食品中羧甲基賴氨酸的形成機理和抑制途徑研究進展

韓文鳳，譚興和，林曉麗，邱潑，孟宏昌，賈娟

(1.湖南農業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙 410128)（2.漯河職業(yè)技術學院食品工程系，河南漯河 462000）（3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）（4.浙江麥吉士食品有限公司，浙江杭州 310000)

食品中的還原糖與蛋白質、氨基酸等可以通過美拉德反應產(chǎn)生一組性質穩(wěn)定的產(chǎn)物，被稱為晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products)，簡稱AGEs[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AGEs物質有20多種，代表性化合物包括CML、羧乙基賴氨酸(Nε-carboxyethyllysine，CEL)、吡咯素(pyrraline)、戊糖苷素(pentosidine)、咪唑賴氨酸(imidazolysine)和交聯(lián)素(crosslines)等。AGEs化合物中，CML是第一個從食品(超高溫瞬時滅菌乳)中分離鑒定出來的，同時也是存在于食品中的最為主要的一種AGEs[2]。與其它AGEs相比，CML具有較高的酸穩(wěn)定性，可以作為評價食品體系美拉德反應中蛋白質化學修飾、羰基應激和脂質氧化的一個重要指標。CML通過食品介質進入人體后，可積聚于多個不同的組織器官中，達到一定數(shù)量后，會直接影響組織器官的功能，導致機體的病理變化。CML與許多疾病的發(fā)生密切相關，能促進糖尿病、克雅二氏病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展和人體器官的快速衰老[3～5]。在食品生產(chǎn)加工過程中CML形成的途徑十分復雜，可能受多種因素的影響。蛋白質、還原糖、脂質和抗壞血酸等均可作為形成CML的底物；涉及的主要反應包括氨基酸的糖基化反應和還原糖、油脂以及抗壞血酸的氧化降解反應，CML會通過一個或多個反應同時形成；食品熱加工處理方式和加熱時間、加熱溫度、水分含量和pH值等加工工藝條件也會影響CML的形成。

為了避免或降低食品中CML對人類的危害，近年來相關研究人員一直致力于研究降低食品中CML含量的措施?？刂剖称分蠧ML的含量以及尋找安全、高效、天然的CML抑制劑，是國內外研究的一個重點方向。本文就CML形成機理和抑制途徑等方面的研究進展進行綜述，以期為尋找有應用前景的CML抑制劑提供理論依據(jù)。

1 食品中CML形成機理

1.1 食品中CML的形成途徑

早期有關美拉德反應的研究主要集中在該反應對食品風味和外觀的改善上，近年對其營養(yǎng)作用和毒副作用的研究日漸加強。食品中CML形成的途徑與美拉德反應密切相關，相關資料證實蛋白質和碳水化合物主要是賴氨酸和還原糖是美拉德反應中形成CML的主要底物。Fu等[6]人研究證實油脂中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)通過氧化反應也可以形成CML。Dunn[7]等人的研究結果證實抗壞血酸也是形成CML的重要底物。Ferreira等[8,9]人研究證實果糖賴氨酸(Fructoselysine，F(xiàn)L)和乙二醛(Glyoxal，GO)是形成CML的關鍵中間產(chǎn)物。這些中間產(chǎn)物主要來自5個方面[6,10]：(1)還原糖的自動氧化；(2)還原糖和賴氨酸的阿姆德瑞(Amadori)重排；(3)還原糖和賴氨酸的反應產(chǎn)物席夫堿(SchiffBase)降解；(4)油脂中PUFA的自動氧化；(5)抗壞血酸的自動氧化。

為揭示CML的形成機理，在總結國內外相關研究成果的基礎上得知食品中CML的形成途徑主要有5個方面（如圖1所示）：

圖1 食品中CML形成的重要途徑Fig.1 Important formation pathway of CML in food

（1）Wolf途徑：還原糖在有氧條件下，發(fā)生自動氧化降解反應形成二羰基化合物GO，GO作為形成CML的中間產(chǎn)物與賴氨酸殘基反應生成CML[11,12]；（2）Hodge途徑：美拉德反應第一階段的產(chǎn)物SchiffBase堿經(jīng)過Amadori重排反應生成FL，其通過氧化降解生成CML[13,14]。（3）Namiki途徑：美拉德反應第一階段的產(chǎn)物SchiffBase發(fā)生氧化降解反應生成二羰基化合物GO，GO與賴氨酸殘基發(fā)生反應形成CML[15,16]；（4）Fu途徑：油脂中的PUFA發(fā)生氧化降解，生成中間產(chǎn)物GO，GO與賴氨酸殘基反應生成CML[6]；（5）Dunn途徑：抗壞血酸在適宜的條件下發(fā)生自動氧化降解反應形成氧化降解中間產(chǎn)物，然后與賴氨酸殘基發(fā)生反應形成CML[7]。

