微滴式數(shù)字PCR對(duì)肉制品中羊肉和豬肉定量分析

陳晨，張巖，李永波，李鵬，李永艷，張濤，張薇，周巍，張志勝

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000）（2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050071）（3.32142部隊(duì)廚師培訓(xùn)中心，河北保定 071000）

隨著我國經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，不同肉類價(jià)格差異，使“摻雜使假”成為食品加工、流通和餐飲中存在的重要問題[1]。一些不法商販用一些廉價(jià)肉冒充高價(jià)肉進(jìn)行出售，這對(duì)于市場(chǎng)的監(jiān)管是不利，這需要有關(guān)部門建立相關(guān)的檢測(cè)方法。PCR技術(shù)是檢測(cè)動(dòng)物源性成分中發(fā)展較為完善、靈敏度及準(zhǔn)確度都相對(duì)較好的技術(shù)手段[2,3]。用現(xiàn)有常見的熒光PCR進(jìn)行檢測(cè)不能區(qū)分是故意摻假還是加工過程中無意的帶入，這就給監(jiān)管部門帶來了一定的困難，需要可靠的定量技術(shù)作為依托。

熒光PCR鑒別動(dòng)物源性成分，一般根據(jù)線粒體進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)。線粒體基因進(jìn)化速度快，物種的區(qū)分度高，在科研上宜為物種分類的靶基因[4～8]。但不同物種中線粒體的拷貝數(shù)不同，對(duì)于物種的定量具有局限性。與線粒體相比，看家基因?qū)儆趩慰截惢?，有利于量化分析[9]。王珊等[10]建立了一種定量檢測(cè)羊肉制品中羊源性成分與豬源性成分的方法。René等[3]開始探索定量分析食品中的動(dòng)物源性成份的技術(shù)方法，利用單拷貝基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，可以達(dá)到定量的檢測(cè)。宋麗萍等[11]根據(jù)豬的單拷貝基因β-actin和綿羊的單拷貝基因催乳素受體所設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)于豬和羊的定量檢測(cè)取得了滿意的效果。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)提出至今已有20年時(shí)間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展[12]。dPCR構(gòu)想最早于1992年由Sykes等[13]基于樣品稀釋和泊松分布數(shù)據(jù)處理的巢式PCR定量技術(shù)而提出。20世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR( digital PCR，dPCR)的概念[14]。微滴式數(shù)字PCR方法與實(shí)時(shí)熒光PCR方法相比較，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，下限可調(diào)至單拷貝，陽性微滴計(jì)算直接且準(zhǔn)確[15,16]。本方法無需依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因，可直接得出DNA拷貝數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量[17]。因此該技術(shù)廣泛應(yīng)用于物種鑒定[18]、病原檢測(cè)[19]、轉(zhuǎn)基因[20,21]及肉源成分檢測(cè)[22,23]及基因表達(dá)分析[24]等，該方法具有實(shí)用性強(qiáng)的應(yīng)用前景。

本文在前人的基礎(chǔ)上初步探討了羊肉、豬肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的定量分析，采用羊肉和豬肉的精瘦肉作為研究的樣本，以基因組中單拷貝基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物和探針，采用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，建立動(dòng)物源成分中羊肉和豬肉的定量分析，有利于市場(chǎng)的監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮羊肉、牛肉、豬肉、雞肉和鴨肉等肉樣均為精瘦肉，羊肉卷、羊肉片、羊肉串、豬肉松、火腿腸、培根切片、煙熏肘花等羊肉和豬肉制品，均購于石家莊各大超市；引物及探針，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

蛋白酶K(目錄號(hào)：DP304)，天根公司；Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀，美國Bio-Rad公司；ME204/02，電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NanoDrop 2000微量核算蛋白測(cè)定儀，美國Thermo公司；C1000 Touch Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀，美國伯樂公司；Sigma 1-15pk冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

取新鮮的肉樣、市售樣品用組織絞肉機(jī)進(jìn)行絞碎于鼓風(fēng)干燥箱中80 ℃、72 h烘干，用組織破碎機(jī)及液氮進(jìn)行破碎處理研磨成超細(xì)的粉末，此肉樣用作實(shí)驗(yàn)的樣品、摻假模型的建立及實(shí)際檢測(cè)，處理過程中不同肉樣分開處理，防止交叉污染。摻假模型及市售樣品的檢測(cè)稱取質(zhì)量均為100 mg。

