜柱：HP-5MS石英管毛細管柱氣相色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度：280 ℃；進樣量：1 μL，不分流進樣；載氣：高純氦氣（He），流速1.5 mL/min，恒流模式；柱溫程序：初始溫度220 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持15 min；溶劑延遲為8 min。

1.5.2 質(zhì)譜（MS）條件

圖1 六種目標物質(zhì)的選擇離子色譜圖Fig.1 Selected ion chromatograms of six target analytes

離子源：EI，70 eV；離子源溫度230 ℃；電子倍增器電壓1200 V；采用選擇離子掃描（SIM）模式，目標物質(zhì)的保留時間和選擇離子見表1，六種目標物質(zhì)的選擇離子圖譜見圖1。

表1 甾醇的保留時間、特征離子Table 1 Characteristic ions and retention time of five sterols

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方式的選擇

圖2 不同凈化前處理方式下目標物質(zhì)的選擇離子色圖譜Fig.2 Selected ion chromatograms of six sterols and the internal standard with different extraction methods

由于嬰幼兒配方米粉配料種類豐富，樣品基質(zhì)復雜，選擇高效、快速分離目標分析物的前處理方式是前處理的關(guān)鍵，研究分別采用皂化法和固相萃?。⊿PE）兩種方法對同一米粉樣品進行萃取和凈化，并采用樣品加標對兩種不同的前處理方式進行比較。

結(jié)果表明，相對于皂化法，固相萃取法基質(zhì)雜峰干擾更少，見圖2，說明固相萃取法凈化效果更好[18]。通過比較兩種不同前處理方式下的加標回收率，見圖3。在同樣的條件下，SPE法的加標回收率更好。且采用SPE方式前處理耗時更少，使用溶劑和對環(huán)境的影響明顯優(yōu)于皂化法，故采用Florisil固相萃取小柱吸附分離作為實驗的前處理方式。

圖3 不同凈化前處理方式下目標物質(zhì)的加標回收率Fig.3 Spiked recoveries of target analytes with different pretreatments of extraction

2.2 凈化條件的選擇

圖4 不同比例淋洗液下6種目標物的流失率Fig.4 Loss rate of six target analytes with different ratios of eluent

圖5 不同體積淋洗液下6種目標物的流失率Fig.5 Loss rate of six target analytes with different volumes of eluent

為了獲得較好的凈化效果，固相萃取小柱、淋洗液和洗脫液需要根據(jù)目標物的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)來確定，研究采用弗羅里硅土是高選擇性的吸附劑，在正相條件下能夠從非極性基質(zhì)中強烈吸附極性分析物。采用Folorisil固相萃取小柱來凈化樣品，可以顯著降低基質(zhì)中極性化合物對分析物的干擾[19]。

樣品經(jīng)過萃取氮吹后，保留下來的主要是甘油三酯為主的脂類，在固相萃取時，淋洗是一個非常重要的步驟。淋洗溶劑的選擇必須首先必須保證能夠最大限度的去除非目標化合物，如去除甘油三酯和脂肪酸酯等大量干擾物質(zhì)。

其次，在淋洗去雜時，必須不能影響目標化合物和萃取材料之間的結(jié)合，防止游離甾醇在此階段的流失。

最后一點是在保證淋洗效果的前提下，有機溶劑的用量盡量少。作為油脂主體成分的甘油三酯具有三個酯鍵，分子帶有微弱極性，因此可用弱極性有機溶劑將其淋洗去除，但操作中要避免使用極性過高的溶劑，以免將游離甾醇一并脫除[20]。

本研究通過不同比例的正己烷與乙醚混合溶劑（極性分別為0.009、0.228）以不同的體積進行淋洗，見圖4和圖5。

通過檢測淋洗流出液中所含目標物的百分比來確定淋洗液的比例，同時確定淋洗液的使用量。由于油脂主體成分的甘油三酯帶弱極性，在Folorisil固相萃取小柱吸附的情況下可以采用較弱極性的淋洗液將其淋洗去除，隨著淋洗液極性的增加，極性相對于甘油三酯較強的甾醇也會在淋洗液的作用下失去保留。通過實驗結(jié)果表明，在10 mL正己烷+乙醚（95+5）的淋洗液的條件下，6種目標物在Folorisil固相萃取小柱上的能較好保留下來；同時，甘油三酯等脂類干擾物質(zhì)也能通過淋洗流出液的形式去除，達到去除干擾的目的。