可以看出，參與CML形成的主要底物包括還原糖、氨基酸、油脂和抗壞血酸等，涉及的主要反應是氨基酸的糖基化反應和還原糖、油脂以及抗壞血酸的氧化降解反應。在食品生產(chǎn)加工過程中形成的CML途徑可能受多種因素的影響，CML會通過一條或多條途徑同時形成。

1.2 影響食品中CML形成的因素

大量研究結果證實了影響食品中CML形成的因素主要包括反應底物種類及含量；熱加工處理方式和加熱時間、加熱溫度、水分含量、pH值等加工工藝條件。

1.2.1 反應底物蛋白質種類和含量的影響

作為形成CML的主要底物，蛋白質的種類和含量對食品熱處理過程中CML的形成具有重要的影響。Bosch等人發(fā)現(xiàn)不同種類的蛋白質產(chǎn)生的CML含量差別很大，嬰兒奶粉、大豆飲料、煮雞蛋、法式薄餅中的CML含量跨度為62～440 mg/100 g蛋白質；并證實了不同蛋白質形成CML量的高低順序為：牛血清白蛋白>大豆蛋白>酪蛋白>谷蛋白[17]。蛋白質的中賴氨酸是形成CML的重要底物，CML的生成量取決于蛋白質含有的賴氨酸殘基數(shù)量。其它氨基酸(如：丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸)作為底物時，產(chǎn)生的CML數(shù)量非常小。Lima等人從賴氨酸損失的角度研究酪蛋白-脂肪酸，酪蛋白-葡萄糖模擬反應體系中CML的產(chǎn)生規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在95 ℃的水浴條件下，酪蛋白-葡萄糖模擬反應體系生成的CML遠高于酪蛋白-脂肪酸生成的CML[18]。由Lima等人的結論可以看出，食品中CML的形成主要來源是蛋白質的糖基化反應。不同品種的原料主要因為其蛋白質中氨基酸種類的不同使食品中CML生成量存在差異；同一品種的原料也因氣候條件、耕種施肥、采收時間、貯藏溫度和時間的不同而使CML生成量存在差異。主要原因是外部條件影響了原料蛋白質中氨基酸的種類和含量及含水量、pH值等指標，從而影響食品中CML的生成量。

1.2.2 反應底物油脂的影響

Fu等人研究發(fā)現(xiàn)油脂中的PUFA通過氧化降解反應生成二羰基化合物GO，然后與蛋白質中的賴氨酸反應可以生成CML[6]。在美拉德反應系統(tǒng)中脂質的存在可以使體系產(chǎn)生堿性的環(huán)境，促進中間產(chǎn)物FL和GO生成CML[19]。數(shù)據(jù)表明高脂肪類食品中CML的含量高于肉制品和碳水化合物類食品，而且油脂和蛋白質反應也能夠生成CML[10,20]。Han等[21]人研究發(fā)現(xiàn)，植物油脂（大豆油、菜籽油、玉米油、棕櫚油和橄欖油）和動物油脂（乳脂）都可以與賴氨酸反應生成CML，且牛奶中的CML含量隨乳脂含量增加而增加。Lima等人建立的酪蛋白-脂肪酸模擬反應體系在95 ℃水浴條件下，產(chǎn)生CML量的高低順序為：花生四烯酸>亞麻酸>亞油酸>油酸[32]。周燕瓊研究了四種脂肪酸-賴氨酸模擬反應體系中產(chǎn)生CML的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同脂肪酸生成CML量的高低順序為：亞油酸>油酸>棕櫚酸>硬脂酸[22]。由此推斷，CML生成量與脂肪酸的飽和程度和碳鏈的長度均有關。脂肪酸的不飽和水平越高，形成CML的能力越強；飽和程度相同時，碳鏈越短產(chǎn)生CML的能力越強。