1.2.2 DNA的提取

實(shí)驗(yàn)中分別稱取10～100 mg肉樣，所有樣品均加入1000 μL組織細(xì)胞裂解緩沖液和150 μL蛋白酶k，渦旋振蕩，混勻，65 ℃水浴振蕩3 h；之后加入體積各半的苯酚、氯仿，混勻，12000 r/min離心10 min；將上層清液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，加入與上層清液等體積的氯仿，混勻，12000 r/min離心5 min；再將上層清液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，重復(fù)上一步驟；加入兩倍體積的冰乙醇(100%)和十分之一體積的3 M的乙酸鈉，混勻，并在-20 ℃下過夜處理；然后在12000 r/min下離心30 min，去上清，用75%的乙醇洗滌沉淀兩次，12000 r/min離心5 min，去上清，將沉淀物室溫風(fēng)干，重懸于無菌的100 μL ddH2O中，并儲(chǔ)存在-20 ℃。以上所有離心過程均在4 ℃下進(jìn)行。

1.2.3 樣品中羊、豬源性成分的檢測(cè)

羊源性和豬源性成分的引物和探針序列分別參考宋麗萍[11]和René K?ppel[3]合成，具體的引物和探針序列見表1。

1.2.4 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系

ddPCR TM Supermix for Probes（No dUTP）10 μL，上下游引物各1.2 μL（900 nmol/L），探針0.4 μL（250 nmol/L），DNA模板4 μL，用雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。進(jìn)行微滴化處理，之后進(jìn)行普通PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，98 ℃10 min，40個(gè)循環(huán)。最后用微滴分析器對(duì)微滴進(jìn)行分析。

1.2.5 羊肉和豬肉的質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的確定

1.2.5.1 肉樣本質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系

用精密天平準(zhǔn)確稱取10 mg～100 mg的樣品，提取基因組DNA，并用Nanodrop2000進(jìn)行DNA濃度的測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量的肉樣設(shè)置三個(gè)重復(fù)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物和探針列表Table 1 The list of primers and probes used in the experiments

1.2.5.2 肉樣本DNA含量與拷貝數(shù)的關(guān)系

分別對(duì)提取的羊肉和豬肉DNA進(jìn)行9個(gè)和10個(gè)梯度的稀釋，羊肉為5、10、20、30、40、50、60、70、80 ng/μL，豬肉為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 ng/μL，進(jìn)行ddPCR的的檢測(cè)，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)重復(fù)。

1.2.6 已知混合肉樣的檢測(cè)

為驗(yàn)證該方法準(zhǔn)確性，對(duì)已知摻假比例的肉樣進(jìn)行檢測(cè)(羊肉和豬肉的摻假比例為9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9)，總質(zhì)量為100 mg，按1.2.2的方法進(jìn)行DNA的提取，對(duì)提取的DNA稀釋30倍，進(jìn)行ddPCR的檢測(cè)。

1.2.7 對(duì)市售樣品的檢測(cè)

為進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)字PCR在肉類摻假中的實(shí)際應(yīng)用能力，對(duì)在超市購買的預(yù)包裝羊肉串、散裝羊肉串、預(yù)包裝羊肉片、預(yù)包裝羊肉卷、散裝羊肉卷等羊肉制品和培根切片、醬熏肘花、肉灌腸、煙熏火腿、豬肉鋪等豬肉制品進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Excel進(jìn)行圖表編輯

圖1 羊源性和豬源性引物和探針體系的特異性檢測(cè)Fig.1 The specificity detections of mutton and pork primer-probe systems

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)在單拷貝上設(shè)計(jì)引物，為驗(yàn)證引物的特異性，分別用牛、羊、豬、雞和鴨等進(jìn)行特異性檢測(cè)，以無菌雙蒸水作為空白對(duì)照，如圖1所示，結(jié)果顯示羊源性引物和豬源性引物的特異性良好，能用于豬肉摻羊肉的摻假模型的檢測(cè)。

2.2 羊肉和豬肉DNA的提取率

圖2 羊肉質(zhì)量和DNA濃度的關(guān)系Fig.2 Linear relationship between meat quantity and DNA concnetration of mutton