固相萃取的最后階段就是選擇合適的洗脫溶劑將甾醇洗脫下來，根據(jù)樣品的特性，需要相對較高的溶劑極性才能將保留在Folorisil固相萃取小柱中的6種目標物完全洗脫下來。方法采用氫氧化四甲基銨異丙醇溶液作為洗脫劑，目的是在強堿性的條件下使可能存在的結(jié)合態(tài)的甾醇分解為游離態(tài)而被洗脫下來。

選用有機強堿氫氧化四甲基銨而不用氫氧化鉀或氫氧化鈉，一是因為該有機強堿和異丙醇相溶性相對較好；二是殘留在樣液中的有機堿在上機進樣分析時高溫受熱而分解為二甲基醚和三甲胺氣體，分析結(jié)束后和載氣一起排出色譜柱，不會色譜柱和儀器造成影響，對結(jié)果也不產(chǎn)生干擾，這是無機強堿氫氧化鉀或氫氧化鈉不具備的特性。

在洗脫劑中添加了適量的水，目的是增大洗脫溶液的極性并使萃取柱填料吸水后脫活，對目標物的吸附能力降低而更易被洗脫出來[18,19]。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

分別對系列濃度5種甾醇的混合標準工作溶液進行測定，選擇合適的濃度，并在每個濃度點各加入25 μg氘代膽固醇內(nèi)標，以各甾醇相應質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標，以各濃度點甾醇峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標y，進行線性回歸分析，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，內(nèi)標曲線在特定濃度下相關(guān)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9995。并根據(jù)信噪比S/N=3，方法檢出限均為50 μg/kg。

表2 五種目標物質(zhì)的標準曲線及檢出限Table 2 Standard curves and detection limits of five target analytes

2.4 方法的精密度和回收率

在實驗條件下，取同一樣品，分別以低、中、高三個不同的濃度水平分別添加已知量的膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇，同時添加等量的氘代膽固醇內(nèi)標25 μg，按優(yōu)化后的樣品處理方法進行測定，每個濃度水平平行測定6次，計算各組分的相對標準偏差(RSD)和加標回收率，結(jié)果見表3?？梢?，在添加濃度范圍內(nèi)，甾醇的平均回收率在91.9%～107%之間，相對標準偏差（RSD，n=6）在3.1～4.6%之間，說明該方法具有良好的回收率與精密度。

表3 5種甾醇的相對標準偏差和回收率(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of five sterols

2.5 實際樣品的測定

利用本研究開發(fā)的SPE前處理方法，在研究的實驗條件下，分別檢測了15批次不同的嬰幼兒配方米粉中5種甾醇的含量。結(jié)果如表4所示：其中，膽固醇含量為0.74～16.1 mg/100 g；菜油甾醇含量為1.2～3.3 mg/100 g；豆甾醇含量為1.3～2.4 mg/100 g；β-谷甾醇含量為8.0～13.8 mg/100 g；菜籽甾醇在15批次的嬰幼兒米粉中均未檢出。通過結(jié)果分析說明，菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇四種植物甾醇在以大米飯為主要原料的嬰幼兒米粉中含量相對穩(wěn)定，而膽固醇在不同的米粉中含量差別較大，說明了受嬰幼兒配方米粉的輔配料的影響較大。嬰幼兒配方米粉樣品經(jīng)SPE處理后，5種甾醇得到了有效分離，色譜圖甾醇區(qū)未見其它干擾物質(zhì)，能夠滿足于甾醇的定性和定量分析。

表4 15份嬰幼兒配方米粉樣品中甾醇的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of sterols in fifteen infant formula rice flour samples

3 結(jié)論

本研究建立了以固相萃取為前處理方式的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定嬰幼兒配方米粉中5種甾醇，樣品經(jīng)SPE小柱分離萃取后，無需皂化和衍生，并通過加入氘代同位素內(nèi)標以實現(xiàn)對甾醇的精確定性和準確定量。在實驗條件下，考察了方法檢出限、回收率和精密度等方法學技術(shù)指標，表明方法準確靈敏、回收率和精密度良好。本方法操作簡便、快速、結(jié)果可靠，適用于快速測定嬰幼兒配方米粉中5種甾醇的含量。

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