1.2.3 反應底物還原糖的影響

碳水化合物中的還原糖，由于其具有易發(fā)生烯醇式轉變的還原基團和開鏈式結構，成為生成CML的重要底物[23]。研究數(shù)據(jù)表明，還原糖均能與賴氨酸反應生成CML。Ruttkat等人采用烘烤加熱方式建立了四種不同的還原糖(葡萄糖、半乳糖、山梨糖、果糖)與賴氨酸生成CML的模擬反應體系，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，四種還原糖的模擬反應體系均能生成CML，形成CML數(shù)量的高低順序為：半乳糖>葡萄糖>山梨糖>果糖[14]。Li等人建立了三種糖（葡萄糖、蔗糖和乳糖）與賴氨酸生成CML的模擬反應體系，發(fā)現(xiàn)蔗糖也能與賴氨酸反應生成CML，形成CML量的高低順序為：乳糖>葡萄糖>蔗糖[24]。Lüdemann[25]等人認為，乳糖與賴氨酸反應產(chǎn)生CML的效率高于葡萄糖。Courel等人對餅干體系研究發(fā)現(xiàn)，在焙烤模式下葡萄糖產(chǎn)生CML的效率高于蔗糖，并且不受溫度高低的影響[26]。乳糖是由葡萄糖和半乳糖脫水縮合而成的雙糖，蔗糖是由葡萄糖和果糖脫水縮合而成的雙糖，上述研究成果結合分子結構分析，結論是一致的。但是Sakai[27]等人指出，果糖比葡萄糖具有更強的糖基化能力；Hinton等人的研究也表明，果糖-牛血清白蛋白體系產(chǎn)生的CML含量是葡萄糖-牛血清白蛋白體系的17倍[28]。有關果糖和葡萄糖生成CML的研究結果不盡相同，還有待進一步深入研究。

1.2.4 熱處理方式的影響

食品在食用前進行熱加工處理是獲得營養(yǎng)性和安全性的一個必要條件。熱處理的方式對食品中CML的形成具有非常重要的影響，蒸、煮、油炸、焙烤和微波加熱均能促進CML的形成。Chen等人研究了幾種肉類食品在不同加工方式下CML含量的變化，發(fā)現(xiàn)高溫焙烤和油炸條件下CML含量較高，經(jīng)高溫焙烤后的牛肉中CML含量可達21.80 μg/g[29]。付全意[23]對葡萄糖-賴氨酸模擬體系的研究表明，在95 ℃溫度下反應20 min，采用微波加熱生成的CML分別是水浴加熱和干法加熱的5.65倍和6.94倍。微波加熱能使體系溫度迅速上升，具有不穩(wěn)定結構的a-D-葡萄糖的比例增加，大量的還原糖氧化降解生成GO，或者與賴氨酸形成Schiff Base等中間產(chǎn)物，加快美拉德反應的程度，從而促進食品模擬體系中CML的產(chǎn)生[30]。

1.2.5 加工工藝條件的影響

食品原料含水量、加熱溫度、加熱時間和pH值等加工工藝參數(shù)均能影響食品中CML的形成。食品原料中含水量在10%～15%最易發(fā)生美拉德反應，也最易生成CML，隨著含水量的增加，生成CML的效率反而降低。水分活度對CML也有一定的影響，新鮮的水果、蔬菜等可能因為水分充足，且含有大量的天然抗氧化劑而抑制了CML的生成[31]。

Lima在果糖-賴氨酸模擬反應體系中發(fā)現(xiàn)，當溫度在70～110 ℃范圍內上升時，CML的含量呈線性增加[18]。周燕瓊證明了在脂肪酸-賴氨酸模擬反應體系中，180 ℃加熱26 min，可使體系中CML的生成量達到最大值為53.9 μmol/L[22]。劉春霞對果糖-賴氨酸模擬反應體系研究發(fā)現(xiàn)，20 ℃時CML的含量僅0.03μg/mL，120 ℃時可達到14.36 μg/mL，約為20 ℃含量的479倍[32]。付全意對三種糖與賴氨酸生成CML的模擬反應體系研究發(fā)現(xiàn)在100～180 ℃范圍內，體系中CML含量隨著溫度的升高而升高，當溫度超過180 ℃，CML的分解速率開始高于其形成速率，在溫度達到220 ℃時，CML的分解率基本達到100%[23]?？梢姡谝欢ǖ臏囟确秶鷥?，溫度與CML的生成量呈正相關，超出特定溫度，反而能抑制CML的形成。