為減少實(shí)驗(yàn)誤差，本實(shí)驗(yàn)采用精瘦肉進(jìn)行摻假模型的制備，對(duì)不同質(zhì)量梯度的肉樣(10～100 mg)進(jìn)行DNA的提取，并用Nanodrop 2000對(duì)提取的DNA的濃度進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量三個(gè)重復(fù)，結(jié)果顯示生肉的質(zhì)量和DNA的濃度呈一定的線性關(guān)系，羊肉和豬肉的相關(guān)性系數(shù)R2均為0.9989。

該實(shí)驗(yàn)表明羊肉和豬肉的生肉質(zhì)量和提取的DNA的濃度均呈明顯的線性關(guān)系。

圖3 豬肉質(zhì)量和DNA濃度的關(guān)系Fig.3 Linear relationship between meat quantity and DNA concentration of pork

2.3 DNA含量和拷貝數(shù)的關(guān)系

圖4 羊肉DNA濃度和DNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.4 Linear relationship between DNA concentration and DNA copy number of mutton

將羊和豬提取的基因組DNA進(jìn)行稀釋，羊的稀釋濃度為5～80 ng/μL，豬的稀釋濃度為20～200 ng/μL，取4 μL稀釋后的DNA進(jìn)行數(shù)字PCR的檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著DNA濃度的增加，DNA的拷貝數(shù)也增加，成一定的線性關(guān)系，羊和豬的相關(guān)性系數(shù)分別為R2=0.9986和0.9984，每個(gè)梯度重復(fù)三次。

2.4 羊肉和豬肉質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系的確定

根據(jù)生肉質(zhì)量和DNA濃度、DNA濃度和DNA拷貝數(shù)呈一定的線性關(guān)系，以DNA濃度為中間換算值，得到生肉質(zhì)量和DNA拷貝數(shù)的計(jì)算公式，羊的計(jì)算公式M羊=0.12C-10.6，豬的計(jì)算公式M豬=0.07C+4，其中，C指每微升的拷貝數(shù)（copies/μL），M指肉樣的質(zhì)量（mg）。

圖5 豬肉DNA濃度和DNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.5 Linear relationship between DNA concentration and DNA copy number of pork

2.5 已知肉樣質(zhì)量的檢測(cè)

為驗(yàn)證建立的ddPCR方法的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)已知摻假比例的肉樣進(jìn)行DNA的提取，對(duì)提取的DNA進(jìn)行30倍的稀釋，取4 μL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)得到的拷貝數(shù)帶入生肉質(zhì)量和拷貝數(shù)的計(jì)算公式中計(jì)算得出生肉的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)表明，測(cè)量值和實(shí)際值相差不大，可以作為實(shí)際市售樣品的檢測(cè)提供依據(jù)。表2即是已知摻假比例的肉樣的檢測(cè)結(jié)果。

2.6 市售樣品的檢測(cè)

通過對(duì)市售樣品的檢測(cè)，驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)ddPCR方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。由于目前市場(chǎng)上肉制品種類眾多，魚龍混雜，單從感官上無法識(shí)別肉制品的真實(shí)性，更無法識(shí)別肉制品是蓄意摻假還是無意識(shí)的污染，本實(shí)驗(yàn)從定量的角度來判別肉制品的摻假問題，彌補(bǔ)了普通PCR和熒光PCR的不足。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)所建立物種羊和豬的肉制品進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)所得市售羊和豬的樣品均存在一定的摻假現(xiàn)象，結(jié)果如表3所示，市售的羊肉制品標(biāo)簽上并未顯示含有其它物種的肉。經(jīng)ddPCR測(cè)定后羊肉的含量最高是56%，最低為43.4%，所測(cè)樣品結(jié)果大概在50%左右。豬肉制品所含的實(shí)際含量就更少了，最高含量在36.69%，最低為5.25%。這表明了現(xiàn)有的市售樣品都存在一定的摻假情況，本實(shí)驗(yàn)從定量的角度區(qū)別了摻假的程度，建立羊肉和豬肉檢測(cè)體系的實(shí)際應(yīng)用能力。

表2 已知摻假比例的模擬混合樣品的ddPCR的定量分析Table 2 Quantitative analysis of ddPCR in simulated mixed samples of known adulteration ratio