食品加工過程熱處理時間的長短對于CML形成有重要影響。劉春霞研究發(fā)現(xiàn)，對果糖-賴氨酸模擬反應體系于100 ℃下進行熱處理，時間從20 min到120 min延長的過程中，CML的生成量先顯著增加后基本不變；60 min時達到最大值為4.94 μg/mL，是20 min時的3.88倍[32]。付全意對微波加熱的葡萄糖-賴氨酸模擬反應體系研究發(fā)現(xiàn)，體系在220 ℃反應60 min的過程中，CML含量在10 min內達到最大值5.02 mol/L，在反應60 min時CML含量降到最低值0.12 mo1/L[37]；可見，反應時間延長并不一定能夠產(chǎn)生更多的CML。反應時間延長，會產(chǎn)生CML-賴氨酸的交聯(lián)物質[33,34]；并且CML可能會轉化為含氮的類黑精大分子物質，結果導致CML的含量反而降低。

pH值是影響生成CML的重要因素。相對于酸性條件而言，堿性條件下更容易生成CML。Ajandouz等[35]人發(fā)現(xiàn)，在果糖-賴氨酸模擬反應體系中，pH值由4.0～12.0過程中，美拉德反應產(chǎn)物隨pH值上升而增加。劉春霞對果糖-賴氨酸模擬反應體系研究發(fā)現(xiàn)，在pH 4.0～8.0范圍內，CML含量隨pH值上升而增加，pH 8.0時，CML的含量為4.28 μg/mL，較pH 4.0時增加77%[32]。

2 食品中CML的抑制途徑

為了避免或降低食品中CML對人類的危害，近年來相關研究人員一直致力于研究降低食品中CML含量的措施。這些措施的主要原理為通過改變反應條件、降低反應底物或添加外源物質等來減緩底物的反應速率、抑制某些關鍵中間產(chǎn)物的形成或轉化。綜合考慮食品體系中CML形成的途徑以及影響其生成的因素，降低食品中CML含量的措施主要有以下三個方面：一是食品原料中CML底物含量的控制；二是加工工藝條件和方法的優(yōu)化；三是外源性食品添加劑的使用。

2.1 食品原料中CML底物含量的控制

通過控制食品原料中CML的底物賴氨酸、還原糖和脂質等成分的含量，可以有效抑制產(chǎn)品中CML生成量。Loa?c等[36]人研究發(fā)現(xiàn)氮肥的施用量在0～30 kg/ha范圍內增加時，菊苣根中的賴氨酸的含量增加顯著；收獲時間晚3個月菊苣根中的賴氨酸含量可以增加22.56%。從食品原料田間管理的角度考慮，通過合理施用氮肥，調整收獲時間能控制農作物中賴氨酸的含量，有效防止后期加工過程中高水平CML的產(chǎn)生。Chuda[37]等人把馬鈴薯分別置于20 ℃ 2周，2 ℃ 2周和2 ℃ 1年條件下貯藏，測得果糖的含量分別為0.09、3.56和6.58 mg/g。可見，原料的還原糖的含量會與溫度呈負相關，與時間呈正相關；即使在較低溫度下，糖基化反應也會緩慢地發(fā)生，因此長期儲存的食物也會積累大量的CML。從原料貯藏的角度考慮，合理設定原料貯藏溫度，抑制淀粉轉化為還原糖，可以有效抑制CML的形成。Grob等[38]人發(fā)現(xiàn)馬鈴薯經(jīng)削皮和切片后，于水中浸泡15 min，可以清除表面的氨基酸和還原糖。Srey等[39]人研究發(fā)現(xiàn)選擇糖化反應活性低的原料有助于降低蛋糕中CML的含量。

因此，通過選用底物含量低的原料，避免過低的貯藏溫度和過長的貯藏時間，加工前采用浸漬預處理等方法可以有效地控制食品中CML的含量。

2.2 加工工藝條件和方法的優(yōu)化

通過優(yōu)化食品加工工藝條件(水分含量、加熱溫度、加熱時間等)可以達到抑制CML的效果。相同的食品原料經(jīng)低溫高濕處理(如蒸、煮和燉)產(chǎn)生的CML含量較高溫低濕處理(烘焙、油炸和燒烤)要低很多[40,41]。Goldberg等[20,41]人研究發(fā)現(xiàn)烤鱈魚中CML含量是水煮鱈魚的6倍。雖然CML的含量與加熱時間有一定的相關性，但是反應時間延長并不一定能生成更多的CML。因此選擇合理的加熱溫度和濕度，避免長時間加熱，可以有效地抑制CML的形成。

2.3 外源性食品添加劑的使用

2.3.1 酸度調節(jié)劑的使用

研究表明，通過添加檸檬酸等酸度調節(jié)劑來適當調控食品體系的pH值，可以抑制CML的形成。Uribarri等[40]人研究發(fā)現(xiàn)，牛肉用醋或檸檬汁腌制1 h后再進行熱加工處理，生成的CML含量較未腌制的牛肉中要低50%。堿性條件下，賴氨酸會發(fā)生脫質子化反應變成具有更高反應活性的自由基，易于CML的生成[42]；而酸性條件下，不利于賴氨酸變成具有較強反應活性的自由基[43]；CML則不易生成。

2.3.2 反應底物競爭劑的使用

丁斌鷹[44]的研究表明，在棉酚和干酪素的美拉德反應體系中添加尿素能夠有效地保護干酪素中賴氨酸。棉酚是一種含有羰基的多酚醛，干酪素是動乳汁中的含磷蛋白質，尿素分子能夠提供兩個氨基與棉酚的羰基生成SchiffBase，可以競爭性地抑制棉酚與干酪素發(fā)生美拉德褐變反應，有效地阻止干酪素中賴氨酸含量的損失，同時降低CML的生成量。

Srey[39]等人研究發(fā)現(xiàn)維生素B1是一種賴氨酸ε-基團的競爭劑，對模擬反應體系中CML生成有較好的抑制效果。維生素B1中的氨基與賴氨酸殘基競爭還原糖的羰基，導致賴氨酸殘基與還原糖的羰基發(fā)生反應的機率降低，從而抑制了美拉德反應模擬體系中部分CML的生成。

2.3.3 抗氧化劑的使用

2.3.3.1 化學合成抗氧化劑的使用

化學合成抗氧化劑中，硼氫化鈉(NaBH4)是最常用的CML抑制劑。NaBH4分子中的4個H原子呈-1價，具有很強的選擇還原性，能夠將酮類、醛類和酰氯類等羰基化合物中的羰基選擇還原成羥基。NaBH4能夠通過還原CML的中間產(chǎn)物GO和FL來抑制CML的形成。

付全意對葡萄糖-賴氨酸模擬反應體系的研究發(fā)現(xiàn)，NaBH4對羰基化合物具有很強的還原能力，不僅能夠還原CML的中間產(chǎn)物GO，而且還可以將形成CML的主要中間產(chǎn)物FL還原，終止其氧化裂解生成CML，從而抑制CML的形成[23]。Hartkopf等[45]人研究發(fā)現(xiàn)，食品經(jīng)NaBH4還原處理后CML的含量僅為未處理的8～55%。在檢測模擬反應體系以及食品體系中CML的含量時，通常將樣品經(jīng)過NaBH4還原處理，防止CML的中間產(chǎn)物在水解過程中轉化為CML，導致測得的CML含量結果偏高。

2.3.3.2 天然抗氧化劑的使用

抗氧化劑對CML的抑制作用是目前研究的熱點，現(xiàn)有資料表明部分天然抗氧化劑能夠有效抑制食品體系中CML的形成。Rice-Evans等[46]人研究發(fā)現(xiàn)黃酮類和多酚類化合物可以通過抑制葡萄糖的自氧化反應和清除自由基等方式來抑制食品體系中CML的形成。付全意[23]通過引入多級動力學研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質蘆丁對葡萄糖向GO和FL的轉化，以及GO和FL生成CML均具有抑制作用。Zhang等[47]人研究發(fā)現(xiàn)多酚類化合物可通過結合CML的中間產(chǎn)物GO及清除自由基的方式對葡萄糖-酪蛋白模擬反應體系中CML的形成發(fā)揮抑制作用。Srey等[39]人研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以通過清除反應體系自由基的方式對CML的形成進行抑制。葡萄籽提取物富含的原花青素和兒茶素具有很強抗氧化性可以清除食品體系中CML生成的中間產(chǎn)物GO，數(shù)據(jù)顯示面包中葡萄籽提取物添加量為1000 mg/kg時CML的抑制率可超過50%[48]。Peng[49]等人研究發(fā)現(xiàn)由肉桂皮提取得到的原花青素B2和表兒茶素能夠有效抑制CML生成，特別是原花青素B2還可以捕獲CML形成過程中的中間產(chǎn)物GO。Ahmad[50]等人研究發(fā)現(xiàn)陳年大蒜提取物中的烯丙基半胱氨酸也可以通過與Amadori重排產(chǎn)物反應抑制CML的形成。

3 結論

CML在體內的積聚與糖尿病、心血管疾病、腎病、克雅二氏病和衰老等老年性疾病密切相關。CML形成途徑十分復雜，蛋白質、還原糖、脂質和抗壞血酸等均可作為形成CML的底物。通過控制食品原料中CML的底物賴氨酸、還原糖和脂質等成分的含量；優(yōu)化食品加工工藝條件(水分含量、加熱溫度、加熱時間等)；使用外源性食品添加劑等途徑可以有效降低食品中CML含量。天然抗氧化劑尤其是黃酮類和多酚類化合物對CML有較好的抑制作用，但是抑制作用發(fā)生的機理還有待進一步深入有研究。

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