表3 市售樣品ddPCR的定量分析Table 3 Quantitative analysis of samplesin local supermarket

3 結(jié)論

現(xiàn)在普通PCR研究肉類摻假已不能滿足要求，定量研究肉源性成分，解決目前市場(chǎng)上對(duì)肉類摻假問題的監(jiān)管和控制，是目前研究的熱點(diǎn)。

3.1 數(shù)字PCR建立了肉類摻假的定量分析，給肉制品市場(chǎng)監(jiān)管提供了有效的方法，該技術(shù)不依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)參基因，而是通過DNA的濃度作為中間換算值，建立生肉質(zhì)量和拷貝數(shù)的關(guān)系，通過拷貝數(shù)直接推算出生肉的質(zhì)量。王珊等[10]主要做了熒光PCR和數(shù)字PCR的方法比較，具有一定的意義，本文針對(duì)數(shù)字PCR對(duì)肉類摻假的檢測(cè)進(jìn)行了更為細(xì)致的研究。數(shù)字PCR對(duì)肉類摻假的檢測(cè)方法比普通和熒光PCR的方法更方便和快捷，用時(shí)短，且能很好的解決在肉類流通過程中是人為因素的摻假還是無意的沾染，提高了工作的效率。

3.2 為驗(yàn)證ddPCR方法的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了已知質(zhì)量的肉類的摻假檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)際值和測(cè)得的理論值相差不大，說明該方法的實(shí)際應(yīng)用能力較強(qiáng)，市場(chǎng)應(yīng)用潛力較大。

3.3 為更加貼合實(shí)際，本實(shí)驗(yàn)還采取了市售樣品的檢測(cè)，由于市售肉及肉制品成分復(fù)雜多樣，肉品種類復(fù)雜，通過建立的ddPCR的方法能特異性的對(duì)羊肉和豬肉進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)某些品牌的羊肉制品未標(biāo)明摻假，但實(shí)際含量卻都在50%左右，均與標(biāo)簽不符；所選的幾項(xiàng)豬肉制品，豬肉含量最高者為36.69%，最低含量為5.25%，實(shí)際豬肉的含量都不到總量的一半。說明現(xiàn)在市場(chǎng)上摻假現(xiàn)象還是嚴(yán)重的。該方法的建立能快速準(zhǔn)確的對(duì)市場(chǎng)上用廉價(jià)肉代替高價(jià)肉的現(xiàn)象進(jìn)行檢測(cè)。綜上所述，數(shù)字PCR快速、便捷具有一定的抗干擾能力，滿足了絕對(duì)定量的要求。目前市場(chǎng)肉制品的混亂，宗教和民族信仰的問題，數(shù)字PCR方法的建立為市場(chǎng)監(jiān)管，打擊不法商販，維護(hù)民族宗教信仰等問題上開辟了一條新的途徑，維護(hù)了消費(fèi)者的權(quán)益。

[1] 李家鵬,喬曉玲,田寒友,等.食品和飼料中動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2011,32(9):340 -347

LI Jia-peng, QIAO Xiao-ling, TIAN Han-you, et al.Advances in the detection of animal derived components in food and feed [J]. Food Science, 2011, 32(9): 340 -347

[2] 趙新,王勇,蘭青闊,等.熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分[J].食品工業(yè)科技,2015,36(1):299-302

ZHAO Xin, WANG Yong, LAN Qing-kuo, et al.Identification of sheep derived components in meat products by fluorescent quantitative PCR [J]. Science and Technology of Food Industry, 2015, 36(1): 299-302

[3] Koppel R, Jurg R, Jurg R. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, horse and sheep [J]. European Food Research and Technology,2011, 232(6): 151-155

[4] Pray-grant M G, Daniel J A, Schieltz D, et al. Chd1 chromodomain links histone H3 methylation with SAGA-and SLIK-dependent acetylation [J]. Nature, 2005, 433(7024):434-438

[5] Guo J, Guo A. Crossmodal interactions between olfactory and visual learning in Drosophila [J]. Science, 2005,309(5732): 307-310

[6] Elias M, Hill R I, Willmott K R, et al. Limited performance of DNA barcoding in a diverse community of tropical butterflies [J]. Proc. Biol. Sci., 2007, 274(1627): 2881-2889

[7] Vences M, Thomas M, Bonett R M, et al. Deciphering amphibian diversity through DNA barcoding: chances and challenges [J]. Philos. Trans. R Soc. Lond B. Biol. Sci., 2005,360(1462): 1859-1868

[8] Armstrong K F, Ball S L. DNA barcodes for biosecurity:invasive species identification [J]. Philos. Trans. R Soc. Lond.B Biol. Sci., 2005, 360(1462): 1813-1823

[9] Rodriguez M A, Garcia T, Gonzalez L, et al. TaqMan real-time PCR for the detection and quantitation of pork in meat mixtures [J]. Meat Sci., 2005, 70(1): 113-120

[10] 王珊,李志娟,苗麗.微滴式數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)羊肉制品中羊源和豬源性成分方法的比較[J].肉類工業(yè),2015,7:38-41

WANG Shan, LI Zhi-juan, MIAO Li. Comparison of microsphere digital PCR and real-time fluorescence PCR for detection mutton-derived and porcine-derived ingredients in mutton products [J]. Meat Industry, 2015, 7: 38-41

[11] 宋麗萍,薛晨玉,路勇,等.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)定量檢測(cè)羊肉中的豬肉成分[J].食品科技,2014,39(10):319-322

SONG Li-ping, XUE Chen-yu, LU Yong, et al. Detection and quantification pork in sheep products using real-time PCR [J].Food Science and Technology, 2014, 39(10): 319-322

[12] 黃留玉.PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用(第二版)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011

HUANG Liu-yu. The new pcr technology, principle and application, 2nd ed [M]. Beijing: Chemical Industry Press,2011

[13] Sykes P J, Neoh S H, Brisco M J, et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution [J]. Biotechniques, 1992,13(3): 444-449

[14] Vogelstein B, Kinzler K W. Digital PCR [J] Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1999, 96: 9236-9241

[15] Hindson C M, Chevillet J R, Briggs H A, et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR [J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 1003-1005

[16] Sanders R, Huggett J F, Bushell C A, et al. Evaluation of digital PCR for absolute DNA quantification [J]. Analytical Chemistry,2011, 83(17): 6474-6484

[17] Sanders R, Huggett J F, Bushell C A, et al. Evaluation of digital PCR for absolute DNA quantification [J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(17): 6474-6484

[18] 胡偉,陳榮華,張晨,等.微滴式數(shù)字PCR技術(shù)用于生物樣品種屬鑒定和絕對(duì)定量[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(5):342-345

HU Wei, CHEN Rong-hua, ZHANG Chen, et al. Species identification and absolute quantification of biological samples by droplet digital PCR [J]. Journal of Forensic Medicine, 2014, 30(5): 342-345

[19] 董蓮華,張玲,姜君,等.大腸桿菌O157:H7微滴數(shù)字PCR定量方法的建立[J].分析化學(xué),2015,43(3):319-324

DONG Lian-hua, ZHANG Ling, JIANG Jun, et al.Development of droplet digital polymerase chain reaction for quantifying Escherichia Coli O157:H7 [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(3): 319-324

[20] Morisset D, Stebih D, Milavec M, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR [J]. PLoS One, 2013, 8(5): 1-9

[21] 姜羽,胡佳瑩,楊立桃.利用微滴數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014, 22(10):1298-1305

JIANG Yu, HU Jia-ying, YANG Li-tao. Estimating the exogenous genes copy number of genetically modified organisms by droplet digital PCR [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2014, 22(10): 1298-1305

[22] CAI Yi-cun, LI Xiang, Lü Rong, et al. Quantitative analysis of pork and chicken products by droplet digital PCR [J]. Bio.Med. Research International, 2014, 8: 1-6

[23] 朱鵬宇.利用微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)食品或飼料樣品[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2013,12:1-6

ZHU Peng-yu. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2013, 12: 1-6

[24] Brunetto G S, Massoud R, Leibovitch E C, et al. Digital droplet PCR(ddPCR)for the precise quantification of human T-lymphotropic virus 1 proviral loads in peripheral blood and cerebrospinal fluid of HAM/TSP patients and identification of viralmutations [J]. Journal of Neurovirology, 2014, 20(4):341-351